Name: In Situ Labeling van mitochondriaal DNA-replicatie in Drosophila volwassen Eierstokken van Edu kleuring (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Leer mitochondriaal DNA-replicatie labelen in Drosophila eierstokken met Edu-kleuring. Deze methode behoudt weefselstructuur en helpt onderzoekers bij het bestuderen van mitochondriale overerving.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken K. Delaney voor de opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Intramurale Programma van het National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI).

1. Tissue Collection en Dissection <ol><li> In elk flesje dat droge gist, cultuur 10 volwassen vrouwelijke vliegt met 10 mannen voor 2-3 dagen. Opmerking: Het handhaven van goed gevoede vrouwelijke vliegen zal de algehele kwaliteit en de opbrengst van de eierstokken de productie te verbeteren en dissectie te vergemakkelijken. </li><li> Verdoven de vrouwelijke vliegt op een kooldioxide (CO 2) vliegen pad. </li><li> Onder de stereoscoop door diverse druppels RT medium (Schneider&#39;s Drosophila medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS)) op een dissectie pad. Voeren alle dissectie procedures het in het medium naar de weefsels levend en gezond te houden. </li><li> Pak een vetgemest vrouwelijke vliegen met scherpe fine-nosed tang op zijn lagere thorax. Gebruik een andere set van een tang om zachtjes trekken aan de uiterste achterste van de vlieg, totdat de weefsels in de buik worden blootgesteld. Maak de twee eierstokken van andere weefsels (bijv lef). Opmerking: Elke eierstok displays een ondoorzichtige structuur die composed van 16-20 bevestigd ovarioles. </li><li> De penetratie van reagentia verbeteren, opent de eierstokken door ze uit elkaar te trekken en het passeren van de uiteinden van de tang tussen elke ovariole een paar keer. Houd de ovarioles verbonden binnen een eierstok verlies aan weefsel minimaliseren tijdens de volgende procedures. </li><li> Breng de eierstokken onmiddellijk naar een 1,5 ml microcentrifugebuis met 500 pl Schneider&#39;s Drosophila medium met 10% FBS. </li><li> Herhaal de dissectie en het verzamelen van 10-15 eierstokken bij elke microcentrifugebuis. </li></ol> 2. EDU Labeling <ol><li> Zuig het medium in elke buis, en te vervangen door 500 ul van Schneiders Drosophila medium met 10% FBS met 7 uM aphidicoline. Opmerking: afidicoline wordt gebruikt nucleaire DNA-synthese te blokkeren door remming van DNA-polymerase α zonder dat mtDNA replicatie 7, 12. Het is mogelijk om de aphidicoline concentratie te verhogentot 70 uM tot betere inhibitie. De voorraadoplossing van 3-30 mM in DMSO afidicoline kan tot 6 weken worden bewaard in het donker bij -20 ° C. </li><li> Om de eierstokken gezond te houden, ervoor zorgen dat ze worden ondergedompeld onder oplossingen tijdens het verwisselen van het medium. Gebruik Schneiders Drosophila medium met 10% FBS tot en met stap 2.6. </li><li> Incubeer eierstokken gedurende 3 uur bij kamertemperatuur op een bankje-top rocker met zachte rotatie. <ol><li> Voor de behandeling met geneesmiddelen, bijvoorbeeld, mitochondriale ontkoppelrail carbonyl cyanide 4-trifluormethoxy fenylhydrazon (FCCP), voeg de juiste concentratie van het geneesmiddel (bijvoorbeeld 10 uM FCCP) in het medium na 2 uur van aphidicoline behandeling. Verder incuberen gedurende nog 1 uur. </li></ol></li><li> Verwijder het medium dat afidicoline met of zonder geneesmiddel. In het kort spoel de eierstokken met medium (aphidicoline is niet nodig) tweemaal. </li><li> Voeg 1 ml medium dat 10 uM Edu en 7 uM aphidicoline en doorgaan incubating bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Bewaar de EDU 10 mM voorraadoplossing (in DMSO) bij -20 ° C. </li><li> Verwijder het medium dat Edu en aphidicoline. Wassen met medium (zonder aphidicoline) tweemaal gedurende 3 min elk. </li></ol> 3. Tissue Fixatie en Permeabilisatie <ol><li> Bereid een 4% paraformaldehyde oplossing in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4). Let op: We gebruikten de handel verkrijgbare paraformaldehyde opgeslagen in het pre-scoorde ampullen. Open een nieuwe ampul en verdunnen tot 4% voor gebruik. LET OP: Formaldehyde is giftig; het moet in een zuurkast met de huid en oogbescherming worden behandeld. </li><li> Fix eierstokken met 4% paraformaldehyde gedurende 20 min bij kamertemperatuur onder zacht rotatie. </li><li> Verwijder het fixeermiddel eierstokken en was tweemaal in 1 ml 3% BSA in PBS gedurende 5 min per keer. </li><li> Naar de weefsels permeabilize, verwijder de wasoplossing en voeg 1 ml 0,5% Triton X-100 in PBS. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min. </li><li> Verwijder de permeabilisatie oplossing en tweemaal wassen in 1 mlvan 3% BSA in PBS. </li></ol> 4. EDU Detection Noot: edu detectie is gebaseerd op &quot;click&quot; chemie, een Cu (I) -gekatalyseerde [3 + 2] cycloadditie 13, welke fluorescerende aziden bijdraagt aan de terminale alkyn groep EDU en het fluorescerende molecuul wordt onderworpen aan daaropvolgende detectie. Aangezien Cu (I) die gemakkelijk wordt geoxideerd tot de niet-katalytische Cu (II) species, nodig om de reactie te katalyseren, is het raadzaam om de Cu (II) sulfaat beperken in situ Cu (I) te verkrijgen. Dat wil zeggen Cu (II) sulfaat wordt toegepast in aanwezigheid van een reductiemiddel zoals ascorbinezuur (hierin de &quot;buffer additief&quot;) koper genereren (I). <ol><li> Voor het experiment, de voorbereiding van de werkoplossing van de Alexa Fluor azide (Alexa Fluor 488 azide, Alexa Fluor 555 azide of anderen, afhankelijk van de gewenste fluorofoor, die worden genoemd als &quot;kleurstof azide&quot; genoemd), edu reactiebuffer en EDU buffer additief volgens de fabrikantinstructies. <ol><li> Reconstrueren de kleurstof azide in 70 pl DMSO. Bewaar de werkoplossing bij -20 ° C tot 1 jaar. </li><li> Bereid verse Edu reactie buffer door verdunning van de 10x EDU reactie buffer met gedemineraliseerd water. Opmerking: na gebruik bewaar 1x resterende oplossing bij 4 ° C. De 1x oplossing is maximaal 6 maanden. </li><li> Maak een 10x voorraad oplossing van het Edu buffer additief door het volledig oplossen van het poeder in 2 ml gedeïoniseerd water. Opmerking: Deze voorraad oplossing is tot 1 jaar bij -20 ° C. Als de oplossing ontstaat een bruine kleur, maar het is afgebroken en moet worden weggegooid. </li></ol></li><li> Bereid de EDU reactie cocktail verse elke keer, en gebruiken binnen 15 minuten na de bereiding. Om reproduceerbare resultaten te bereiken, zorg ervoor dat de reactie componenten zijn op dezelfde verhoudingen gehandhaafd. <ol><li> Maak verse 1x Edu buffer bewaarvloeistof door verdunning van de 10x voorraad-oplossing (bereid in stap 4.1.3) 1:10 in gedemineraliseerd water. Gebruik deze sPLOSSING op dezelfde dag. </li><li> Bereid 1 ml van Edu reactie cocktail door het combineren van de volgende ingrediënten in deze volgorde: 860 ul 1x edu reactiebuffer, 40 pi CuSO4, 2.5 pi kleurstof azide, 100 ul 1x Edu buffer additief. Opmerking: Het is belangrijk dat de ingrediënten toegevoegd om optimale prestaties te garanderen. </li></ol></li><li> Verwijder de PBS met 3% BSA en voeg 0,5 ml van de EDE reactiecoctail aan elke buis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten onder zacht rotatie. Houd het beschermd tegen licht monsters. </li><li> Verwijder de EDU reactiecoctail en eenmaal wassen met 1 ml 3% BSA in PBS. </li><li> Was de monsters eenmaal met 1 ml PBS. </li></ol> 5. Antibody Labeling Opmerking: Voer etikettering antilichaam na EDU kleuring. Indien geen extra kleuring is gewenst, kan men overgaan tot montage en beeldvorming direct. Het is belangrijk dat de monsters worden beschermd tegen licht in de volgende procedures. <ol><li> Verwijder de wasoplossing. Blokkeer de eierstokken in 1 ml van het blokkeren met 0,2% BSA en 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 30 min. </li><li> Verwijder de blokkering oplossing en te vervangen door primair antilichaam verdund in het blokkeren van oplossing (bv, muis ATP synthase subunit α antilichaam, 1: 1000 verdunning). Incubeer in het donker bij 4 ° CO / N. </li><li> Was de monsters met 1 ml blokkeeroplossing 3 maal, 10 minuten per keer. Om de achtergrond te minimaliseren, twee keer wassen gedurende 30 minuten elk. Verwijder de blokkerende oplossing. </li><li> Incubeer met tweede antilichaam verdund in blokkeeroplossing (bijvoorbeeld geit anti-muis Alexa Fluor 568 secundair antilichaam, 1: 200 verdunning) gedurende 2 uur bij KT. Opmerking: Gebruik een andere kleur dan de ene gekoppeld aan Edu. </li><li> Herhaal het wassen stappen uitgevoerd in stap 5.3. </li><li> Spoelen met 1 ml PBS eenmaal om het reinigingsmiddel te verwijderen. </li></ol> 6. Montage en Imaging <ol><li> Verwijder voorzichtig al de PBS en immediately bedekken eierstokken met 50 gl montage medium (met of zonder DAPI). Opmerking: Gebruik een fixeermiddel dat niet verhardt terwijl de ovarioles worden van elkaar gescheiden. Eierstokken kunnen voor tot een week opgeslagen in fixeermiddel bij 4 ° C. </li><li> Snijd het uiteinde van een pipet en deze gebruiken om eierstokken voorzichtig brengen op een microscoopglaasje. </li><li> Volledig gescheiden elk ovariole met scherpe fine-nosed tang onder de stereomicroscoop. Verwijder het aansluiten van weefsels aan het achterste einde en het stadium 14 of rijpe eicel kamers. De jonge ei kamers zijn aan het voorste uiteinde en transparant. </li><li> Lijn de ei kamers met een tang, zodat ze niet met elkaar overlappen. </li><li> Langzaam lager a # 1,5 glazen dekglaasje bovenop de monsters. Laat het fixeermiddel polymeriseren gedurende enkele uren bij kamertemperatuur. Seal met transparante nagellak. </li><li> Beeld schuift de volgende dag, en bewaar bij 4 ° C voorafgaand aan de beeldvorming. </li><li> Visualiseren onder een confocale microscope met een 63x olie-immersie objectief. Leg driedimensionale z-stacks beelden. Opmerking: Er is een sterke Edu signaal in later stadium ei kamers en de achtergrond fluorescentie in de epitheliale schede. Bij het onderzoek van Edu labeling in een bepaalde germarium, moet men germariums die worden overlapt door of in de buurt van andere weefsels of later stadium ei kamers te vermijden. </li></ol>

<ol><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Wallace, D. C., Chalkia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+genetics+and+the+heteroplasmy+conundrum+in+evolution+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220(2013).</li>
<li>Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Lab. Press. (1993).</li>
<li>Riechmann, V., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axis+formation+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Axis formation during Drosophila oogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).</li>
<li>Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+fusome%2C+a+germline-specific+organelle%2C+contains+membrane+skeletal+proteins+and+functions+in+cyst+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation.</a> Development. 120 (4), 947-956 (1994).</li>
<li>Cox, R. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Balbiani+body+and+the+fusome+mediate+mitochondrial+inheritance+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis.</a> Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).</li>
<li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).</li>
<li>Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+mitochondrial+genomes+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The functional organization of mitochondrial genomes in human cells.</a> BMC Biol. 2, (2004).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+adult+primate+neocortex%3A+an+evaluation+of+the+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence.</a> Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+propagation+of+functional+mitochondrial+DNA+during+oogenesis+restricts+the+transmission+of+a+deleterious+mitochondrial+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant.</a> Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).</li>
<li>Lentz, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+%28mtDNA%29+Biogenesis%3A+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).</li>
<li>Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+solid+phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-triazoles+by+regiospecific+copper%28i%29-catalyzed+1%2C3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).</li>
<li>Horwitz, H. B., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+by+ethidium+bromide+of+mitochondrial+DNA+synthesis+in+physarum+polycephalum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum.</a> J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).</li>
<li>Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+the+biochemistry+of+eucaryotic+DNA+replication+revealed+by+aphidicolin%2C+an+unusual+inhibitor+of+DNA+polymerase+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha.</a> Cell. 23 (3), 647-648 (1981).</li>
<li>McClung, C., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+behavioral+responses+to+free-base+cocaine+and+the+development+of+behavioral+sensitization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila.</a> Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).</li>
<li>Moore, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+intoxication+in+Drosophila%3A+Genetic+and+pharmacological+evidence+for+regulation+by+the+cAMP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway.</a> Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).</li>
<li>Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-aminobutyric+acid+B+receptor+1+mediates+behavior-impairing+actions+of+alcohol+in+Drosophila%3A+adult+RNA+interference+and+pharmacological+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).</li>
<li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila%3A+induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

EDU etikettering een nieuwe en efficiënte methode om DNA-synthese te detecteren in prolifererende cellen, die gebaseerd is op de opname en kleuring van nucleoside analogen nieuw gesynthetiseerde DNA. Deze methode is superieur aan de werkwijze BrdU labeling, dat het sneller en zeer gevoelig. Nog belangrijker, het zorgt voor een goede structurele conservering en efficiënte EDU-kleurstofpenetratie volle-mount weefsels 9, 10. Historisch gezien als een superieur alternatief voor BrdU labeling, edu labeling werd gebruikt voor het bestuderen van nucleaire DNA replicatie gedurende de S-fase van de celcyclus. Afidicoline is een remmer van DNA- polymerase α, die de belangrijkste polymerase nucleaire DNA replicatie S-fase 12 15. mtDNA replicatie door DNA polymerase γ, dat ongevoelig voor behandeling afidicoline uitgevoerd. Derhalve behandeling met afidicoline vóór en tijdens de EDU incubatie remde edu opname in nucleair DNA. Het zou moetengewezen dat afidicoline stabiel gedurende enkele weken kan zijn als geschikte wijze opgeslagen, en de werkzaamheid van afidicoline bij het remmen van nucleair DNA-replicatie was variabel in onze handen. De ovarioles of ei kamers met sterke nucleair DNA-etikettering dienen te worden uitgesloten van verdere data-analyses. mtDNA replicatie kan gemakkelijk worden gevisualiseerd als puncta in het cytoplasma, welke ook verschaft een eenvoudige manier om het niveau van mtDNA replicatie gekwantificeerd door het tellen van het aantal EDU puncta, genormaliseerd naar het totale volume van cytoplasma. Beeldverwerkingssoftware kunnen worden toegepast om de EDU puncta automatisch identificeren microscopische beelden, wat vooral nuttig is voor computationele analyse van grote datasets. Moet echter voorzorgsmaatregelen worden genomen, omdat de onvolledige inhibitie van nucleair DNA replicatie kan leiden tot de EDE opname in verschillende loci op het chromosoom en worden weergegeven als puncta in de kern. Ook in andere gevallen, de intensiteit van Edu opname in replicating mtDNA zwak is, terwijl de achtergrond en lawaai hoog zijn. Derhalve de afzonderlijke parameters voor automatische beeld analyse zorgvuldig worden gedefinieerd. Ook wordt aanbevolen dat de beelden moeten worden onderzocht met getrainde ogen om ervoor te zorgen dat de juiste edu puncta worden geïdentificeerd. Visualisatie van nieuw gesynthetiseerde mtDNA in Drosophila oögenese biedt de mogelijkheid om te onderzoeken hoe mtDNA replicatie wordt gereguleerd onder fysiologische of pathologische omstandigheden door het uitvoeren van het experiment met vliegen onderworpen aan een verscheidenheid van farmacologische of genetische verstoringen. In een eerdere studie, werd Edu incorporatie test uitgevoerd in een mtDNA mutant Drosophila mt: CoI T300I 11. Teneinde voorts de mitochondriale membraanpotentiaal verstoren, eierstokken werden behandeld met verschillende concentraties van mitochondriale ontkoppelaar FCCP of 2,4-dinitrofenol (DNP) vóór EDU opname. Afhankelijk van de experimentele doeleindenen drugs kenmerken, verschillende methoden kunnen zijn voor effectieve levering aangenomen. Voor volwassen vliegen, kunnen geneesmiddelen worden gepresenteerd als een damp (bijvoorbeeld ethanol en cocaïne) 16,17 of drugs kan worden geïnjecteerd in de buik, waar het snel diffundeert door het lichaam 18. Het meest gebruikelijk is dat geneesmiddelen worden toegevoegd aan de vlieg voedsel of sucrose / geneesmiddel verzadigd filtreerpapier. Bijvoorbeeld, de remmer van microtubule assemblage, colchicine, werd toegevoerd aan vliegen 2-3 dagen vóór dissectie eierstok 19. Daarom is het belangrijk om de geneesmiddel afgifte-methode evalueren en kies geschikte concentraties. Om de succesvolle beeldvorming van mtDNA replicatie in Drosophila eierstokken te garanderen, moet een aantal kritische stappen zorgvuldig worden uitgevoerd. Foremost, het behoud van de leefbaarheid en de gezondheid van de eierstokken tijdens de dissectie en Edu integratie van essentieel belang is (stap 1 en 2). Schneider&#39;s Drosophila medium met FBS moet worden opgewarmd tot kamertemperatuurvoor gebruik. Men moet direct contact tussen de ei kamers en dissectie gereedschap of pipetpunten te minimaliseren. De eierstokken mag onder oplossingen worden ondergedompeld te allen tijde om uitdroging te voorkomen. Verkeerd gebruik van de weefsels kan gemakkelijk leiden tot flauwvallen of geen tl-signalen. Tijdens het weefsel montagestap moet ovarioles gescheiden van elkaar en verspreid op het microscoopglaasje. Controleer het ei kamers niet gestapeld bovenop elkaar. We hebben gemerkt dat het ei kamers boven het podium 14 weergegeven weinig EDU oprichting. Bovendien, als gevolg van de grote omvang, de late fase ei kamers vaak de oorzaak van het naburige jongere ei kamers zijn onscherp. Zo wordt aanbevolen dat de late stadium ei kamers worden weggegooid. Hier hebben we een gedetailleerd protocol voor de etikettering repliceren mtDNA in Drosophila volwassen eierstokken. Deze methode zorgt voor een eenvoudige kwantificering van mtDNA replicatie onder verschillende genetische en farmacologische verstoringen,en zal nuttig zijn voor het ontleden van mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling mitochondriale biogenese en mtDNA erfenis.

Naast het nucleaire genoom, elke eukaryote cel bevat ook duizenden exemplaren van kleine cirkelvormige DNA in de mitochondriale matrix. Terwijl mitochondriaal DNA (mtDNA) codeert essentiële subeenheden van electronentransportketting de meerderheid van de mitochondriale proteoom, waaronder alle elementen voor replicatie en transcriptie van mtDNA gecodeerd door het nucleaire genoom. In tegenstelling tot het nucleaire genoom die Mendeliaanse erfrechterlijk volgt, wordt het dier mitochondriaal genoom exclusief geërfd via de moederlijn. Daarom begrijpen hoe mtDNA wordt verspreid en overgedragen van de ene generatie naar de volgende door middel van de vrouwelijke eicel is van fundamenteel belang. Echter, er is voortdurende discussie over de vraag hoe mtDNA replicatie is geregeld in de vrouwelijke kiemlijn. Daarnaast is de algemeen aanvaarde mtDNA knelpuntentheorie voor mtDNA transmissie suggereert dat de populatie van mtDNA in primordiale kiemcellen is subsampled een relatief klein aantal during ontwikkeling 1 2. Het houdt ook in dat mtDNA replicatie is tijd en ruimte gereguleerd tijdens oögenese. Daarom zal de in situ detectie van mtDNA replicatie tijdens kiemlijn ontwikkeling van het inzicht in het mechanisme van mtDNA overerving vergemakkelijken. Drosophila oögenese biedt een genetisch handelbaar systeem om mtDNA replicatie en transmissie te bestuderen. In elk van de twee Drosophila eierstokken, er 16-20 onafhankelijke strengen ei kamers genoemd ovarioles 3, waarbij de functionele eenheden van eierproductie zijn (zie figuur 1A). Elke ovariole bevat een geleidelijke lineaire ordening oögenese, waarbij het voorste uiteinde bestaat uit een structuur genaamd germarium. De germarium is verder onderverdeeld in vier regio&#39;s die kiemcellen in verschillende ontwikkelingsstadia bevatten. In regio 1, kiembaan stamcellen gaan door asymmetrische divisie dochtercellen bekend als c producerenystoblasts. Regio 2a bevat de cystoblasts dat hun laatste divisie hebben afgerond. Cystoblasts ondergaan vier rondes van verdeeldheid produceren 16-celgroepen. De 16 cellen blijven met elkaar verbonden door cytoplasmatische bruggetjes grachten. Slechts één van de cellen verbindt differentiatie als de eicel, terwijl de andere 15 ontwikkelen polyploïde cellen verpleegster. Essentieel cytoplasmatische structuur, bekend als fusome wordt voorgesteld vergemakkelijken de vorming van grachten, bepalen de cyste polariteit en de verpleegkundige cel-interacties eicel 4,5. Aangezien de cysten komen tot gebied 2b, de cyste structuren overspannen de gehele breedte van de germarium, en meer geassocieerd met follikelcellen. De germarium structuren eindigen met regio 3 met daarin de eerste ontluikende ei kamer. Vervolgens worden de ei kamers gemonteerd aan het achterste uiteinde van de germarium, die verder door de ovariole in 14 morfologisch verschillende fasen. De groei van de eicel is afhankelijk van de verpleegster cellen, which transporteiwitten, mRNA en endomembrane structuren (bijv Golgi) via de grachten in de eicel. Tijdens Drosophila oogenesis, werd gevonden dat een fractie van de mitochondriën in elke cel 16 cysten werden bij dit fusome, bewogen door de grachten en afgeleverd in de interne eicel in een grote massa genaamd Balbiani lichaam 6. Dit fenomeen werd voorgesteld bij te dragen tot de kwaliteitscontrole van mitochondriale erfelijkheid vrouwelijke eierstokken. Detectie van mtDNA synthese is gebaseerd op de opname van gelabelde DNA precursors in cellulair DNA. Traditioneel, een nucleoside-analoog van thymidine 5-broom-2&#39;-deoxyuridine (BrdU) werd gebruikt om het mtDNA replicatie in weefselcultuur cellen 7,8 labelen. Echter, de antilichaam-gebaseerde BrdU labeling vertoont een aantal beperkingen, in het bijzonder voor de hele-mount weefsel kleuring. Een groot nadeel van BrdU labeling is dat het DNA denaturatie blootde BrdU epitoop, zodat het kan worden gedetecteerd door het anti-BrdU-antilichaam. Het monster moet worden behandeld onder zware denaturerende omstandigheden zoals chemicaliën (bijvoorbeeld, zoutzuur of mengsels van methanol en azijnzuur), warmte of digestie met DNase, die de structuur van het monster kunnen verstoren en bemoeilijken de volgende kleuringsprocedure 9, 10. Hier wordt een alternatieve thymidine analoog 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EDU) gebruikt om het repliceren mitochondriaal DNA in Drosophila volwassen eierstokken labelen. Deze werkwijze is sneller en zeer gevoelig. Edu wordt gemakkelijk in cellulair DNA tijdens de replicatie van DNA opgenomen. De volgende detectie is gebaseerd op een &quot;klik&quot; reactie, een Cu (I) -gekatalyseerde covalente reactie tussen de eindstandige alkyngroep en een fluorescerende azide 10. Omdat de reactie van de denaturatie van het monster vereist, is het mogelijk goede structurele conservering. Bovendien is de grootte van een kleurstofzide is slechts 1/500 van die van een antilichaam-molecuul 10, die een snelle en efficiënte penetratie van whole-mount weefsels mogelijk maakt. We hebben deze methode om mtDNA replicatie detecteren tijdens Drosophila oögenese gebruikt en vond een opvallend ruimtelijk patroon in de germarium regio Drosophila eierstok 11, die ons leiden tot een replicatie-afhankelijke mtDNA selectieve overervingsmechanisme stellen. Wij presenteren hier een gedetailleerd protocol over Edu etikettering van mtDNA replicatie in Drosophila eierstokken. Om de toepassing van het protocol aan te tonen, hebben we ook getest het mtDNA replicatie in een mtDNA mutant Drosophila (mt: CoI T300I) 11, evenals met uiteenlopende behandeling van mitochondriale ontkoppelrails, die het mitochondriale membraanpotentiaal te verdrijven en mogelijk verstoren mtDNA replicatie.

```html
<table><tbody><tr><td>Schneider&rsquo;s Drosophila medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10100-147</td><td></td></tr><tr><td>Pair of Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Aphidicolin</td><td>Sigma</td><td>A0781</td><td>Als je oplost in DMSO afgeeft. Vermijd herhaald ontdooien en invriezen. Bescherm tegen licht. Kan binnen 6 weken na het oplossen worden gebruikt. </td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% EM grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Formaldehyde is giftig; het moet worden behandeld in een afzuigingskast met bescherming voor huid en ogen.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3190</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reactiebuffer en Edu bufferadditief zijn inbegrepen</td></tr><tr><td>Mouse ATP synthase subunit &alpha; antibody, (15H4C4)</td><td>MitoSciences</td><td>Ab14748</td><td>1:1,000 verdunning</td></tr><tr><td>Mouse Hts antibody (clone RC)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>hts RC</td><td>1:1,000 verdunning</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secundair antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td>1:200 verdunning</td></tr><tr><td>Vectashield montagemedium met DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Glazen dekvlakken, #1.5 22 mm x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-103</td><td></td></tr><tr><td>Nailpolish</td><td>Elf</td><td></td><td>Veel van de pigmenten die in nagellak worden gebruikt, zijn fluorescerend en lekken in monsters. Alleen heldere nagellak mag worden gebruikt.</td></tr></tbody></table>
```

in situ labeling van mitochondriaal dna-replicatie in drosophila volwassen eierstokken van edu kleuring

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Het mitochondriale genoom wordt uitsluitend overgedragen via de vrouwelijke lijn. Het begrijpen van hoe het mitochondrion en zijn genoom worden vermenigvuldigd en doorgegeven van de ene generatie naar de volgende via de vrouwelijke eicel, is van fundamenteel belang. Vanwege de genetische hanterbaarheid en de elegante, geordende eenvoud waarmee de ontwikkeling van de eicel verloopt, is Drosophila-oogenese een onschatbaarbaar systeem geworden voor mitochondriaal onderzoek. Een EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) labelmethode werd gebruikt om mitochondriale DNA (mtDNA) replicatie in Drosophila eierstokken te detecteren. Deze methode is superieur aan de BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labelmethode omdat het goede structurele behoud en efficiënte penetratie van fluorescente kleurstoffen van whole-mount weefsels mogelijk maakt.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het labelen van replicatief mitochondriale DNA in Drosophila volwassen eierstokken met EdU. Enkele technische oplossingen worden aangeboden om de levensvatbaarheid van de eierstokken te verbeteren, hun gezondheid tijdens de voorbereiding te behouden en hoogwaardige beeldvorming te garanderen. Visualisatie van nieuw gesynthetiseerd mtDNA in de eierstokken onthult niet alleen het opvallende temporele en ruimtelijke patroon van mtDNA-replicatie tijdens oogenese, maar maakt ook eenvoudige kwantificering van mtDNA-replicatie mogelijk onder verschillende genetische en farmacologische verstoringen.

De bovenstaande protocol maakt visualisatie van de puntvormige structuren geassocieerd met mitochondriën (Figuur 1B-C), die mitochondriale DNA-replicatie in Drosophila oögenese geven. De EDE puncta gelocaliseerd mitochondria gekenmerkt door kleuring voor ATP synthase alfa-subeenheid (Figuur 2). De waargenomen signalen afwezig zijn in eierstokken behandeld met ethidiumbromide 11, een remmer voor mtDNA replicatie 14, gecontroleerd of deze inderdaad puncta label replicerende mtDNA.Aphidicolin werd gebruikt om nucleair DNA kleuring te remmen zonder dat mtDNA replicatie (Figuur 2). Zonder aphidicoline behandeling, intense Edu signalen etiket van de kernen en mtDNA puncta waren nauwelijks gedetecteerd (figuur 3). In aanwezigheid van afidicoline, nucleaire opname werd drastisch verminderd en vele puncta verband met mitochondria waargenomen. (Figuur 1B). Echter, met name mtDNA replicatie vertoonden een ruimtelijk patroon in de germarium. Zoals aangegeven door het aantal EDU puncta, is er een beperkte mate van mtDNA replicatie in regio 1 van de germarium, maar bijna geen EDU inbouw in regio 2A (figuur 1C). Als de cyste verplaatst naar regio 2B in de germarium, mtDNA replicatie hervat en het aantal EDU puncta in het achterste gebied 2B van cyste was veel hoger dan in gebied 2A (Figuur 1C). In het bijzonder, werd intensief Edu incorporatie geconcentreerd rond de grachten en de fusome structuren, zoals gekleurd door de hu li tai shao (HTS) eiwit. mtDNA gehouden repliceren op een hoog niveau in het gebied 3 van het germarium (figuur 1C) Om de associatie van SPECIF tonenic genen of behandeling met mtDNA proliferatie, kon Drosophila eierstokken worden onderworpen aan genetische manipulatie of behandeling met geneesmiddelen. We behandelden eierstokken met verschillende concentraties FCCP, een klassiek mitochondriale protonophore die mitochondriale membraanpotentiaal verdwijnt. Als controle werd DMSO had geen effect op mtDNA replicatie (Figuur 4A). Hoge doses FCCP (10 M) bijna op mtDNA replicatie volledig in het hele germarium (figuur 4D). Niettemin lagere concentratie FCCP (2 of 5 uM) had een klein effect op mtDNA replicatie in regio 1 maar remde replicatie in gebieden 2B en 3 (figuur 4B-C), wat suggereert regio 2B en 3 zijn gevoeliger voor mitochondriale verstoring of ze houden ten opzichte van tragere replicatie kinetiek. De bovenstaande resultaten gaven aan dat mtDNA replicatie geassocieerd met mitochondriale activiteit. In het bijzonder, verschillende regio&#39;s van de germarium reageerden verschillend op mitochondriale impairment. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig1.jpg" /> Figuur 1. mtDNA replicatie tijdens Drosophila oögenese. (A) Schematische weergave van een Drosophila ovariole en een vergrote weergave van de germarium. De ovariole illustreert van links naar rechts, anterior naar posterior, opeenvolgende ontwikkelingsstadia van ei kamers. In de germarium, de fusome (rood), kiemlijn stamcellen (blauw), mitochondria (groen), de toekomstige eicel (gebroken lijn, erkend door de positionering, fusome structuur en mitochondriale clusters), de ontwikkeling van cysten (perzik) en vier ontwikkelings gebieden worden getoond . (B) Representatieve z-stack projectie van een wild-type ovariole gelabeld door Edu en antilichaam tegen Hts-RC, een marker voor grachten en fusome. In aanwezigheid van afidicoline, werd de EDE opgenomen in mtDNA (pijlpunten) en kernen (pijlen). Schaal bar, 10 micrometer.(C) Vergrote weergave van germaria in de boxed regio geschetst in B. De vier ontwikkelings- gebieden zijn aangegeven. Schaal bar, 5 micrometer 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig2.jpg" /> Figuur 2. mtDNA replicatie in de Drosophila germarium gevisualiseerd door EDE opname met afidicoline behandeling (A) -. (D) Vertegenwoordiger confocale gedeelte van een wildtype germarium geeft edu incorporatie (groen, b), mitochondria, gekenmerkt door ATP synthase alpha subunit kleuring (rood, C) en kernen, gelabeld met DAPI kleuring (blauw, D) met pre-incubatie met DNA-polymerase-α remmer afidicoline. (A &amp;# 39 ;-D) Een vergroot beeld van de boxed gebied (A) toont EDU incorporatie (B &#39;), mitochondria (C) en kernen (D&#39;). In aanwezigheid van afidicoline, wordt nucleaire opname (pijlen) gereduceerd en veel puncta gelokaliseerd binnen mitochondria (pijlpunten). Schaalbalken, 10 urn. Het cijfer is aangepast van 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig3.jpg" /> Figuur 3. mtDNA replicatie nauwelijks gedetecteerd in de Drosophila germarium afidicoline zonder behandeling (A) -. (D) Vertegenwoordiger confocale gedeelte van een wildtype germarium geeft edu incorporatie (groen), mitochondria, gekenmerkt doorATP synthase alpha subeenheid kleuring (rood) en kernen, gelabeld met DAPI kleuring (blauw) in de afwezigheid van de DNA-polymerase α remmer afidicoline. (A&#39;-D) toont een vergroot beeld van de boxed gebied (A) toont EDU incorporatie (B &#39;), mitochondria (C) en kernen (D&#39;). Zonder aphidicoline, werden intense Edu signalen label kernen (pijlen), en mtDNA puncta nauwelijks ontdekt. Schaalbalken, 10 urn. Het cijfer is aangepast van 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig4.jpg" /> Figuur 4. mitochondriaal ontkoppelrail schaadt het mtDNA replicatie. Vertegenwoordiger z-stack projecten met wild-type germarium behandeld met DMSO(A) of mitochondriale ontkoppelaar FCCP bij concentraties van 2 uM (B), 5 uM (C), 10 uM (D) tijdens EDU incorporatie. Let op de verminderde EDU etikettering regio 2B behandeld met 2 uM FCCP (B), en in beide regio 2B en 3 behandeld met 5 uM FCCP (beschreven in kaders). Vier gebieden ontwikkeling getoond. Pijlen, nucleair DNA; pijlpunten, mtDNA. Schaal bar, 10 micrometer. Het cijfer is aangepast van 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Drosophila oogenese blijft uitzonderlijk nuttig in de studie van mitochondriale proliferatie en overerving. Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol dat wordt gebruikt om het replicerende mitochondriale DNA (mtDNA) in Drosophila volwassen eierstokken te labelen met 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), wat het mogelijk maakt om mechanismen te ontdekken die geassocieerd zijn met mitochondriale overerving die voorheen discutabel waren.

In Situ Labeling van mitochondriaal DNA-replicatie in Drosophila volwassen Eierstokken van Edu kleuring

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Het algemene doel van dit experiment is het labelen van mitochondriale DNA-replicatie in de eierstokken van volwassen drosophila via EdU-kleuring. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het mitochondriale vakgebied, zoals het proces van mitochondriale biogenese en de overerving van mitochondriaal DNA tijdens de ontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een goede behoud van de structuur en een efficiënte penetratie van fluorescerende kleurstoffen in volledige gebonden weefsels mogelijk maakt.Om het experiment te beginnen, neem een flacon met drosophila-medium dat droge gist bevat en kweek 10 volwassen vrouwelijke vliegen met 10 volwassen mannetjes bij 25 °C gedurende twee tot drie dagen. Zorg ervoor dat de vliegen tijdens de incubatie goed gevoed blijven. Anestheseer de vliegen op een koolstofdioxide-vliegenplateau en selecteer de vrouwelijke vliegen met een schilderspenseel.Voeg enkele druppels drosophila-medium op kamertemperatuur, aangevuld met 10% FBS, toe aan een dissectiepad en plaats dit onder een stereomicroscoop. Pak met scherpe fijne pincetten een dikke vrouwelijke vlieg vast bij de lagere thorax. Houd al het weefsel ondergedompeld in het medium en trek met een tweede pincet voorzichtig aan het uiterste posterieure deel van de vlieg totdat de weefsels in het abdomen zijn blootgelegd.Scheid vervolgens de twee ovaria van de omliggende darm en overbodig weefsel. Open de ovaria door voorzichtig te trekken en leg de ovariolen bloot. Om de penetratie van de reagentia te bevorderen, brengt u de punten van de pincet een paar keer tussen elke ovariole door.Overdraag tenslotte de ovaria naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter die 500 microliter schoon drosophila-medium met 10% FBS bevat. Herhaal de dissectie om zoveel mogelijk ovaria te verzamelen, waarbij 10 tot 15 per microcentrifugebuis worden geplaatst. Om te beginnen met het labelen, wordt het medium uit de buizen met de ovaria geaspireerd, waarbij erop wordt gelet dat het weefsel gedurende het hele proces onder de vloeistof blijft, en vervangen door 500 microliter medium met zeven micromolair afidicoline, een blokkerend middel voor nucleaire DNA-synthese.Incubeer de eierstokken gedurende drie uur bij kamertemperatuur op een benchtop-rocker met een zachte rotatie. Indien een behandeling met een geneesmiddel gewenst is, voeg dan na twee uur incubatie de juiste concentratie van het gekozen geneesmiddel toe aan het medium, en laat de incubatie vervolgens voortgaan gedurende de gewenste tijdsduur voor het geselecteerde geneesmiddel. Verwijder het medium van de eierstokken en spoel deze twee keer kort af met vers drosophila-medium.Voeg één milliliter medium toe dat tien micromolaire EdU en zeven micromolaire aphidicoline bevat en incubeer de ovaria gedurende twee uur bij kamertemperatuur met zachte rotatie. Verwijder vervolgens de vloeistof die EdU en aphidicoline bevat en was de ovaria tweemaal gedurende drie minuten met schoon drosophila-medium. Om het weefsel te fixeren, worden de ovaria eerst twintig minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd in 4% paraformaldehyde met zachte rotatie.Verwijder vervolgens het fixatief en was het weefsel twee keer in één milliliter 3% BSA in PBS, telkens gedurende vijf minuten, onder rotatie. Voor de permeabilisatie wordt de wasoplossing verwijderd, wordt één milliliter 0,5% Triton X-100 in PBS toegevoegd en worden de eierstokken vervolgens twintig minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd onder rotatie. Verwijder tot slot de oplossing en was het weefsel twee keer in één milliliter 3% BSA in PBS.Bereid en bewaar vóór het experiment de EdU-bufferadditief volgens de instructies van de fabrikant. Los het EdU-bufferadditiefpoeder volledig op in twee milliliter gedeïoniseerd water om een 10x voorraadoplossing te maken. Bereid voor de start van de detectie verse EdU-reactiebuffer door de 10x EdU-reactiebuffer te verdunnen met gedeïoniseerd water tot één milliliter 1x werkoplosssing, waarmee twee buizen eierstokken gelabeld kunnen worden.Maak 100 µL verse 1x EdU-additieve buffersolutie door de 10x stockoplossing 1:10 te verdunnen in gedeïoniseerd water. Bereid één milliliter EdU-reactiecocktail voor door de reagentia in de volgende volgorde te combineren: 860 µL 1x EdU-buffer, 40 µL koper(II)sulfaat, 2,5 µL dye azide en 100 µL EdU-bufferadditief. Het is belangrijk om de reagentia in deze specifieke volgorde toe te voegen en de cocktail binnen 15 minuten na bereiding te gebruiken.Verwijder de BSA-oplossing uit de monsters en voeg 0,5 milliliter van de EdU-reactiecocktail toe aan elke buis. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder langzame rotatie. Bescherm de monsters tegen licht.Was ten slotte de monsters één keer in één milliliter 3% BSA in PBS, en was daarna nog een keer in één milliliter PBS. Om te beginnen met de antilichaamlabeling, verwijdert u eerst de wassolution uit de eierstokken en voegt u één milliliter blokkeersolution toe die 0,2% BSA en 0,1% Triton X-100 in PBS bevat. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie, waarbij u er in elke labelingsstap voor zorgt dat de monsters tegen licht worden beschermd.Verwijder de blokkeringsoplossing. Vervang deze door de primaire antilichaam opgelost in blokkeringsoplossing en incubeer dit gedurende de nacht bij vier graden Celsius in het donker. Was de monsters drie keer met één milliliter blokkeringsoplossing gedurende tien minuten per keer, en was vervolgens nog twee keer gedurende 30 minuten per keer om achtergrondkleuring te minimaliseren.Verwijder tot slot de blokkeringsoplossing. Incubeer het weefsel vervolgens gedurende twee uur bij kamertemperatuur onder agitatie in 500 µL secundair antilichaam, verdund in blokkeringsoplossing. Herhaal de wasstappen met 1 mL blokkeringsoplossing drie keer gedurende 10 minuten en twee keer gedurende 30 minuten.Spoel ten slotte het weefsel met één milliliter PBS om het detergens te verwijderen. Verwijder voorzichtig alle PBS en bedek het weefsel onmiddellijk met 50 microliters monteermiddel. Draag de ovaria met een pipet met een afgeknipt tipje voorzichtig over naar een objectglas.Scheid elke ovariole volledig onder een stereomicroscoop met behulp van fijne pincetten. Verwijder het verbindingsweefsel aan de posterieure zijde en de eikamers in stadium 14 (of rijpe eikamers), zodat de jonge, transparante eikamers aan de binnenzijde overblijven. Lijn de eikamers met de pincet zorgvuldig uit, zodat ze elkaar niet overlappen.Plaats langzaam een glasdekglaasje van nummer 1,5 op de monsters en laat het montagemedium gedurende enkele uren bij kamertemperatuur polymeriseren. Kit de randen af met transparante nagellak en beeld de monsters af, of bewaar ze bij vier graden Celsius in het donker tot ze nodig zijn. De preparaten kunnen ongeveer twee weken worden bewaard.Visualiseer de coupes onder een confocale microscoop met een 63x olie-immersie objectief en leg driedimensionale Z-stack beelden van het eierstokweefsel vast. De hier getoonde drosophila-ovariolen vertonen de typische opeenvolgende ontwikkelingsstadia van eikamers van anterior naar posterior. Confocale beelden tonen EdU-kleuring van de punctate structuur geassocieerd met mitochondriën, waarbij is bevestigd dat EdU wordt ingebouwd in het MT-DNA en de kernen tijdens drosophila-oogenese.Hier wordt de replicatie van het mtDNA in het germarium van de drosophila gevisualiseerd door EdU-incorporatie in aanwezigheid van de nucleaire DNA-polymeraseremmer aphidicoline. Onder deze omstandigheden blijkt de nucleaire incorporatie van EdU verminderd te zijn, en werden veel puncta binnen de mitochondriën gelokaliseerd. In afwezigheid van behandeling met aphidicoline wordt mtDNA-replicatie op een zeer laag niveau gedetecteerd in het germarium van de drosophila.Een confocale sectie van een wildtype germarium vertoont een intense EdU-incorporatie in de kernen, waarbij MT DNA-puncta nauwelijks detecteerbaar zijn. Wanneer wildtype germaria worden behandeld met een mitochondriële ontkoppelaar, FCCP, bij verschillende concentraties, raakt de MT DNA-replicatie verstoord. Dit wordt bevestigd door een afname van de EdU-kleuring, zoals te zien is bij de behandelingen van twee micromolair, vijf micromolair en 10 micromolair.Na het volgen van deze procedure kan een eenvoudige kwantificering van de replicatie van mitochondriaal DNA onder diverse genetische en farmacologische condities worden uitgevoerd.

in-situ-labeling-mitochondrial-dna-replication-drosophila-adult

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en een hoge resolutie beeldvorming in...

Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

We ontwikkelden een gevoelige techniek om nieuw gesynthetiseerde mitochondriaal DNA (mtDNA) label in individuele cellen om mtDNA biogenese studeren. De techniek combineert de integratie van onderwijs, samen met een tyramide signaalversterking (TSA) protocol om mtDNA replicatie te visualiseren in subcellulaire compartimenten van neuronen.

Visualisatie van mitochondriaal DNA-replicatie in afzonderlijke cellen door Edu signaalversterking

De kinetochoor is waar de SAC initieert het signaal het toezicht op de mitotische segregatie van de zuster chromatiden. Een methode wordt beschreven om de werving en de omzet van een van de kinetochoor eiwitten en de coördinatie te visualiseren met het chromosoom beweging...

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytieel Embryo&#39;s

Hier beschrijven we een techniek die wordt gebruikt om genomisch DNA te visualiseren in vaste, intacte nematoden. De video bevat een voorbeeldprotocol om chromatine te tellen in onbevruchte C. elegans-oöcyten.

Ethanolfixatie en DAPI-kleuring: een methode om DNA in C. elegans te visualiseren

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

We presenteren protocollen voor het verzamelen, voorbereiden en beeldvorming van volwassen Drosophila eicellen. Deze methoden maken de visualisatie van chromosoomgedrag en spindelassemblage en -functie tijdens meiose mogelijk.

Technieken voor Imaging prometaphase metafase van de meiose I in Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

Analyse van de structureel-functionele relatie van de mitochondriën is vereist voor een grondig begrip van de regulerende mechanismen van de functionele werking van mitochondriën. Specifieke methoden voor het bestuderen van de structuur en functie van mitochondriën in levende en gefixeerde Drosophila eierstokken worden in dit artikel beschreven en gedemonstreerd.

Het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in Drosophila Eierstokken

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

Hier presenteren we een protocol voor de visualisatie, detectie, analyse en tracking van endogene mRNA-handel in levende Drosophila melanogaster Eier kamer met behulp van moleculaire bakens, draaiende schijf confocale microscopie en open-source analyse Software.

Visualisering en opvolging van endogene Mrna's in levende Drosophila melanogaster Eier kamers

Het doel van dit protocol is om celdeling in intact weefsel te analyseren door levende en vaste celmicroscopie met drosophila meiotic spermatocyten. Het protocol laat zien hoe hele, intacte teelballen van Drosophila larven en vroege poppen te isoleren, en hoe ze te verwerken en te monteren voor microscopie.

Voorbereiding van Drosophila Larval en Pupal Testes voor analyse van celafdeling in levend, intact weefsel

Celcyclusanalyse met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) en fosfo-histon H3 (pH3) etikettering is een procedure in meerdere stappen die uitgebreide optimalisatie kan vereisen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat alle stappen voor deze procedure beschrijft, inclusief beeldanalyse en kwantificering om cellen in verschillende celcyclusfasen te onderscheiden.

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol voor celcyclusprogressieanalyse in drosophila neurale stamcellen

Leer mitochondriaal DNA-replicatie labelen in Drosophila eierstokken met Edu-kleuring. Deze methode behoudt weefselstructuur en helpt onderzoekers bij het bestuderen van mitochondriale overerving.

In Situ Labeling van mitochondriaal DNA-replicatie in Drosophila volwassen Eierstokken van Edu kleuring

Meer video's verkennen