Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Het algemene doel van dit Affinity Capture Protocol is om endogene eiwitcomplexen te isoleren uit zoogdiercellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de cel- en moleculaire biologie, zoals welke eiwitten samen tot fysiek gekoppelde functionele modules vormen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat talrijke fysieke interacties geassocieerd met het doeleiwit tegelijkertijd kunnen worden waargenomen.

Laat één tot acht gram cellen groeien zoals beschreven in het tekstprotocol. Giet het groeimedium af in een grote beker. Plaats vervolgens de kweekschaal op ijs in een grote rechthoekige ijspan.

Voeg 20 milliliter ijskoud 1x fosfaat-gebufferd zout, of PBS, toe aan de kweekschaal en laat de cellen los van de schaal met behulp van een grote cellskraper. Breng de cellen over naar een 50 milliliter buisje dat vooraf op ijs is gekoeld. Voeg nog eens 10 milliliter ijskoud 1x PBS toe aan dezelfde schaal.

Verzamel de resterende cellen en breng ze over naar het 50 milliliter buisje. Herhaal dit proces voor elke schaal. Celsuspensies van verschillende schalen kunnen worden gecombineerd om het aantal monsters en kunststof afval te verminderen.

Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende vijf minuten bij 1.000 x g in vier graden Celsius. Giet na de centrifugatie voorzichtig het supernatant af. Breng elke pellet opnieuw op in tien milliliter ijskoud 1x PBS.

Consolideer de opnieuw opgezette pellets tot maximaal vijf per 50 milliliter buisje. Was de lege buisjes met 10 milliliter PBS. Voeg de oplossing toe aan de geconsolideerde monsters en centrifugeer zoals eerder beschreven.

Na het verwijderen van het supernatant, breng de pellet opnieuw op in 10 milliliter ijskoud 1x PBS. Verwijder de plunjer van een 20 milliliter spuit en zet deze opzij. Sluit de mond van de spuit af, plaats de spuit in een 50 milliliter buisje en breng de celsuspensie daar over.

Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1000 x g, vier graden Celsius. Aspireer het supernatant met een fijne pipettepunt die is bevestigd aan een vacuümsysteem totdat de bovenste laag cellen begint te worden opgezogen. Dit resulteert in een nat celpelletje.

Open de spuit, steek de plunjer in en druppel de cellen direct in een grote plastic beker gevuld met vloeibare stikstof die wordt gehouden in een vloeibare stikstofbad in een styrofoambox. Duw de resterende cellen uit de spuit. Giet vervolgens de bevroren cellen in 50 milliliter buisjes.

Doe de buisjes losjes dicht om overtollig vloeibare stikstof te laten verdampen. Houd ze een nacht bij 80 graden Celsius. Draai de doppen de volgende dag helemaal vast.

De bevroren cellen kunnen op deze manier worden bewaard bij 80 graden Celsius tot cryomilling. Verwijder de celkorrels uit de vriezer bij 80 graden Celsius en plaats ze in een 50 milliliter buisjehouder in een vloeibare stikstofbad. Koel een 50 milliliter potje, twee 20 millimeter kogels en het potdeksel vooraf af in een schone rechthoekige ijspan met vloeibare stikstof.

Koel ook een PTFE-isolator vooraf af. Gebruik een set pucks of een manchet-en-puck. Zet het juiste tegengewicht op de molen.

Plaats met behulp van een pincet de twee vooraf gekoelde 20 millimeter malende kogels en de bevroren cellen in het vooraf gekoelde malende potje. Voeg vloeibare stikstof toe tot het potje halfvol is, doe het deksel op het potje en breng de constructie over naar de molen. Klem de constructie op zijn plaats en voer drie malencycli uit, met een programma van 400 tpm, drie minuten, elke minuut omgekeerde rotatie en geen intervalpauze.

Het is van cruciaal belang om de ballen te horen ratelen tijdens het malen, dit geeft aan dat de ballen botsen en het materiaal verpulveren. Als dit geluid niet wordt gehoord, betekent dit dat er niet wordt gemalen. Na voltooiing van drie malencycli, verplaats het potje terug naar vloeibare stikstof en laat het even rusten om af te koelen.

Verwijder voorzichtig het deksel. Verwijder de kogels met behulp van een pincet en breng het poeder over naar een vooraf gekoeld 50 milliliter buisje met behulp van een vooraf gekoelde spatel. Merk op dat het toevoegen van vloeibare stikstof aan het potje kan helpen om poeder dat op de kogels is aangekoekt los te maken.

Voor de bereiding van celextract, weeg 100 milligram celpoeder af in een vooraf gekoeld 1,5 of twee milliliter microfugebuisje. Taar een analytische weegschaal met het lege microfugebuisje. Doe het celpoeder in het buisje met behulp van een vloeibare stikstof gekoelde lepel of spatel.

Controleer de massa van het poeder dat in het buisje is gedispenseerd op de analytische weegschaal voordat u het buisje terugbrengt naar vloeibare stikstof. Open het buisje met celpoeder en laat het een minuut staan op kamertemperatuur om de druk in het buisje vrij te maken en om te voorkomen dat de extractiebuffer onmiddellijk bevriest wanneer deze aan het poeder wordt toegevoegd. Voeg 400 microliter extractiebuffer toe, aangevuld met proteaseremmers, aan het buisje.

Vortex het buisje kort en houd het daarna op ijs. Gebruik een microtip-ultrasoon apparaat om het monster een korte laag-energie puls te geven en eventuele aggregaten te verspreiden. Klaar het extract door centrifugatie.

Verwijder vervolgens het supernatant en ga verder met de affiniteit van het vangen. Om het affiniteit medium voor te wassen, plaats de buisjes met antilichaam-gekoppelde paramagnetische kralen op de magneet. De kralen zullen zich binnen enkele seconden aan de zijkant van het buisje ophopen, waardoor de opslagoplossing kan worden verwijderd.

Voeg vervolgens 500 microliter extractiebuffer toe aan de kralen. Vortex kort op gemiddelde snelheid om te mengen. Draai de buisjes in een minicentrifuge om alle inhoud naar de