Een niet-invasieve en Technisch Niet-intensieve methode voor Inductie en fenotypering van experimentele bacteriële longontsteking in Muizen

Het algemene doel van dit experimentele protocol is om een niet-invasieve en technisch niet-intensieven procedure te bieden voor het induceren van bacteriële longontsteking bij muizen en de daaropvolgende kwantificering van de in vivo gastheerverdedigingsrespons in de longen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van infectieziekten en immunologie, over de genen en moleculaire paden die de gastheerreactie op infectie controleren. Het belangrijkste voordeel van deze longinfectiemethode is de technische eenvoud.

Dit stelt zelfs laboratoria met weinig expertise in pulmonaire procedures in staat om de pulmonaire aangeboren immuunrespons te bestuderen. In een bioveiligheidsniveau twee faciliteit, ontdooi een glycerolvoorraad van K.pneumoniae en breng een milliliter van de bacterie over in een 500 milliliter kweekfles met 50 milliliter Tryptische Sojabrood. Bewaar de suspensiekweek overnacht bij 37 graden Celsius en 200 tot 225 RPM.

De volgende ochtend, verdun een tot vijf milliliter van de bacteriecultuur in een nieuwe fles met 50 milliliter Tryptische Sojabrood en bewaar de cultuur in de shaker bij 37 graden Celsius gedurende nog eens 2,5 uur om de log-fase te bereiken. Aan het einde van de tweede incubatie, breng een milliliter bacteriën over van de tweede cultuur naar een 1,5 milliliter buis voor centrifugatie. Verwijder het supernatant zonder de pallet te verstoren en resuspendeer de bacteriën voorzichtig in een milliliter steriel zoutoplossing voor drie afzonderlijke wasbeurten.

Na de derde wasbeurt, resuspendeer de bacteriën in een ander milliliter steriel zoutoplossing en zet log-sgewijs seriële verdunningen van het inoculum op. Meet een milliliter van de een op tien en een op honderd verdunningen in wegwerpcuvettes, in duplicaat, om de OD600 van de gewassen K.pneumoniae te bepalen. Een OD600 van 1,0 komt ongeveer overeen met vier tot zeven keer 10 tot de achtste CFU per milliliter.

Na het berekenen van de concentratie van de bacteriën in elke verdunning, resuspendeer de gewenste inoculum CFU-dosis in 50 tot 60 microliter steriel zoutoplossing per acht tot 12 weken oude ontvangersdier. Om de bacteriën aan de dieren te leveren, trek het dosering inoculum in een P200-pipettip en plaats de verdoofde muis in een semi-recumbente rugligging, opgehangen door de maxillaire snijtanden, van een rubberen band die is uitgerekt tussen de pinnen van een schuine Plexiglasplaat. Gebruik een paar stompe, niet-geribbelde pincetten om voorzichtig de tong naar de zijkant te trekken en de dosis in de mondholte van het dier te deponeren, waarbij u ervoor zorgt geen trauma aan de tong of de orale farynx te veroorzaken.

Houd de tong teruggetrokken, occludeer voorzichtig de neus met een gehandschoende vinger, totdat de huisdier twee tot drie keer inhaleert. Wanneer er geen vloeistof zichtbaar is in de mondholte, verplaats de muis van het inoculatiebord naar zijn kooi, in rugligging, om verstopping van de neusgaten te voorkomen terwijl de muis aan het herstellen is. Maak een longitudinale snede net onder het borstbeen.

Til vervolgens het borstbeen met pincetten op, knip het middenrif door en laat de long terugvallen in de borstholte. Vervolg de incisie door de borstholte aan beide zijden van de vaatbundel en door de nek. Wanneer de luchtpijp zichtbaar is, snijd voorzichtig door het midden van de nek en duw het weefsel naar de zijkanten om schade aan de omliggende vaatbundel te voorkomen.

Snijd nu de luchtpijp ongeveer een kwart van de weg vanaf het hoofd en plaats caudaal een canule die is bevestigd aan een milliliter spuit voorgeladen met een milliliter PBS in de luchtpijp. Duw het volume langzaam in de longen, waardoor alle lobben opblazen. Trek vervolgens het volume terug met de spuit en verzamel de verzamelde wasbeurten in een 15 milliliter buis, op ijs.

Bij het juiste experimentele eindpunt, verzamel het bloed uit de linkerventrikel en breng het over in een geheparineerde buis om stollen te voorkomen. Verzamel vervolgens alle longlobben in een 15 milliliter buis met vijf milliliter PBS en de milt in een 15 milliliter buis met twee milliliter PBS. Gebruik vervolgens individuele, wegwerphomogenisatoren per monster om de weefsels op ijs te macereren, gevolgd door seriële verdunning van de weefselslurries.

Plateer de verdunningen, in duplicaat, op afzonderlijke kanten van een enkele TSA-plaat en laat de monsters, kort, drogen. Draai vervolgens de platen om en kweek de monsters in een statische 37 graden Celsius incubator overnacht, waarbij de bacteriekolonies van beide kanten van de plaat en van elke verdunning de volgende ochtend worden gemiddeld. Bij 2000 CFU van K.pneumoniae beginnen muizen doorgaans binnen 12 tot 24 uur na infectie klinische symptomen te vertonen.

Binnen 48 tot 72 uur vertonen veel van de dieren symptomen van ziekte en morbiditeit die doorgaans worden voorafgegaan door een gemiddeld gewichtsverlies van 20 procent. Een LD50 dosis, echter, maakt de detectie mogelijk van zowel de relatief verhoogde als verminderde overleving binnen de experimentele groep en kan worden geprefereerd voor langetermijnstudies. Infectie van de lagere luchtwegen met K.pneumoniae wordt gekenmerkt door een robuuste instroom van leukocyten in de luchtwegen binnen zes uur na infectie, die binnen 24 uur piekt en voornamelijk wordt vertegenwoordigd door neutrofielen.

Cytokinen zijn detecteerbaar in het bronchoalveolaire lavastroomvocht op zowel 24 als 48 uur na infectie met K.pneumoniae en geven inzicht in de longmicro-omgeving en de immuunzelfrecrutering als reactie op bacteriële invasie. De bacteriebelasting in de long, bloed en milt neemt ook dramatisch toe tussen 24 en 48 uur na infectie. Eenmaal beheerst, kan de orofaryngeale aspiratiemethode van longinfectie in slechts een tot twee minuten per muis worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd.

Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat u niet te veel aspiratievolume mag gebruiken. Een volume van 50