Methoden voor de bepaling van de prijs van glucose en vetzuuroxidatie in het geïsoleerde hart Working Rat

Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdige real-time metingen te verkrijgen van de myocardiale glucoseoxidatie- en vetzuuroxidatiesnelheden, evenals de contractiele functie van het hart in een geïsoleerd werkend rattenhart. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het cardiovasculaire veld, zoals hoe het hart zich metabolisch aanpast aan acute veranderingen in de energiebehoefte en hoe deze responsen worden beïnvloed bij pathologische aandoeningen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de onderzoeker volledige controle geeft over de omgevingsvariabelen, zoals de aard en de concentraties van substraten, geneesmiddelen of hormonen die aan het hart worden toegediend. De presentator is Bhavisha Bakrania, een postdoctoraal onderzoeker van het Cardiovascular Reno Resource Center aan het University of Mississippi Medical Center. Begin met het starten van de pomp om het perfusieapparaat te primen en de buffer te oxygeneren.

Nadat de materialen zijn voorbereid, wordt een rat geanestheseerd en klaargemaakt voor de operatie. Scheer het haar van de buik weg en maak een midline incisie met een laterale uitbreiding. Verschuif de maag en darmen om toegang te krijgen tot de vena cava inferior en injecteer 200 USP units Heparine.

Wacht vijf tot 10 seconden en knip vervolgens met een schaar het diafragma en de zijkanten van de ribbenkast door om de inhoud van de borstholte bloot te leggen. Pak daarna voorzichtig het hart vast met de hand en exciseer zowel het hart als de longen samen. Knip op het niveau van de aorta descendens, waarbij u er goed op let dat de aortaboog en de aorta ascendens tijdens dit proces niet beschadigd raken.

Verplaats het hart en de longen onmiddellijk naar een dissectieschaal gevuld met ijskoud KH-buffer. Zodra het hart stopt met kloppen, is het belangrijk om snel te werken zodat het binnen een minuut of twee opnieuw kan worden gestart. Dompel het hart en de longen nu onder in een nieuwe schaal met ijskoud KH-buffer.

Trim snel alle grote stukken longweefsel weg en snijd vervolgens de aorta descendens vlak boven de aortaboog door. Neem voor de volgende stappen de nodige voorzorgsmaatregelen voor het gebruik van radioactieve stoffen. Open daarna met een pincet voorzichtig de aorta en schuif het hart omhoog op de canule.

Wees zeer voorzichtig dat u met de canule niet voorbij de aortaweg gaat, aangezien dit kan leiden tot hypoperfusie van het hart en beschadiging van de aortakleppen. Zet nu de verbinding vast met een microclip en start de Lagendorff-perfusie van het hart. Zet vervolgens, zonder te haasten, de aorta met een 3 0 zijden hechtdraad vast aan de aortacanule en verwijder de microclip.

Lokaliseer vervolgens de longader en trim indien nodig niet-cardiale weefsels weg. Laat voldoende weefsel over om het linker atrium aan de canule te verankeren. De canulatie van het linker atrium is de op één na meest kritische stap van het protocol, aangezien een onjuiste plaatsing van de canule of de aanwezigheid van een lek de contracties zal verzwakken en de kwantificering van de metabole snelheden zal compromitteren.

Bereid vervolgens de canule voor de linkerboezemlijn voor, op dezelfde wijze als voor de rechtercanule. Pak daarna met een pincet voorzichtig de opening van de longader vast en schuif het hart over de atriale canule. Verplaats de weefsels naar behoefte zonder de aorta te buigen of het hart overmatig te belasten.

Zet de canule vervolgens vast met een 3 0 zijden hechtdraad. Open tot slot de atriale lijn terwijl u gelijktijdig de aortale lijn naar de werkmodus schakelt. Als er buffer uit het linkeratrium lekt, sluit dan de atriale lijn en schakel terug naar de Lagendorff-modus.

Gebruik vervolgens meer hechtingen om de canule beter te fixeren en probeer opnieuw over te schakelen naar de werkmodus. Als het experiment een directe meting van de LV-functie met een katheter omvat, begin dan met het ponceren van de LV-apex met een naald van 26 gauge, breng een druk-volumekatheter in en richt de schacht uit met de longitudinale as van de LV. Positioneer vervolgens de distale elektrode E1 net onder de aortaklep, grenzend aan de endocardiale rand, en positioneer de proximale elektrode E4 net binnen de ventriculaire wand.

Sluit het hart nu af in een kamer met watermantel. Begin vervolgens met het monitoren van de functionele parameters in de software. Zodra de basisparameters gedurende ten minste vijf minuten stabiel zijn gebleven, kan de gegevensregistratie worden gestart.

Om de coronaire doorbloeding te meten, wordt de tijd genoteerd die nodig is om 20 milliliters effluent op te vangen. Neem vervolgens twee milliliters van het effluent met een spuit via de driewegkraan op en gooi de rest weg. Draagt de monstername van twee milliliters onmiddellijk over naar een microcentrifugebuis en neem een aliquot van een halve milliliter om de snelheid van glucoseoxidatie te bepalen.

Bewaar de rest op ijs. Ga door met het periodiek afnemen van monsters van het coronaire effluent en injecteer, vlak voor het afronden, 10 micro liters hypertonische zoutoplossing in de atriale lijn, net voordat deze aan de canule bevestigd wordt.

Gebruik de respons op deze bolus om de parallelle geleiding te berekenen voor een nauwkeurige bepaling van het hartvolume. Open vervolgens de hartkamer en verwijder de katheter in de LV. Snijd daarna het hart van de canules af en plaats het in ijskoude KH-buffer. Droog het hart nu snel af met een papieren handdoek en bepaal het natte gewicht.

Nadat het gewogen is, kunnen de vereiste weefselmonsters worden gedissecteerd; vries vervolgens het resterende weefsel in met een tang die is gekoeld op droogijs. Ter voorbereiding vult u glazen scintillatieflacons met één milliliter 10x hyaminehydroxide. Bereid er één voor elk monster van coronaire effluentie en twee voor de controles.

Zodra een monsterbuisje is geladen, plaatst u dit direct in een gevulde scintillatiebuis. Sluit het buisje voor de analyse voorzichtig af met een rubberen hulsstop en gebruik parafilm om het buisje te verzegelen. Injecteer nu, met behulp van een spuit van 1 ml met een lange 23 gauge naald, 200 µL 60% perchloorzuur door de rubberen huls.

Laat alle monsterflesjes een nacht staan. Haal de volgende dag elk monsterbuisje voorzichtig met een pincet uit de flesjes en spoel de onderkant van de buisjes boven de open flesjes af met 1 mL scintillatiecocktail om alle hyaminehydroxide op te vangen. Voeg vervolgens nog eens 9 mL scintillatiecocktail toe aan elk flesje.

Om de specifieke activiteit te bepalen, voegt u 0,5 milliliters profusiebuffer toe aan twee van de vials. Schud de vials vervolgens krachtig en laat de vials ten minste zes uur rusten voordat u met de metingen begint. Om de myocardiale oleaatoxidatiesnelheden te bepalen, bereidt u eerst een anionenuitwisselingsharskolom voor voor elk monster.

Vul de uiteinden van drie milliliter spuitbuizen met glaswol. Voeg vervolgens met een transferpipet de hars-watersuspensie toe tot het tweemilliliterstreepje in elke kolom. Was daarna de hars door drie keer twee milliliter ultrapuur water door elke kolom te leiden.

Plaats vervolgens scintillatiebuisjes onder de kolommen en belaad de kolommen met een halve milliliter coronaire effluent. Gebruik voor de achtergrondmeting in plaats daarvan perfusiebuffer. Elueer de kolommen nu opeenvolgend met een halve milliliter, één milliliter en tot slot twee milliliter ultrapuur water.

Gooi de kolommen weg. Voeg vervolgens 13 milliliters scintillatiecocktail toe aan de vials. Voeg 0,5 milliliters perfusiebuffer direct toe aan twee vials die zijn gevuld met 13 milliliters vloeibare scintillatiecocktail voor bepaling van de specifieke activiteit.

Schud de vials krachtig, laat ze zes uur of langer rusten en voer vervolgens de metingen uit. Harten werden geïsoleerd van twee ratten van 16 weken oud en blootgesteld aan verschillende stresscondities. Voor één hart werd een acute toename van de werklast gesimuleerd door de afterload met 40% te verhogen en epinephrine toe te voegen aan de perfusiebuffer.

De hartslag nam direct met meer dan 50% toe bij de inductie van de werksprong. Het hartvermogen nam met meer dan 40% toe bij de werksprong, wat gepaard ging met een toename in de oxidatiesnelheden van zowel glucose als oleaat. De relatieve toename van de glucoseoxidatie ten opzichte van de basislijn was opvallend.

Het andere hart werd onderworpen aan 15 minuten globale ischemie en 30 minuten reperfusie. Onder deze experimentele omstandigheden werd na enkele minuten reperfusie een bijna normale polsdruk hersteld. Binnen 10 minuten nam het cardiac power snel toe tot boven de pre-ischemische waarden, alvorens terug te keren naar waarden die dicht bij de basislijn lagen.

Dit was het gevolg van verhoogde oleaatoxidatie. Terwijl de glucoseoxidatie snel terugkeerde naar het pre-ischemische activiteitsniveau. Zodra de techniek onder de knie is, kan de isolatie van het hart tot de initiële reperfusie in de werkmodus in minder dan vijf minuten worden voltooid indien dit correct wordt uitgevoerd.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals analyses van RNA- en eiwitexpressie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het effect van een geneesmiddel of een stressconditie op moleculaire signaleringspaden. Vergeet niet dat werken met radiotracers extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van volledige persoonlijke beschermingsmiddelen, altijd moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.