Een grondige fysiologische analyse van Defined Cell Populaties in Acute Tissue Slices van de Muis Vomeronasal
10 september 2016
Hier beschrijven we een fysiologische aanpak die identificatie en diepgaande analyse van een gedefinieerde populatie van sensorische neuronen in acute coronale weefselsneden van het vomeronasale orgaan van de muis mogelijk maakt, met behulp van opnames met gehele cel patch-clamp.
Het algemene doel van deze procedure is om een elektrofysiologische analyse van enkele cellen uit te voeren op een gedefinieerde populatie sensorische neuronen in acute weefselsneden van het vomeronasale orgaan van een muis. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van chemosensatie te verduidelijken, zoals de mechanismen van chemische detectie. Het grote voordeel van deze techniek is dat door opnames te maken van sensorische neuronen in acute weefselsneden, deze cellen kunnen worden onderzocht in hun natuurlijke omgeving.
Om met deze procedure te beginnen, verwijder na het doden van het dier zijn onderkaak door een paar grote chirurgische scharen door de mondholte in te brengen en de kaakbeenderen en spieren aan elke kant afzonderlijk door te snijden. Verwijder vervolgens de huid van de bovenkaak en rond de punt van de neus met een middelste pincet, om betere toegang tot de snijtanden te krijgen. Gebruik vervolgens de botschaar om het grootste deel van de snijtanden weg te snijden in een hoek van 45 graden in de rostrale richting om de verwijdering van de VNO-capsule uit de neusholte te vergemakkelijken.
Snijd de wortel van de tand niet door om schade aan de punt van de VNO-capsule te voorkomen. Grijp vervolgens het stijve bovenste gehemelte bij het rostrale deel met een middelste pincet en pel het zorgvuldig in één stuk op een platte hoek. Spoel de navelholte herhaaldelijk met ijskoud oplossing S2. Gebruik vervolgens microveertang om het boteffusie tussen de punt van het vosbeen en de kaak te snijden.
Plaats de schaarpunten met de gebogen kant weg van de VNO. En snijd voorzichtig in kleine stappen het bot aan zowel de linker- als rechterkant, lateraal aan de VNO-capsule. Om de VNO-capsule te verwijderen, snij door het vosbeen in het caudale gedeelte en til het vosbeen voorzichtig uit de neusholte met behulp van een middelste pincet.
Breng de VNO onmiddellijk over naar een kleine petrischaal onder een stereomicroscoop op een ijsgelpakket, waar de resterende stappen van de dissectie moeten worden uitgevoerd. Spoel vervolgens de VNO in een kleine hoeveelheid ijskoud S2, om uitdroging van het weefsel te voorkomen. Scheid vervolgens de kraakbeenscapsules die de zachte weefsels van de VNO bevatten door de achterkant van het vosbeen met een middelste pincet vast te grijpen.
Positioneer de capsule voor een dorsale weergave zodat een spleet tussen beide VNO's zichtbaar wordt. Gebruik de punt van een fijne pincet om beide kraakbeenscapsules van het centrale bot te scheiden, terwijl het vosbeen aan de achterste kant vast wordt gehouden. Zorg ervoor dat de mediale kraakbeenswand die eerder aan het vosbeen was bevestigd, wordt verwijderd.
Gebruik bij het verwijderen van kraakbeen rond de VNO alleen pincet aan de rand van de kraakbeenscapsule. En wees voorzichtig om het delicate sensorische epitheel niet te beschadigen. Om resterend kraakbeen te verwijderen, draai de VNO met zijn gebogen laterale zijde naar de bodem van de schaal en zet het kraakbeen aan één kant stevig vast met behulp van pincet.
Verplaats vervolgens de tweede fijne pincet van de achterkant op een zeer platte hoek tussen kraakbeen en VNO om de verbinding tussen weefsel en kraakbeen los te maken. Om beschadiging van het sensorische epitheel te voorkomen, pel de VNO voorzichtig los van het kraakbeen door deze bij de caudale punt vast te houden. Zodra de VNO uit de capsule is geheveld, verwijder alle resterende kleine kraakbeendelen, omdat eventuele resterende stukjes kraakbeen het weefsel van de omringende agarose zullen losmaken tijdens het snijproces.
Plaats vervolgens een kleine druppel ijskoud S2 op de eerste gedissekteerde VNO om weefselbeschadiging te voorkomen. Om de VNO's in te bedden, vul beide kleine petrischalen tot aan de rand met gesmolten S3. Dompel vervolgens elke VNO in agarose en beweeg deze horizontaal heen en weer om de film van extracellulaire oplossing evenals eventuele luchtbellen van het oppervlak te verwijderen. Plaats de VNO verticaal, met de rostrale punt naar de bodem van de schaal gericht.
Plaats vervolgens beide schalen op een geldijspakket en wacht tot de agarose is gestold. Verander de oriëntatie van de VNO niet zodra de agarose is begonnen te stollen, omdat dit het weefsel losmaakt van de omringende agarose. Gebruik in deze procedure een kleine spatel om de agaroseblok van de kleine schaal in de deksel van een grote petrischaal te verwijderen en draai de agarose ondersteboven, waarbij de rostrale punt van de VNO naar boven gericht blijft.
Snijd vervolgens het blok in een piramidale vorm met behulp van een chirurgisch scalpel en zorg ervoor dat het ingebedde weefsel niet wordt beschadigd. Gebruik vervolgens superlijm om het piramidevormige blok op het midden van de vibratoomplaat te bevestigen. Wacht vervolgens ongeveer een minuut totdat de lijm volledig is opgedroogd.
Snijd het specimen in secties van 150 tot 200 micrometer dik. Inspecteer kort de snede morfologie onder de dissecterende microscoop. Breng vervolgens alle snijsels over naar de zuurstofkamer tot gebruik.
In deze stap brengt u een VNO-snede over naar de beeldvormingskamer en bevestigt u de snedepositie met behulp van een roestvrijstalen ankerdraad met punten van één milometer dikke synthetische vezels. Bedek het weefselsnede niet met een van de synthetische vezeldraden. Breng vervolgens de beeldvormingskamer over naar de opnameopstelling en superfuseer de snede continu met geoxideerde S2 bij kamertemperatuur.
Pas de zuigkapillaris aan op het oppervlak van de oplossing om een constante uitwisseling van badoplossing te creëren. Pas vervolgens de acht-in-één multivatproefpotlood boven en dicht bij het niet-sensorische deel van de VNO-snede aan die het bloedvat bevat. Verbind vervolgens de referentie-elektrode en badoplossing met behulp van de L-vormige agarbrug gevuld met 150 millimolar kaliumchloride.
Vul vervolgens de patchpijp aan met pipoplossing S4. Monteer de pijp over het zilverchloride gecoate elektrode verbonden met de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een fysiologische benadering voor het identificeren en analyseren van sensorische neuronen in het muis-vomeronasale orgaan met behulp van opnames met whole-cell patch-clamp. De methode maakt een diepgaande elektrofysiologische analyse mogelijk in acute weefselsneden, wat inzicht biedt in chemosensatiemechanismen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Fysiologie
- Chemosensatie
Achtergrond
- Het vomeronasale orgaan is cruciaal voor het detecteren van feromonen en andere chemische signalen.
- Het begrijpen van de functie van sensorische neuronen kan mechanismen van chemische detectie onthullen.
- Whole-cell patch-clamp opnames maken een gedetailleerde analyse van neuronale activiteit mogelijk.
- Acute weefselsneden behouden de native omgeving van de neuronen.
Doel van het onderzoek
- Om elektrofysiologische analyse van afzonderlijke sensorische neuronen uit te voeren.
- Om mechanismen van chemosensatie te verduidelijken.
- Om de functionaliteit van sensorische neuronen in hun native omgeving te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van acute coronale weefselsneden van het muis-vomeronasale orgaan.
- Whole-cell patch-clamp opnames om neuronale activiteit te analyseren.
- Zorgvuldige chirurgische technieken om toegang te krijgen tot het vomeronasale orgaan.
- Analyse van sensorische neuronreacties op chemische stimuli.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van specifieke populaties sensorische neuronen in het vomeronasale orgaan.
- Inzicht in de elektrofysiologische eigenschappen van deze neuronen.
- Demonstratie van de voordelen van het gebruik van acute weefselsneden voor analyse.
- Bijdragen aan het begrijpen van de mechanismen van chemische detectie.
Conclusies
- De methode biedt een robuust kader voor het bestuderen van sensorische neuronen.
- Bevindingen verbeteren de kennis van chemosensorische mechanismen.
- Toekomstig onderzoek kan op deze benadering voortbouwen om verdere vragen in het veld te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables precise electrophysiological characterization of defined neuronal populations in native tissue, supporting target validation in chemosensory drug discovery. By preserving physiological context, it enhances predictive confidence in early-stage screening of compounds targeting GPCR-mediated pathways. The approach aids mechanistic de-risking for targets involved in social behavior, stress response, and neuroendocrine regulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of specific chemosensory neuron subtypes expressing defined GPCR repertoires.
- Operational Value: Supports target de-risking through direct measurement of neuronal excitability and signal transduction in native tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a physiologically relevant platform for assessing ligand-induced activity in primary sensory neurons.
- Operational Value: Enables standardized electrophysiological readouts for compound screening in acute slices.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker alignment by linking receptor activation to downstream neuronal firing patterns.
- Operational Value: Supports continuity from target hit validation to preclinical functional assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional validation of chemosensory targets prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of receptor-ligand interactions in native neuronal populations.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible electrophysiological outputs for compound effect assessment.
- Analytics: Generates voltage- and current-clamp data to characterize neuronal response kinetics and threshold properties.
- Translational Research: Links electrophysiological phenotypes to chemosensory function for predictive modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for profiling multiple chemosensory receptor systems across genetically defined models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence through direct measurement of native neuronal physiology.
- Operational Value: Promotes assay reproducibility via standardized slice preparation and recording conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives from non-physiological systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chemosensory targets based on functional validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, tissue dissection, and fluorescence-guided cell identification.
- Dependent on vibratory microtome, patch-clamp amplifier, and perfusion system for slice viability.
- Necessitates standardized oxygenated artificial cerebrospinal fluid and temperature control for consistent results.
- Adaptation to other chemosensory systems depends on availability of genetically labeled neuronal lines.
- Limited throughput constrains large-scale screening but supports secondary validation of hits from high-throughput assays.
