Name: Een grondige fysiologische analyse van Defined Cell Populaties in Acute Tissue Slices van de Muis Vomeronasal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Leer elektrofysiologische analyse van sensorische neuronen in acute weefselsneden van het vomeronasale orgaan van de muis. Deze methode onthult mechanismen van chemosensatie in hun natuurlijke omgeving.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Ivan Rodriguez en Benoit von der Weid voor het genereren van de FPR-rs3-i-venus muislijn, hun constructieve kritiek en vruchtbare discussies. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Volkswagen Foundation (I/83533), de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) en door de Excellence Initiative van de Duitse federale en deelstaatregeringen. MS is een Lichtenberg Professor van de Volkswagen Foundation.

Alle dierlijke procedures waren in overeenstemming met de lokale en EU-wetgeving inzake de bescherming van dieren die voor experimentele doeleinden (Richtlijn 86/609 / EEG) en met aanbevelingen van de Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Beide C57BL / 6 muizen en Fpr-RS3-i-Venus muizen werden gehuisvest in groepen van beide geslachten bij kamertemperatuur op een 12 uur licht / donker cyclus met voedsel en water ad libitum beschikbaar. Voor experimenten jongvolwassenen (6-20 weken) van beide geslachten werden gebruikt. Geen duidelijke geslacht afhankelijke verschillen werden waargenomen. 1. Oplossing Voorbereiding <ol><li> Bereid extracellulaire oplossing S 1: 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethaansulfonzuur (HEPES) gebufferde extracellulaire oplossing die (in mM) 145 NaCl, 5 KCI, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES; pH = 7,3 (ingesteld met NaOH); osmolariteit = 300 mOsm (ingesteld met glucose). </li><li> Bereid extracellular oplossing S 2: carbogen-geoxygeneerde (95% O2, 5% CO2) extracellulaire oplossing die (in mM) 125 NaCl, 25 NaHCO3, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgSO 4, 5 BES; pH = 7,3; osmolariteit = 300 mOsm (ingesteld met glucose). </li><li> Bereid 4% lage geleringstemperatuur agarose oplossing (S 3) voor het weefsel inbedding: 4% lage geleringstemperatuur agarose. Los 2 g laag-gelerende agarose in 50 ml S 1 in een 100 ml glazen fles laboratorium met een magnetische roerder. Om de agarose te smelten, zet de fles in een waterbad (met deksel niet goed gesloten) bij 70 ° C gedurende ongeveer 20 minuten of totdat oplossing wordt transparant onder roeren. Afkoelen en bewaar gesmolten agarose in een tweede waterbad bij 42 ° C tot verder gebruik. </li><li> Bereid intracellulaire oplossing S 4: Pipetteer oplossing die (in mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl2 (vrij Ca2 + = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7,1 (ingesteld met KOH); osmolariteit = 290 mOsm. </li><li> Wijzig / afstellen samenstelling S 1, S2 en S4 volgens de individuele proefopzet (bijvoorbeeld farmacologische blokkers bepaalde spanning geactiveerde stromen isoleren). </li></ol> 2. Workspace Voorbereiding <ol><li> Vul zuurstof slice opslagkamer met S 2 ten minste 30 min voorafgaand aan dissectie, plaats op het ijs voor de temperatuur en pH-aanpassing en zuurstofhoudende oplossing continu. </li><li> Vul reservoir voor slice superfusieapparaat bij opname setup met S 2 en zuurstof continu. </li><li> Voorafgaand aan de dissectie, vul vibratome kamer met S 2 en schik crushed ijs rond de kamer. Alternatief: breng reserveonderdelen ijskoude zuurstofrijk oplossing van zuurstof kamer in vibratome kamer en houden continu zuurstof. </li><li> Schik chirurgische gereedschappen en materialen. </li><li> Plaats ijs gel-pak onder ontledenmicroscoop, dek af met een papieren handdoek te voorkomen VNO weefsel van vriezen bodem van de schaal. </li><li> Schoon scheermesje door kort spoelen met 70% ethanol en gedestilleerd water en monteren op vibratome. Vervang voor elke snijden sessie. </li></ol> 3. VNO Dissection and Embedding <ol><li> Sacrifice dierlijke korte blootstelling aan CO 2 en onthoofden met een scherpe chirurgische schaar. Opmerking: Als de tijd van offeren het dier brengen VNO capsule op ijs kritisch, zo kort mogelijk duurt minder dan 2 minuten. Weefsel levensvatbaarheid behouden insluiten beide volledig ontleed VNOs in agarose in minder dan 30 minuten. </li><li> Verwijder de onderkaak met grote chirurgische schaar. Voer via de mondholte en snijd de onderkaak botten en spieren van iedere kant apart verder. </li><li> Plaats het resterende deel van de kop ondersteboven in de grote petrischaal. </li><li> Weg te trekken van de huid van de bovenkaak en rond de punt van de neus met medium tang om een ​​betere toegang tot het krijgensnijtanden. </li><li> Met been schaar weggesneden het grootste deel van de snijtanden op ~ 45 ° hoek in het rostrale richting (figuur 1A). Dit zal het verwijderen van de VNO capsule uit de neusholte verlichten. Opmerking: niet aan de wortel van de tand gesneden om schade aan de punt van de VNO capsule voorkomen. </li><li> Pak de starre gehemelte op zijn rostrale deel met medium pincet en zorgvuldig schil terug in een stuk op een vlakke hoek (Figuur 1B). Opmerking: Herhaaldelijk spoelen met ijskoude S 2. </li><li> Gebruik micro veer schaar om de botfusie snijden tussen het uiteinde van de vomer bot en de kaak. Plaats de schaar uiteinden van het gebogen deel van de punt naar buiten weg van het VNO voorzichtig snijd het bot in kleine stappen aan de linker- en rechterzijde lateraal van de VNO capsule. </li><li> Om de VNO capsule verwijderen, gebruikt micro voorjaar een schaar door de vomer bot te snijden in het caudale deel en til de vomer bot uit de nasal holte met behulp van medium tang. VNO onmiddellijk over een petrischaaltje onder een stereomicroscoop op een ijs gelpack waarbij de resterende stappen van de dissectie wordt uitgevoerd. </li><li> Spoel de VNO in een kleine hoeveelheid ijskoud S 2 om het weefsel uitdroogt. </li><li> Scheid de kraakbeen capsules die de VNO zachte weefsels bevatten door grijpen de achterkant van de vomer bot met medium tang. Plaats de capsule voor een dorsale weergave, zodat een splitsing tussen beide VNOs zichtbaar (figuur 1D i). </li><li> Gebruik de punt van fijne tang om zowel kraakbeen scheiden VNO capsules van de centrale bot terwijl de vomer bot vastgepind op het achterste deel. Opmerking: Gebruik een tang alleen aan de rand van het kraakbeen capsule en heel voorzichtig zijn niet te doorboren het kraakbeen als de delicate sensorische epitheel gemakkelijk beschadigd. </li><li> Wanneer de twee VNOs gescheiden, beginnen met het verwijderen van de inkapseling van het kraakbeen sparrent VNO. </li><li> Pak de bovenrand van de capsule met een fijn pincet en split weg het kraakbeen muur die eerder was verbonden aan de vomer bot (mediale zijde). </li><li> Om de resterende kraakbeen draai de VNO met zijn gebogen laterale zijde naar de bodem van de schaal en veilig vastpinnen het kraakbeen aan de ene kant behulp van een tang te verwijderen. Beweeg voorzichtig de tweede fijne tang van achter op een zeer vlakke hoek tussen kraakbeen en VNO de verbinding tussen weefsel en kraakbeen los. </li><li> Langzaam schil de VNO weg van het kraakbeen door vast te houden aan zijn staartvin tip, om te voorkomen dat schade aan de sensorische epitheel. </li><li> Zodra de VNO is levered uit de capsule, zorg ervoor dat alle resterende kleine kraakbeen onderdelen te verwijderen als alle resterende stukjes kraakbeen zal het weefsel los te maken uit de omliggende agarose tijdens het snijden proces. </li><li> Plaats een druppeltje ijskoude S 2 op de eerste ontleed VNO weefselschade voorkomen. Een groot bloedvat aan de laterale zijde will zichtbaar aangeven dat het orgaan nog steeds intact en werd niet beschadigd tijdens de grove dissectie (Figuur 2A ii). Indien het bloedvat beschadigd raakt, zal het nog steeds zinvol door te gaan met snijden VNO zolang de totale morfologie niet duidelijk verminderd. </li><li> Onmiddellijk ontleden de tweede VNO. </li><li> Om de VNOs insluiten, vult zowel kleine petrischaaltjes tot de rand met gesmolten S 3 (opgeslagen in een waterbad bij 42 ° C, zie 1.3). </li><li> Houd het VNO aan het bredere staarteinde met fijne tang om schade aan de sensorische epitheel voorkomen. </li><li> Dompel het VNO in de agarose en beweeg het horizontaal heen en weer meerdere malen om de film van extracellulaire oplossing en luchtbellen uit het oppervlak te verwijderen. </li><li> Plaats de VNO verticaal met de staart punt met uitzicht op de bodem van de schaal. In plaats van het knijpen de VNO met de tang rechtstreeks, aan te passen oriëntatie door het verplaatsen van de tang tip in nauwe Proximity naar de VNO. Opmerking: Oriëntatie tijdens de inbedding is van cruciaal belang omdat het bepaalt slice vliegtuig en de toegankelijkheid van sensorische neuronen tijdens het experiment. </li><li> Plaats de gerechten op gel ice-pack en wacht tot agarose is gestold. Opmerking: Verander niet VNO oriëntatie nadat de agarose is begonnen stollen, omdat dit het weefsel los te maken van de omringende agarose. </li></ol> 4. coronale VNO Tissue Snijdende <ol><li> Gebruik maken van kleine spatel om agarose blok van de kleine schotel in de deksel van een grote petrischaal te verwijderen, draait u de agarose ondersteboven het verlaten van het caudale uiteinde van de VNO naar boven. </li><li> Snijd het blok in een piramidale vorm met een chirurgisch scalpel (3-4 mm bij de punt, 8-10 mm onderaan). Zorg ervoor dat u de ingebed weefsel beschadigen. </li><li> Gebruik superlijm de piramidevormige blok vast aan het midden van de vibratome specimen plaat en wacht ~ 1 min voor de lijm goed drogen. </li><li> Transfer preparaatplateau aan het snijden cHamber en de voorbereiding van de tweede VNO dienovereenkomstig. Houd plaat met de tweede monster bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> Gebruik een vibreerblad microtoom met de volgende instellingen: dikte: 150-200 pm; snelheid: 3,5 au = 0,15 mm / sec; frequentie: 7.5 au = 75 Hz. Transfer plakken aan zuurstof kamer tot gebruik na een korte inspectie van slice morfologie onder de microscoop ontleden. Segmenten kunnen worden bewaard verscheidene uren. </li></ol> 5. Single-cell elektrofysiologische Recordings <ol><li> Voor opnamen Gebruik rechtop vaste fase microscoop met water immersie doelstellingen Dodt of infrarood differentieel storende contrast (IR-DIC) en epi-fluorescentie en een gekoelde CCD-camera. Voor data-acquisitie, gebruik maken van een patch-clamp versterker, hoofd podium, AD / DA-interface board en een PC (met inbegrip van opname-software). </li><li> Bereid een voorraad van 10-20 patch pipetten (4-7 MQ). Pull pipetten van borosilicaatglas haarvaten (1,50 mm OD / 0,86 mm ID) usinga micropipet trekker en vuur-polijsten met een microforge. Opmerking: Fire polijsten van de pipet tips is van cruciaal belang bij het patchen van de vrij kleine VSNs. Dit helpt voorkomen dat breken de celmembraan bij de toepassing van negatieve druk teneinde een hoge weerstand afdichting te verkrijgen. Na het polijsten van de pipet opening moet ongeveer 1 micrometer zijn. </li><li> Houd pipetten in een pipet opslag pot om schade en stofophoping tot gebruik te voorkomen. </li><li> Bereid perfusie-systeem door het invullen oplossing reservoirs en leidingen volgens experimenteel ontwerp. Opmerking: Verwijder luchtbellen uit een buis helemaal omdat ze sterk zullen verstoren elektrofysiologische opnames. </li><li> Bandenspanning tot ~ 3 ml / min debiet realiseren. Opmerking: De hoge druk zal beweging van het weefsel slice, alsmede de beëindiging van elektrofysiologische opnames veroorzaken. </li><li> Transfer VNO slice om beeldvorming kamer en bevestig de slice positie met behulp van roestvrij staal anker bedraad met 0,1 mm dik synthetic vezels (Figuur 2B - C). Opmerking: Bedek het weefsel slice met een van de synthetische vezel draden, maar de agarose rond de slice. </li><li> Transfer beeldvorming kamer om de opname setup en continu superfuse slice met zuurstofrijk S 2 bij kamertemperatuur via een bad applicatie. </li><li> Stel de zuigkracht capillair aan het oppervlak van de oplossing tot een langzame zuig voortdurende uitwisseling van badoplossing creëren. Pas de 8-in-1 multi-barrel &quot;perfusie pencil&quot; boven en vlakbij de niet-sensorische deel van het VNO segment dat het bloedvat (figuur 2C, 3A) 50 bevat. Het is gunstig voor perfusie potlood en opname pipet regelen te zijn geconfronteerd met de slice vanuit tegengestelde richtingen. </li><li> Sluit referentie-elektrode en badoplossing met een L-vormige agar brug (gevuld met 150 mM KCl). </li><li> Vul patch pipet met pipet oplossing S 4. </li><li> Monteer de pipet over de zilver-chloride gecoate patch elektrode aangesloten op het hoofd podium zonder afschrapen van de coating en sluit goed aan. </li><li> Oefen lichte positieve druk (ongeveer 1 ml op een 10 ml plastic spuit) om de patch pipet voor het invoeren van het bad. </li><li> Laat de pipet in het bad met behulp van micro manipulatoren ver genoeg om de doelstelling dompelen zonder te raken (figuur 2D). </li><li> Monitor pipet weerstand (R pip, tussen 4-7 MQ) met behulp van elektrofysiologie software aangesloten op het hoofd podium. Opmerking: Als R pip is &lt;4 MQ het glas tip is gebroken. Als R pip&gt; 10 MQ, is de punt waarschijnlijk verstopt en de pipet worden vervangen. </li><li> Visualiseer de VNO slice met een CCD-camera met behulp van infrarood-geoptimaliseerde differentieel interferentie contrast (DIC) en identificeren van FPR-RS3-i-Venus expressie brengen (of soortgelijk label neuronen) met behulp van fluorescentie-verlichtingen een geschikte filter kubus. </li><li> Focus en doel fluorescerende of niet-fluorescerende cellen afhankelijk van experimenteel ontwerp. </li><li> Om de cel lichaam benaderen, gebruiken de hand wielen voor maximale gevoeligheid. Als gevolg van positieve druk, een kleine deuk in de cel soma membraan wordt zichtbaar zodra de pipet tip is in de nabijheid. </li><li> Los positieve druk en oefen lichte onderdruk voor het aanzuigen van de celmembraan om een ​​hoge weerstand afdichting (1-20 GQ) krijgen. Toepassen korte en zachte zuigkracht aan het celmembraan verstoren en stelt de gehele celconfiguratie. </li><li> Monitor toegang weerstand constant tijdens experiment. Opmerking: Alleen onder andere neuronen vertonen kleine en stabiele toegang tot resistentie (≤3% van de R-ingang; verandering &lt;20% in de loop van het experiment) in de analyse. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

VNO is een chemosensory structuur die feromonen detecteert. Tot op heden zijn de meeste receptoren vomeronasale nog worden deorphanized er maar weinig receptor-ligand paren geïdentificeerd. Van deze werd V1rb2 beschreven specifiek worden geactiveerd door de mannelijke urine feromoon 2-heptanon 30, V2rp5 worden geactiveerd door de mannelijke specifieke feromoon ESP1 57 en V2r1b en V2rf2 worden geactiveerd door de MHC peptiden SYFPEITHI 48 en SEIDLILGY 58, respectievelijk. Een v...

De meeste dieren zijn sterk afhankelijk van hun chemische zintuigen te communiceren met hun omgeving. Reukzin speelt een essentiële rol voor het vinden en evalueren van voedsel, vermeden roofdieren en lokaliseren geschikt koppelen partners. In de meeste zoogdieren, het olfactorische systeem bestaat uit ten minste vier anatomisch en functioneel verschillende perifere subsystemen: het belangrijkste reukepitheel 1,2, de Grueneberg ganglion 3,4, het septum orgaan van Masera 5,6 en het vomeronasale orgaan. De VNO bestaat uit de perifere sensorische structuur van het accessoire olfactorische systeem (AOS), die een belangrijke rol bij het ​​opsporen van chemische signalen dat de informatie over de identiteit, gender, sociale rang en seksuele staat 7-10 te brengen speelt. VNO is gelegen aan de voet van het neustussenschot recht boven het gehemelte. Bij muizen is een bilaterale-blind eindigende buis ingesloten in een kraakbeenachtige capsule 11-13. Het orgel bestaat uit zowel een halvemaanvormige mediale zintuiglijke epithelium de VSNs herbergt en een niet-sensorische gedeelte aan de zijkant. Tussen beide epithelia ligt een slijm gevulde lumen die is verbonden met de neusholte via de smalle vomeronasaal leiding 14. Een grote laterale bloedvaten in de niet-sensorische weefsel verschaft een vasculaire pompmechanisme opneming van relatief grote, niet vluchtige moleculen zoals peptiden of kleine eiwitten in het VNO lumen onderdruk 15,16 vergemakkelijken. De onderdelen van de VNO aanwezig bij de geboorte en het orgaan volwassen grootte bereikt kort voor de puberteit 17. Echter, of het knaagdier AOS is al functioneel bij jongeren is nog steeds onderwerp van discussie 18-20. VSNs onderscheiden zich door zowel hun epitheliale locatie en het type receptor uiten ze. VSNs tonen een bipolaire morfologie met gemyeliniseerde axon en een apicale dendriet dat uitsteekt naar de lumen en eindigt in een microvilli dendritische knop. VSN bijlons fasciculate de vomeronasal zenuw die de kraakbeenvissen capsule bij de dorso-caudale schutbladen, stijgt langs het septum, passeert de zeefvormige plaat en projecten om de accessoire olfactorische bulb (AOB) 21,22 vormen. De vomeronasal sensorische epitheel bestaat uit twee lagen: het apicale laag zich dichter bij het luminale kant en havens zowel V1R- en alle behalve één type FPR-rs-expressie neuronen. Deze neuronen coexpress de G-eiwit α-subeenheid G αi2 en project aan het voorste deel van de AOB 23-25. Sensorische neuronen gelegen in de meer basale laag uitdrukkelijke V2Rs of FPR-RS1 naast G ao en sturen hun axonen naar het achterste deel van de AOB 26-28. Vomeronasal neuronen worden waarschijnlijk geactiveerd door vrij klein feromonen 29-33 (V1Rs) of proteïneachtige verbindingen 34-38 (V2Rs) die worden uitgescheiden in verschillende lichaamsvloeistoffen zoals urine, speeksel en traanvocht 37,39-41 </sup&gt;. In situ experimenten hebben aangetoond dat VSNs ook worden geactiveerd door geformyleerde peptiden en diverse antimicrobiële / inflammatie-gekoppelde verbindingen 25,42. Bovendien heteroloog tot expressie FPR-rs eiwitten delen agonist spectra met FPRs uitgedrukt in het immuunsysteem, wat wijst op een mogelijke rol als detectoren voor ziekte in soortgenoten of bedorven voedsel bronnen 25 (zie referentie 43). Fundamenteel belang voor het begrijpen van receptor-ligand relaties en downstream signaling cascades in specifieke VSN populaties is een gedetailleerde evaluatie van hun fundamentele biofysische kenmerken in een natuurlijke omgeving. In het verleden heeft de analyse van cellulaire signalering sterk geprofiteerd van genetisch gemodificeerde dieren met een bepaalde populatie van neuronen markeren door co-expressie van een fluorescent merkereiwit 30,44-49. In dit protocol, een transgene muis lijn die FPR-RS3 uitdrukt samen met een fluorescente marker (Fpr-RS3-i-Venus) wordt gebruikt.Deze werkwijze illustreert hoe een dergelijke genetisch gemodificeerde muizenstam gebruiken om elektrofysiologische analyse van een optisch herkenbare celpopulatie via één neuron patch-clamp acute coronale VNO weefselplakjes voeren. Een luchtdruk aangedreven multi-barrel perfusie-systeem voor zintuiglijke prikkels en farmacologische middelen zorgt voor een snelle, omkeerbare en focale neuronale stimulatie of inhibitie tijdens de opnames. Whole-cell opnames in slice voorbereidingen zorgen voor een gedetailleerde analyse van de intrinsieke eigenschappen, voltage-geactiveerde conductances, evenals actiepotentiaal ontlading patronen in de cel van de eigen omgeving.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose (low-gelling temperature)</td><td>PeqLab</td><td>35-2030</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Mg-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Na-GTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03564</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Surgical tools and consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large Petri dish, 90 mm</td><td>VWR</td><td></td><td>decapitation, dissection of VNO capsule</td></tr><tr><td>Small Petri dish, 35 mm</td><td>VWR</td><td></td><td>lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose</td></tr><tr><td>Sharp large surgical scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>decapitation, removal of lower jaw</td></tr><tr><td>Strong bone scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>cutting incisors</td></tr><tr><td>Medium forceps, Dumont tweezers #2</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>removing skin and palate</td></tr><tr><td>Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>cutting out VNO&nbsp;</td></tr><tr><td>Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>dissecting VNO out of cartilaginous capsule</td></tr><tr><td>Small stainless steel spatula</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>handling agarose block and tissue slices</td></tr><tr><td>Surgical scalpel</td><td></td><td></td><td>cutting agarose block into pyramidal shape</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>HEKA Elektronik</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID)</td><td>Science Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC360FX</td><td></td></tr><tr><td>Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515</td><td>Leica Microsystems</td><td>I3</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence lamp</td><td>Leica Microsystems</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate magnetic stirrer</td><td>Snijders</td><td>34532</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator Device&nbsp;</td><td>Luigs &amp; Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller, vertical two-step</td><td>Narishige</td><td>PC-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>CSM DM 6000 SP5</td><td></td></tr><tr><td>Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug)</td><td>Quest Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>HCX APO L20x/1.00 W</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronik</td><td>TDS 1001B</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer&nbsp;</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat 030</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system 8-in-1</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH Meter five easy</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette storage jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>e212</td><td></td></tr><tr><td>Recording chamber&nbsp;</td><td>Luigs &amp; Neumann</td><td>Slice mini chamber</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Wilkinson Sword GmbH</td><td>Wilkinson Sword Classic</td><td></td></tr><tr><td>Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments)</td><td>custom-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>S4E</td><td></td></tr><tr><td>Trigger interface&nbsp;</td><td>HEKA Elektronik</td><td>TIB-14 S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT 1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Water bath&nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNB 45</td><td></td></tr></tbody></table>

een grondige fysiologische analyse van defined cell populaties in acute tissue slices van de muis vomeronasal

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Bij de meeste zoogdieren is het vomeronasale orgaan (VNO) een chemosensorische structuur die zowel hetero- als conspecifieke sociale signalen detecteert. Vomeronasale sensorische neuronen (VSN's) drukken een specifiek type G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) uit vanuit ten minste drie verschillende chemoreceptorgenfamilies, waardoor een gevoelige en specifieke detectie van chemosensorische signalen mogelijk is. Deze families omvatten de V1r en V2r genfamilies, evenals de formylpeptide receptor (FPR)-gerelateerde sequentie (Fpr-rs) familie van vermeende chemoreceptorgenen. Om de fysiologie van de interacties tussen vomeronasale receptor-ligand en downstream signalering te begrijpen, is het essentieel om de biofysische eigenschappen te identificeren die inherent zijn aan elke specifieke klasse van VSN's.
De hier beschreven fysiologische aanpak maakt identificatie en diepgaande analyse mogelijk van een gedefinieerde populatie sensorische neuronen met behulp van een transgene muislijn (Fpr-rs3-i-Venus). Het gebruik van dit protocol is echter niet beperkt tot deze specifieke lijn en kan dus gemakkelijk worden uitgebreid naar andere genetisch gemodificeerde lijnen of wilde dieren.

Om inzicht te krijgen in de biofysische en fysiologische eigenschappen van gedefinieerde celpopulaties, voeren we acute coronale plakjes weefsel van de muis VNO (Figuur 1-2). Na dissectie, kan segmenten in ijskoude geoxygeneerde extracellulaire oplossing (S 2) worden gehouden gedurende enkele uren. Bij de opname setup, een constante uitwisseling met vers zuurstofrijk-oplossing (figuur 2D) zorgt voor levensvatbaarheid van het w...

Hier beschrijven we een fysiologische aanpak die identificatie en diepgaande analyse van een gedefinieerde populatie van sensorische neuronen in acute coronale weefselsneden van het vomeronasale orgaan van de muis mogelijk maakt, met behulp van opnames met gehele cel patch-clamp.

Een grondige fysiologische analyse van Defined Cell Populaties in Acute Tissue Slices van de Muis Vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van elektrofysiologische analyse van individuele cellen uit een gedefinieerde populatie sensorische neuronen in acute weefselsneden van het vomeronasale orgaan van de muis. Deze methode kan helpen bij het verduidelijken van kernvragen op het gebied van chemosensatie, zoals de mechanismen van chemische detectie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze cellen, door registraties uit te voeren bij sensorische neuronen in acute weefselsneden, in hun natuurlijke omgeving kunnen worden onderzocht.Om deze procedure te starten, verwijdert u na het offeren van het dier de onderkaak door een grote chirurgische schaar in de mondholte in te brengen en de mandibula-beenderen en spieren aan elke zijde afzonderlijk door te knippen. Verwijder vervolgens met een medium pincet de huid van de bovenkaak en rond de neuspunt om een betere toegang tot de snijtanden te krijgen. Gebruik daarna de beenschaar om het grootste deel van de snijtanden in een hoek van 45 graden in rostrale richting af te knippen, om de verwijdering van het VNO-kapsel uit de neusholte te vergemakkelijken.Snijd de wortel van de tand niet door om beschadiging aan de punt van het VNO-kapsel te voorkomen. Pak vervolgens het rigide harde gehemelte aan het rostrale deel vast met een medium pincet en pel dit voorzichtig in één stuk terug onder een vlakke hoek. Spoel de neusholte herhaaldelijk met ijskoude oplossing S2. Gebruik daarna microschaartjes om de botuitstulping tussen de punt van het vomerbot en de kaak door te snijden.Voer de scharenpunten in met het gebogen gedeelte van het VNO afgekeerd. Snijd het bot voorzichtig in kleine stappen aan zowel de linker- als de rechterzijde, lateraal van het VNO-kapsel. Om het VNO-kapsel te verwijderen, snijdt u door het vomerbot aan het caudale uiteinde en tilt u het vomerbot voorzichtig uit de neusholte met behulp van een medium pincet.Breng het VNO onmiddellijk over naar een kleine petrischaal onder een stereomicroscoop op een ice gel pack, waar de resterende stappen van de dissectie moeten worden uitgevoerd. Spoel het VNO vervolgens af met een kleine hoeveelheid ijskoud S2 om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt. Scheid daarna de kraakbeencapsules die de zachte weefsels van het VNO bevatten door de achterkant van het vomer-bot vast te pakken met een medium pincet.Positioneer hiervoor de capsule voor een dorsaal aanzicht, zodat de splitsing tussen beide VNO's zichtbaar wordt. Gebruik de punt van een fijne pincet om beide kraakbeencapsules van de VNO te scheiden van het centrale bot, terwijl het vomerbot aan het achterste gedeelte vastgepind blijft. Zorg ervoor dat de mediale kraakbeenwand die eerder aan het vomerbot was bevestigd, wordt verwijderd.Gebruik bij het verwijderen van kraakbeen rond het VNO pincetten uitsluitend aan de rand van de kraakbeenkapsel. Wees zeer voorzichtig om het delicate sensorische epitheel niet te beschadigen. Om het resterende kraakbeen te verwijderen, draait u het VNO met de gebogen laterale zijde naar de bodem van de schaal en zet u het kraakbeen aan één zijde stevig vast met een pincet.Verplaats vervolgens voorzichtig de tweede fijne pincet vanaf de achterzijde in een zeer flauwe hoek tussen het kraakbeen en het VNO om de verbinding tussen het weefsel en het kraakbeen los te maken. Om beschadiging van het sensorisch epitheel te voorkomen, wordt het VNO langzaam van het kraakbeen afgepeld door het aan de caudale punt vast te houden. Zodra het VNO uit het kapsel is gewipt, worden alle overgebleven kleine kraakbeendelen verwijderd, aangezien eventuele resterende stukjes kraakbeen het weefsel tijdens het snijden kunnen losmaken van de omringende agarose.Plaats vervolgens een kleine druppel ijskoude S2 op het eerste gedissecteerde VNO om weefselschade te voorkomen. Om de VNO's in te bedden, vult u beide kleine petrischalen tot de rand met gesmolten S3. Dompel daarna elk VNO in de agarose en beweeg het meerdere keren horizontaal heen en weer om de film van extracellulaire oplossing en eventuele luchtbellen van het oppervlak te verwijderen. Positioneer het VNO verticaal, met de rostrale punt naar de bodem van de schaal gericht.Plaats vervolgens beide schaaltjes op een koelelement en wacht tot de agarose is gestold. Verander de oriëntatie van het VNO niet zodra de agarose begint te stollen, omdat dit het weefsel los kan maken van de omringende agarose. Gebruik bij deze procedure een kleine spatel om het agaroseblok uit het kleine schaaltje in het deksel van een grote petrischaal te plaatsen en draai de agarose om, zodat de rostrale tip van het VNO naar boven wijst.Snijd vervolgens het blok met een chirurgisch scalpel in een piramidevorm, waarbij u er zorg voor draagt dat het ingebedde weefsel niet beschadigd raakt. Gebruik daarna secondelijm om het piramidevormige blok in het midden van de monsterplaat van de vibratoom te bevestigen. Wacht ongeveer één minuut tot de lijm volledig is opgedroogd.Snijd het preparaat in coupes met een dikte van 150 tot 200 micrometer. Inspecteer kort de morfologie van de coupes onder de dissectiemicroscoop. Breng vervolgens alle coupes over naar de oxygenatiekamer tot aan het gebruik.In deze stap wordt een VNO-snede naar de beeldkamer overgebracht en wordt de positie van de snede vastgezet met roestvrijstalen ankers die zijn verbonden met synthetische vezels van 0,1 mm dik. Bedek het weefselsnede niet met de synthetische vezeldraden. Verplaats vervolgens de beeldkamer naar de registratieopstelling en superfuseer de snede continu met oxygenatie S2 bij kamertemperatuur.Pas de zuigcapillair aan aan het oppervlak van de oplossing om een constante uitwisseling van de badoplossing te creëren. Plaats vervolgens de eight-in-one multi-barrel profusiepen boven en dicht bij het niet-sensorische deel van de VNO-slice dat het bloedvat bevat. Sluit daarna de referentie-elektrode en de badoplossing aan met behulp van de L-vormige agarbrug gevuld met 150 millimolar kaliumchloride.Vul vervolgens de patchpipet met pipetoplossing S4. Bevestig de pipet stevig over de met zilverchloride gecoate elektrode die is aangesloten op de headstage, zonder de coating af te schrapen. Oefen vervolgens een lichte positieve druk uit op de patchpipet voordat deze in het bad wordt geplaatst. Controleer de pipet en zorg ervoor dat de weerstand tussen 4 MΩ en 10 MΩ ligt.Visualiseer de VNO-coupe met een CCD-camera met behulp van infrarood-geoptimaliseerde DIC, en identificeer FPR-rs3 i-Venus-expresserende cellen of vergelijkbaar gelabelde neuronen met fluorescentieverlichting en een geschikte filterkubus. Benader het cellichaam met behulp van handwielen voor maximale gevoeligheid. Vanwege de positieve druk wordt een kleine inkeping in het membraan van het cellichaam zichtbaar zodra de pipetpunt zich in directe nabijheid bevindt.Laat vervolgens de positieve druk los en breng een lichte negatieve druk aan om het celmembraan aan te zuigen, teneinde een hoog-resistente afsluiting (seal) van 1 tot 20 gigaohms te verkrijgen. Pas daarna korte en zachte zuigkracht toe om het celmembraan te doorbreken en de whole cell-configuratie te vestigen. In deze figuur laat een confocale afbeelding van een coronale VNO-weefselsnede de distributie van fluorescente FPR-rs3 Tau Venus-positieve neuronen in het vomeronasale sensorische epitheel zien.De FPR-rs3 Tau Venus-positieve neuronen vertonen een enkele apicale dendriet die eindigt in een knobbelachtige structuur aan de luminale grens. Hier worden de whole-cell patch-clamp opnames getoond die zijn uitgevoerd vanaf het soma van de VSN. Hier zijn de representatieve traces van whole-cell patch-clamp opnames van een TTX-gevoelige, snel activerende natriumstroom in FPR-rs3-positieve VSN's.Voltage step-registraties onder controlecondities onthullen een spanningsafhankelijke, snelle en transiënte binnenwaartse stroom. Behandeling met TTX bij één micromolaire concentratie vermindert de stroom sterk. En het hier getoonde digitaal gesubtraheerde spoor onthult de TTX-gevoelige spanningsgestuurde natriumstroom.De representatieve current clamp-registraties tonen depolarisatie, hyperpolarisatie en reeksen actiepotentialen die worden opgewekt door stapsgewijze positieve en negatieve stroominjectie. Zodra de techniek onder de knie is, kan het volledige dissectie- en weefselsnijproces voor beide VNO's in ongeveer één uur worden voltooid. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals extracellulaire loose patch-registraties of calcium-imaging, worden uitgevoerd om de doorvoer te verhogen bij het analyseren van grotere populaties neuronen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u acute weefselcoupes maakt van het vomeronasale orgaan in de mond, en hoe u elektrofysiologische registraties van enkele cellen uitvoert bij vomeronasale sensorische neuronen.

in-depth-physiological-analysis-defined-cell-populations-acute-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Multielectrode array (MEA) opnames een methode voor het bestuderen van de elektrische activiteit van grote groepen neuronen. Hier presenteren we de details van een MEA voorbereiding om op te nemen van de muis vomeronasale epitheel, terwijl tegelijkertijd het stimuleren van het weefsel.

Multielectrode Array Opnames van de Vomeronasal Epithelium

Bij muizen, is de mogelijkheid om feromonen te detecteren hoofdzakelijk gemedieerd door de vomeronasale orgaan (VNO). Hier is een acute weefsel stuk voorbereiding van VNO voor het uitvoeren van calcium beeldvorming beschreven. Deze fysiologische aanpak maakt het mogelijk waarnemingen van subpopulaties en / of individuele neuronen in een levend weefsel en is handig voor het receptor-ligand identificatie.

Imaging Feromoon Sensing in een muis Vomeronasal Acute Tissue Slice Voorbereiding

De vomeronasale orgaan (VNO) detecteert intraspecies chemische signalen dat de sociale en reproductieve informatie over te brengen. Wij hebben Ca2 + imaging experimenten met transgene muizen die G-CaMP2 in VNO weefsel. Deze aanpak stelt ons in staat om de ingewikkelde reactie patronen van de vomeronasale neuronen te analyseren om een ​​groot aantal feromonen stimuli.

Imaging neuronale responsen bij Slice Bereidingen van Vomeronasal Het uiten van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

This video outlines the isolation of a mouse vomeronasal organ (VNO) and tissue preparation for vibratome sectioning. Sections are used to characterize the biophysical and physiological attributes of a specific group of sensory neurons.

Preparation of Mouse Vomeronasal Organ for Vibratome Sectioning

This video demonstrates electrophysiological recording of olfactory sensory neurons (OSNs) in mice using a perforated patch-clamp technique. The olfactory epithelium, containing OSNs with fluorophore-tagged odor receptors, is isolated from a mouse and secured in a recording chamber. A recording pipette is clamped to the dendritic knob of an OSN, and nystatin within the pipette perforates the membrane to form electrical connectivity with the cell. Finally, another pipette is used to deliver an...

Perforated Patch-Clamp Recording of Olfactory Sensory Neurons in Mice

The protocol video describes establishing a whole-cell patch clamp for electrophysiological recording from the sensory neurons of the vomeronasal organ (VNO) in mice. A coronal VNO slice with fluorescently labeled sensory neurons is placed in a recording setup. A labeled neuron is patched with a recording pipette in a whole-cell configuration for electrophysiological recording in response to chemical stimuli.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from Vomeronasal Sensory Neurons

Een effectieve Manual Uitbenerij methode om Intact Mouse neusweefsel bereiden met Bewaarde Anatomische Organisatie

De muis accessoire reukbol (AOB) is moeilijk te bestuderen in de context van zintuiglijke codering. Hier tonen we een dissectie dat een ex vivo preparaat waarin AOB neuronen blijven functioneel verbonden met hun perifere ingangen, het vergemakkelijken van onderzoek naar de informatieverwerking van de muis feromonen en kairomonen produceert.

Ex Vivo Bereidingen van de Intact Vomeronasal en accessoires bulbus olfactorius

Het analyseren van de fysiologische eigenschappen van olfactorische sensorische neuronen kent nog steeds technische beperkingen. Hier registreren we ze door middel van perforated patch-clamp in een intacte voorbereiding van het olfactorische epitheel in gene-targeted muizen. Deze techniek maakt de karakterisering mogelijk van membraaneigenschappen en reacties op specifieke liganden van neuronen die gedefinieerde olfactorische receptoren tot expressie brengen.

Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor

Dit artikel biedt een gestroomlijnd protocol voor de dissectie en dissociatie van muizen olfactorisch epitheel met het oog op single-nucleus RNA-sequencing.

Snelle dissectie en dissociatie van het reukepitheel van de muis voor suspensies met één kern

Leer elektrofysiologische analyse van sensorische neuronen in acute weefselsneden van het vomeronasale orgaan van de muis. Deze methode onthult mechanismen van chemosensatie in hun natuurlijke omgeving.

Een grondige fysiologische analyse van Defined Cell Populaties in Acute Tissue Slices van de Muis Vomeronasal

Meer video's verkennen