Name: Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen Ustilago maydis Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Leer genetische manipulatie van Ustilago maydis voor functionele karakterisering van genen en fenotypische analyse. Deze methode maakt precieze verificatie van modificaties mogelijk voor onderzoek naar schimmelinfecties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Met speciale dank aan Dr. Benedikt Steuten voor kritische lezing van het manuscript. Het originele werk op het chitinasen werd uitgevoerd door Dr. Thorsten Langner uitgevoerd. Het laboratorium van VG wordt ondersteund door de Cluster of Excellence in Plant Sciences (CEPLAS, DFG EXC 1028) en BioSC, wordt het laboratorium van KS ondersteund door BioSC. KB wordt ondersteund door BioSC. De wetenschappelijke activiteiten van de bio-economie Science Center (BioSC) werden financieel ondersteund door het ministerie van Innovatie, Wetenschap en Onderzoek in het kader van de NRW Strategieprojekt BioSC (nr 313 / 323-400-00213). LF wordt ondersteund door een doctoraatsbeurs van de DFG International Research Training Group 1525 iGRADplant.

1. Generatie van deletieconstructen <ol><li> Genereren van een plasmide dat de deletie construct (Figuur 1) omvattende een respectievelijk 1 kb stroomopwaartse flank (UF) en stroomafwaartse flank (DF) elk en de juiste weerstand geflankeerd door bot snijden restrictieplaatsen. OPMERKING: klonen strategie kan worden gebruikt (voor het klonen zie referentie 22) bevelen wij Golden Gate klonen voor dergelijke plasmiden 9. </li><li> Accijnzen de schrapping te construeren van het plasmide met een stomp mes tot 1 ug DNA van de deletie te verkrijgen construeren 9. Zuiveren de schrapping construct enzym te elimineren en buffer 22 bijvoorbeeld door het gebruik van commerciële reagentia en volg de instructies van de fabrikant. NB: De vector backbone kan in de transformatie mengsel blijven. </li></ol> 2. Bereiding van protoplasten OPMERKING: Houd steriele omstandigheden tijdens alle momenten van de eXperiment. De celwand is een sterke beschermende barrière voor de toegang van moleculen tot het plasmamembraan beperkt. Om opname van het DNA dat de deletie construct mogelijk maken, de celwand moet worden verwijderd celwand afbrekende enzymen in een protoplasting reactie. Kritische stappen in protoplastbereiding zijn 1) osmotische stabilisatie van het medium en 2) het voorkomen van mechanische belasting van de protoplasten. <ol><li> Cijfer 2 ml buizen met ronde bodem de protoplasten bevriezen en koelen ze op bij -20 ° C. Start een pre-cultuur in 3 ml Yeps-Licht van een nieuwe plaat van de stam met de gewenste genetische achtergrond. Incubeer op een roterend wiel gedurende 24 uur bij 28 ° C. LET OP: De stam kan de solopathogenic stam SG200 10, wild-type stammen, tester stammen zoals AB33 23, of een mutant achtergrond voor de generatie van de dubbele mutanten zijn. Controleer de spanning vrij is van de gewenste weerstand. </li><li> Verdun de cultuur in 50 ml Yeps-Light in een verbijsterd flask en incubeer op een orbitale schudder bij 28 ° C met 200 rpm. LET OP: De verdubbeling is ongeveer 2 uur voor wildtype stammen. Laat drie duplicaties minimum. </li><li> Groeien tot exponentiële fase. Waarborgen dat de optische dichtheid, gemeten bij een golflengte van 600 nm (OD 600), ongeveer 0,8 (0,6-1,0 zijn). Een OD 600 van 1,0 komt overeen met ongeveer 1 tot 2 x 10 7 U. maydis cellen per ml. </li><li> Controleer de cellen voor besmetting onder een microscoop. Gebruik 40x vergroting. Pellet de cellen van de volledige 50 ml kweek gedurende 5 min, 1500 x g en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 25 ml natriumcitraat, sorbitoloplossing (SCS), centrifugeer 5 min, 1500 x g en verwijder het supernatant. OPMERKING: De bacteriële besmettingen kunnen worden geïdentificeerd als kleine en vaak ontroerende cellen. Schimmels verontreinigingen kunnen worden geïdentificeerd op basis van een andere cel vorm of afmeting vergeleken met de sigaar gevormde cellen U. maydis. </li><li> tijdens het centrifugation bereiden protoplasting oplossing (12,5 mg / ml Trichoderma lyserende enzymen, in SCS, bereidt 3 ml per celpellet; Filter steriliseer door een 22 urn filter; oplossing vers optimale enzymatische activiteit te zijn). SCS is een osmotische stabilisator breuk van protoplasten na verwijdering van de celwand te verhinderen. </li><li> Resuspendeer de pellet in 2 ml protoplasting oplossing. Incubeer gedurende 5 tot 20 minuten bij kamertemperatuur en laat onder de microscoop tot 30 tot 40% van de cellen zijn rond of dergelijke speldekoppen (figuur 2). OPMERKING: Voer alle stappen op het ijs van nu af aan en greep protoplasten met zorg! </li><li> 3x wassen in 10 ml koude (4 ° C) SCS, centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de pellet in 10 ml koude sorbitol, TrisHCl, CaCl2 oplossing (STC), draaien op 1000 g gedurende 5 min, gooi supernatant. Resuspendeer de pellet in 1 ml koud STC, maken 100 ul fracties in de gekoelde buizen. Bevries de porties bij -80 ° C tot verder gebruik.</li></ol> 3. Transformatie van U. maydis LET OP: De transformatie van U. maydis protoplasten gebaseerd op polyethyleenglycol (PEG) gemedieerde transformatie werkwijze die technisch eenvoudig en tegen elektroporatie of biolistische transformatie vereist geen gespecialiseerde apparatuur. <ol><li> Bereid de twee lagen selectie platen (2 platen per transformatie reactie). De onderlaag bevat het antibioticum in een concentratie verdubbeld. Pipetteer 12 ml van RegLight bevattende 400 ug / ml hygromycine (of 300 ug / ml nourseothricin of 4 ug / ml carboxin of 1 mg / ml G418) in een petrischaal. Vermijd bubbels. OPMERKING: Onderlaag platen kunnen worden opgeslagen een paar dagen bij 4 ° C, maar bereid de bovenlaag pas tijdens de transformatie (zie hieronder). </li><li> Dooi protoplasten op ijs (1 tube / transformatie). Voeg 1 ul heparine (15 mg / ml). Voeg 1 ug DNA (gelineariseerd construct) of 10 gl H 2 </sub&gt; O (water control). Incubeer gedurende 10 min op ijs. </li><li> Gedurende deze tijd, de bovenlaag verdeeld 12 ml vloeibaar RegLight (koken en afkoelen tot 60 ° C) op de RegLight bodemplaat. LET OP: Deze laag heeft geen antibiotica bevatten. </li><li> Voeg 500 gl STC / PEG (polyethyleenglycol) aan de transformatie buis (3 2) en meng voorzichtig door het buisje. Incubeer 15 min op ijs. </li><li> Verdeel elke transformatie reactie op twee van de twee lagen RegLight platen. Verspreid voorzichtig en langzaam met een glazen pipet. Incubeer de platen rechtop bij 28 ° C gedurende 5 tot 7 dagen tot transformanten groeien als kolonies. Het verkrijgen van ongeveer 100-200 kolonies per plaat. OPMERKING: Lagere waarden kan worden veroorzaakt door &quot;slechte&quot; protoplasten die ofwel bevatten te veel celwand en daarom niet opnemen DNA of kunnen regenereren. De eerste kan worden getest door transformatie met een zelf-replicerend plasmide, betwisting per regeneratie testen op platen zonder antibiotica. </li> &lt;li&gt; Bereid Yeps-Light platen die het geschikte antibioticum bij 200 ug / ml hygromycine (of 150 ug / ml nourseothricin of 2 ug / ml carboxin of 500 ug / ml G418, deze concentratie gelijk helft van die waarmee bodemplaten). Opnieuw zuiveren ten minste 24 vermeende transformant kolonies op deze platen. Enkele kolonies worden verkregen. Tegelijkertijd streak uit de oorspronkelijke druk op niet-selectieve media. OPMERKING: Platen kunnen 1-2 weken worden bewaard bij 4 ° C. </li></ol> 4. Controle van de juiste verwijdering Events OPMERKING: De mutaties worden geverifieerd een drietrapsprocedure (figuur 1). Enerzijds kandidaten die de wildtype kopie van het gen bevatten, worden uitgesloten PCR. Ten tweede is de integratie van de resistentiecassette in de locus geverifieerd door PCR. Ten derde is de integratie van de resistentie cassette uitsluitend in de gewenste locus geverifieerd door Southern blot analyse. Zorgvuldige stam verificatie is essential, zodat mutante fenotypes echt correleren met de schrapping. <ol><li> Eerste Diagnostic PCR 20 <ol><li> Ontwerp primers koppelen aan het gen te verwijderen die leiden tot een product van 250-600 bp (Figuur 1). Dergelijke kleine producten gemakkelijk te amplificeren in een kolonie PCR en lang genoeg voor detectie in standaard gelelektroforese. </li><li> Voor elke kandidaat en de originele stam als positieve controle resuspendeer een beetje (hoeveelheid van een speldekop) celmateriaal van een enkele kolonie met een tandenstoker in 20 gl 0,02 M NaOH. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. OPMERKING: Gebruik verse kolonies. Als de platen zijn ouder dan 1 week re-streak tot een nieuwe kolonie te verkrijgen. </li><li> Met 1 pl van de celsuspensie voor de PCR onmiddellijk. Voer een standaard PCR reactie en analyseren resulterende fragmenten. Opmerking: Deze monsters kunnen niet worden opgeslagen. LET OP: Deze PCR-test op de aanwezigheid van de wild-type-gen en daardoor maakt snelle identificatie van negatieve candidates waarin het gen van interesse niet vervangen. Klonen waarbij bands in deze PCR reactie zal worden weggegooid. Een dergelijke negatieve kloon dient immers mee als extra negatieve controle worden uitgevoerd. Kandidaten zonder PCR product verder worden geanalyseerd. Genen zonder nadelige gevolgen ongeveer de helft van de kandidaten moet het wildtype gen bevatten, terwijl de andere helft niet resulteren in een band. Dit zou overeenstemmen met een homologe recombinatie van 50%. </li></ol></li><li> Tweede Diagnostische PCR <ol><li> Bereiding van genomisch DNA. OPMERKING: Genomisch DNA (gDNA) kunnen worden bereid met twee verschillende protocollen. De eerste betreft giftige reagentia zoals fenol en chloroform en dus mag alleen door ervaren onderzoekers (in 4.2.1.1 beschreven 4.2.1.5), terwijl de tweede ook door minder ervaren studenten (in 4.2.1.6 beschreven 4.2 kunnen worden behandeld worden behandeld. 1.11). Beide protocollen worden betrouwbaar werken. Stap 4.2.1.1 is identiek voor beide protocOLS. <ol><li> Inoculeer 5 ml Yeps-Light met elke kandidaat en incubeer op een roterend wiel gedurende 24 uur bij 28 ° C. Drop 2 pl van de kweek op een CM plaat. Houd de cultuur steriel. LET OP: Na is een standaard protocol (LET OP: giftig stappen). </li><li> Doe 1 lepel (~ 200 pl) van HCl-gewassen glazen kralen tot 2 ml buizen. Voeg 2 ml van de U. maydis cultuur. Spin 12.000 xg gedurende 5 minuten. Gooi supernatant (pellet kan worden ingevroren in dit stadium). Voeg 500 ul fenol / chloroform / isoamylalcohol (25: 24: 1) aan de pellet. VOORZICHTIGHEID! Fenol GIFTIG! </li><li> Voeg 500 ul Usti-lysis-buffer 1. Schud gedurende 6-10 minuten op een Vibrax bij 1000 rpm. Controleer of de cel pellet volledig geresuspendeerd, maar vermijd verlengde schudden om afschuiven van de gDNA te voorkomen. Spin bij 12.000 xg gedurende 15 min. Transfer 400 ul van de waterige fase in de nieuwe reactiebuis (niet de interfase raken). </li><li> Voeg 1 ml 100% (v / v) ethanol. Keren de tube 3x te mengen, let op de cluid DNA dat kort weergegeven. Spin bij 12.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en wassen met 200 pi 70% EtOH. Laat de pellet in dit stadium niet mengen. </li><li> Verwijder supernatant volledig (niet laten de pellet volledig drogen). Voeg 50 ul TE / RNase. Ontbinden gDNA door schudden bij 400 tpm bij 50 ° C gedurende 10 minuten. Analyseer 2 pi van de gDNA op een 0,8% agarosegel 20. OPMERKING: De volgende stappen omvatten een alternatieve niet-toxisch protocol. </li></ol></li><li> Alternatieve bereiding van genomisch DNA <ol><li> Doe 1 lepel (~ 200 pl) van HCl glasparels gewassen tot 2 ml buizen. Voeg 2 ml van de U. maydis cultuur en draaien op 12.000 xg gedurende 5 minuten. Gooi supernatant (pellets worden ingevroren in dit stadium). </li><li> Voeg 500 ul lysisbuffer Usti 2 aan de pellet. Schud gedurende 5 tot 15 minuten op een Vibrax bij 1000 rpm. Controleer of de cel pellet volledig geresuspendeerd. </li><li> Incubeer de buizen bij 65 ° C gedurende 15 tot 20 min. Met behulp voorkomendgeval incubators bedoeld voor het hosten 2 ml buisjes is van cruciaal belang. Dan, plaats het op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 100 ul 8 M kaliumacetaat, vortex of invertsuiker 8 tot 10 keer. Spin 12.000 xg gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Overdracht 500 pi van het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buis en voeg 400 pl isopropanol. Vortex invertsiropen 8 tot 10 keer. Spin 12.000 xg gedurende 15 min. Verwijder supernatant en was met 500 pl 70% EtOH. Spin 12.000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Losweken bovendrijvende helemaal! Uiteindelijk, voeg kort centrifugeren (10 sec) om resterende vloeistof te verwijderen. Laat de DNA pellet drogen 3-5 minuten. Voeg 50 ul TE / RNase en incubeer bij 50 ° C gedurende 10 tot 15 minuten bij 400 rpm. </li></ol></li><li> PCR <ol><li> Ontwerp twee primerparen met een van hen bindende buiten de flanken en de corresponderende binding binnen de resistentiecassette (UF-f, RC-R, RC-f, DF-r, Figuur 1) 9. </li><li> Met 1 pl van een 1:10 verdunning van de gDNA elke cKANDIDAAT als een sjabloon in 2 PCR reacties verificatie van de juiste installatie upstream en downstream 9. </li><li> Gebruik standaard PCR-reacties voor elke kandidaat en analyseren van resulterende fragmenten 22. Opmerking: Deze PCRs testen voor het inbrengen van de resistentie cassette in de juiste genomische locus. Als producten worden verkregen voor beide partijen, de kandidaat is waarschijnlijk een correct inbrengen. Echter ook kandidaten wanneer slechts één zijde (stroomopwaarts of stroomafwaarts) worden bevestigd worden meegenomen voor verdere analyse bij de PCR-reacties die gewoon niet één flank. </li></ol></li></ol></li><li> Controle van de juiste Genomic Insertion door Southern Blot Analyse 22 <ol><li> Digest 15 pl gDNA (4.2.1) van de mutant gegadigden met corresponderende wildtype / progenitor stam met een geschikt enzym dat knipt buiten de locus / bouwen en bovendien snijdt hetzij in het gen of de resistentie cassette leidt tot duidelijk distinguishable patronen (figuur 1) 8. OPMERKING: Geen van de verwachte band moet groter zijn dan 10 kb, zodat ze duidelijk van gedigereerde DNA. </li><li> Gebruik de upstream en downstream flank als probes. Om ze te labelen bijvoorbeeld gebruik maken van de PCR DIG labeling Kit of een soortgelijke standaard methode. Meng de gelabelde probes in een 1: 1 moleculaire ratio en het uitvoeren van de Southern blot. Houd ten minste twee onafhankelijke juiste transformanten. LET OP: De wildkleur patroon moet duidelijk waarneembaar in de oorspronkelijke stam en de juiste klonen mag alleen de verwachte bands bevatten. Extra banden alleen aanwezig in de andere kandidaten geven inserties van het construct in een verkeerde locus. Dergelijke klonen moet worden weggegooid. De negatieve kandidaat die in de eerste diagnostische PCR zou de wild-type banden en de banden (onvoorspelbare in grootte) van het wederrechtelijk geïntegreerde verwijdering construct bevatten. </li></ol></li><li> glycerol Stocks OPMERKING: Glycerol voorraden dienen om de klonen te behouden voor de komende jaren in stam collecties. Ten minste twee onafhankelijke transformanten te bewaren voor elke mutant. Dit maakt het vergelijken fenotypes die identiek moeten zijn. <ol><li> Groeien 5 ml kweken van de bevestigde mutante stammen Yeps-Light op een roterend wiel gedurende 24 uur bij 28 ° C Mix 500 pi van elke cultuur met 500 pi NSY-glycerol-medium. Omkeren buis tot cultuur en medium zijn goed gemengd. Glycerol in het medium voorkomt de vorming van ijskristallen. </li><li> Invriezen bij -80 ° C. Re-streak een deel van de bevroren cultuur om te testen of de voorraad is functioneel. </li></ol></li></ol> 5. Microscopische fenotypes <ol><li> Groeien 5 ml culturen van wildtype en mutante stammen Yeps-Light op een roterend wiel gedurende 12 uur bij 28 ° C. </li><li> De volgende dag, verdunnen de cultuur tot een OD 600 van ongeveer 0,1 en groeien tot een OD 600 tussen 0,5 en 0,7. Een OD 600 van 1,0 correspconden tot ongeveer 1 tot 2 x 10 7 U. maydis cellen per ml. </li><li> Inspecteer de cel morfologie microscopisch. LET OP: Gezonde cellen blijken sigaar vormige (Figuur 4, WT). Uitgesproken vacuolen of vorming filament aangeven dat de cellen zijn benadrukt. Opmerking: Afhankelijk van het verwachte mutante fenotype, kan de analyse worden aangepast, bijvoorbeeld wanneer reporter stammen worden gebruikt om de geschikte test kan in dit stadium worden uitgevoerd. Als celmorfologie wijzigt statistische analyse worden uitgevoerd, bijvoorbeeld de lengte gemiddelde cel bepalen. </li></ol> 6. Infectie Assay LET OP: De zaailing infectie assay is eerder gevisualiseerd in dit tijdschrift 11. Het kan zowel met behulp van een haploïde, solopathogenic stam achtergrond zoals SG200 10 of door het mengen van compatibele paring partners die zowel het uitvoeren van de mutatie worden uitgevoerd. <ol><li> Groeien tenminste 40 maïszaailingen perstam gedurende 7 dagen bij een lichtcyclus van 16 uur, 200 uE, 28 ° C / 22 ° C (dag / nacht). Zij dienen in het 3-bladstadium en 10-15 cm lang bij de dag van infectie. </li><li> Twee dagen voor infectie, start een voorkweek van de stammen in 5 ml Yeps-Light op een roterend wiel gedurende 24 uur bij 28 ° C. Grow een van de belangrijkste cultuur in 50 ml Yeps-Light tot OD600 = 1,0 (celdeling tarief = 2 uur, laat 3 divisies minimum, kan worden gedaan O / N). </li><li> Spin down de cellen van 50 ml cultuur bij 1.500 xg gedurende 5 minuten en gooi de supernatant. 3x wassen met steriel H2O Resuspendeer de cellen in steriele H 2 O tot een OD 600 van 3,0. Eventueel mengen de paring partners. </li><li> Injecteer 250-500 ul van de celsuspensies in de steel van 7 dagen oude maïszaailingen met een kleine spuit. Gebruik steriele H 2 O als controle. Houd besmette zaailingen voor een extra 7-14 dagen in hetzelfde licht en temperatuur. Score het fenotype van elke plant eenolgens gezonde, chlorose, anthocyaan formatie, kleine tumoren, grote tumoren, dode planten 10. LET OP: Scoren kan zo vroeg als 7 dagen worden uitgevoerd en herhaald na 14 dagen om infectie te volgen in de tijd. </li></ol>

<ol><li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).</li>
<li>Vollmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+development+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Fems+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis.</a> Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).</li>
<li>Banuett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ustilago+maydis%2C+the+delightful+blight%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ustilago maydis, the delightful blight.</a> Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).</li>
<li>Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homologous+recombination+system+of+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The homologous recombination system of Ustilago maydis.</a> Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).</li>
<li>Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mating+and+pathogenic+development+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis.</a> Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).</li>
<li>Ökmen, B., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+plant%3A+Biotrophic+strategies+to+modulate+host+immunity+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).</li>
<li>Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reverse+genetic+approach+for+generating+gene+replacement+mutants+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis.</a> Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).</li>
<li>Kämper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR-based+system+for+highly+efficient+generation+of+gene+replacement+mutants+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis.</a> Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).</li>
<li>Terfrüchte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+versatile+Golden+Gate+cloning+system+for+genetic+engineering+in+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi.</a> Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).</li>
<li>Kämper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li>
<li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Efficient+Method+for+Assessing+Pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+Maize+and+Teosinte+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e50712(2014).</li>
<li>Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FLP-mediated+recombination+for+the+functional+analysis+of+an+effector+gene+family+in+the+biotrophic+smut+fungus+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis.</a> New Phytologist. 187, 957-968 (2010).</li>
<li>van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phleomycin+Increases+Transformation+Efficiency+and+Promotes+Single+Integrations+in+Schizophyllum+commune%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune.</a> Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).</li>
<li>Sarkari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+expression+of+single-chain+antibodies+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).</li>
<li>Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+type+loci+of+Sporisorium+reilianum%3A+Novel+pattern+with+three+a+and+multiple+b+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities.</a> Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).</li>
<li>Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+Environmental+Stresses%2C+Cell-wall+Integrity%2C+and+Virulence+Are+Orchestrated+Through+the+Calcineurin+Pathway+in+Ustilago+hordei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+In%22%5BJournal%5D)">Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei.</a> Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).</li>
<li>Yu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genetic+manipulation+protocol+for+Ustilago+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta.</a> FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).</li>
<li>Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+gene+replacements+in+Neurospora+strains+deficient+for+nonhomologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining.</a> P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).</li>
<li>Colot, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+gene+knockout+procedure+for+Neurospora+reveals+functions+for+multiple+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors.</a> P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).</li>
<li>Langner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinases+Are+Essential+for+Cell+Separation+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis.</a> Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).</li>
<li>Langner, T., Göhre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+chitinases%3A+function%2C+regulation%2C+and+potential+roles+in+plant%2Fpathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions.</a> Current Genetics. , (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloining%3A+a+laboratry+manual%22">Molecular Cloining: a laboratry manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+in+the+bW%2FbE+regulatory+cascade+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis.</a> Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).</li>
<li>Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+RNA-binding+proteins+implicated+in+pathogenic+development+of+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis.</a> Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).</li>
<li>Vollmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+KH+domains+of+Khd4+recognize+AUACCC+and+are+essential+for+regulation+of+morphology+as+well+as+pathogenicity+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis.</a> RNA. 15, 2206-2218 (2009).</li>
<li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li>
<li>Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-3+and+dynein+mediate+microtubule-dependent+co-transport+of+mRNPs+and+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes.</a> Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).</li>
<li>Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FYVE+zinc+finger+domain+protein+specifically+links+mRNA+transport+to+endosome+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Kronstad, J. W., Leong, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+two+Alleles+of+the+b-Locus+of+Ustilago%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago.</a> P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).</li>
<li>Koepke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+Rrm4+is+essential+for+efficient+secretion+of+endochitinase+Cts1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1.</a> Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Schuler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hxt1%2C+a+monosaccharide+transporter+and+sensor+required+for+virulence+of+the+maize+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist+206%22%5BJournal%5D)">Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis.</a> New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).</li>
<li>Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+Ustilago+maydis+using+the+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system.</a> Fungal Genetics and Biology. , (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft hoe deletiemutanten voor reverse genetische studies in U. genereren maydis. Uitgangspunt is een deletie construct dat flankerende sequenties van het gen-van-belang bevattende sequenties van ongeveer 1 kb stroomopwaarts van de start en na het stopcodon en een voldoende weerstand cassette bevat zoals eerder geoptimaliseerd 7,9 . De constructen afzonderlijk worden gegenereerd voor elk gen en zorgvuldig gecontroleerd voor sequentiefouten vóór het gen te verwijderen. Puntm...

Ustilago maydis is een model fytopathogene schimmel die uitvoerig is onderzocht voor tientallen jaren 1,2. Het bestaat in twee morfologieën, een gistachtige, niet-pathogene fase en een filamenteuze infectieuze vorm 3. Universal baanbrekende ontdekkingen zoals homologe recombinatie en DNA-herstelmechanismen werden gemaakt in de gist-achtige groeifase van deze schimmel 4. Bovendien is de morfologische schakelaar om de besmettelijke filament en virulentie factoren die van belang zijn voor infectie zijn goed gekarakteriseerd 5,6. De toenemende kennis over moleculaire biologie en de virulentie van deze vuiligheid schimmel is gebaseerd op een eenvoudige gen vervangende strategie 7-9 ondersteund door een uitstekende genoomannotatie 10 en het gemak van het reverse genetics met gebruikmaking van bijvoorbeeld de goed georganiseerde plasmide collectie van ons instituut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Gestandaardiseerde, snelle infectie assays in maïs seedlings mogelijk gedetailleerde studies van pathogene factoren 11. Het genoom van U. maydis bevat ongeveer 6900 genen 10. Om hun functie te bestuderen, kunnen zij afzonderlijk of in combinatie worden verwijderd door een efficiënte homologe recombinatie systeem. Flankerende gebieden van ongeveer 1 kb dat perfect homologe uiteinden zijn ideaal voor snelheden van homologe recombinatie meer dan 50%, maar reeds 250 bp met niet-homologe uiteinden zodat een zekere correcte integratie van het construct 9. Op dit moment, vijf verschillende weerstand cassettes, hygR, cbxR, natR, G418R en phleoR bemiddelen weerstand tegen hygromycine, carboxin, nourseothricin, G418 en fleomycine, worden gebruikt om te selecteren op transformanten 7,9. Bovendien heeft de hygromycine resistentie ontwikkeld tot een recycleerbare cassette (FRT-hygR) die kan worden verwijderd door de tijdelijke expressie van een heteroloog FLP recombinase 12. Dit maakt verwijdering van het resistentiecassette en daarmee in principe onbeperkte genetische modificaties. Phleomycine mutageen 13, zodat de nieuwe cassettes, met name de recyclebare hygR cassette, het gebruik van phleoR afneemt. Viervoudige mutanten kunnen dus worden gegenereerd via de andere vier cassettes, maar vijfvoudige mutanten, is de FRT-systeem hygR 14 aanbevolen. Deze algemene strategie gendeletie met succes overgedragen aan andere smut schimmels zoals Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16 of U. esculenta 17 en derhalve biedt het potentieel voor verdere toepassingen nog genetisch hardnekkige organismen met een efficiënte homologe recombinatie systeem. Bovendien kunnen organismen ontbreekt homologe recombinatie worden gemodificeerd gentechnologie verbeteren geïllustreerd door de deletie van genen die betrokken zijn bij niet-homologe end-aansluiting in Neurospora crassa 18,19. Hier beschrijven we de gepubliceerde gendeletie strategie voor U. maydis 7,9 in experimentele detail met een focus op de snelle en nauwkeurige controle van de kandidaten. Als voorbeeld, gebruiken we de schimmel chitinasen en tonen de vorming van enkele mutanten alsmede verschillende deletiestammen 20,21. Chitinasen zijn interessante voorbeelden, omdat zij optreden in chitine in de starre celwand. Celwand verbouwing is nodig voor morfologische veranderingen tijdens de celdeling, overschakelen naar draadvormige groei, en de vorming spore. Derhalve zijn voor deletiemutanten fenotypes gehele levenscyclus te verwachten.

<table><tbody><tr><td>Aminobenzoeenzuur (vrije zuur)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar&nbsp;</td><td>BD</td><td>214010</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Bacto pepton</td><td>BD</td><td>211677</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Bacto gistextract&nbsp;</td><td>BD</td><td>212750</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>CaCl2*2H2O</td><td>Grüssing GmbH</td><td>10234</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Ca-Pantothenaat (Hemi-Ca. zout)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-2250</td><td></td></tr><tr><td>Carboxin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>45371</td><td></td></tr><tr><td>Casamino zuren&nbsp;</td><td>BD</td><td>223050</td><td></td></tr><tr><td>Cholinchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-1879</td><td></td></tr><tr><td>Citroenzuur</td><td>ChemSolute</td><td>24.321.000</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>CuSO4*5H2O</td><td>Fluka</td><td>61240</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>D(+)Sucrose&nbsp;</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>DNA degr. vrij zuur&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-3159</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3*6H2O</td><td>Grüssing GmbH</td><td>10288</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Geneticin (G418) disulfaat zout</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Trichoderma lysing enzymen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>D(+) Glucose</td><td>Caelo</td><td>2580</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Glycerin&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>G065015</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td>Gevaarlijke stof. Raadpleeg de veiligheidsinstructies van de fabrikant.</td></tr><tr><td>Heparine natriumzout</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycine B-oplossing</td><td>Roth</td><td>1287.2</td><td>Gevaarlijke stof.&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>26764298</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A3620</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>MgSO4 watervrij</td><td>Merck</td><td>7487-88-9</td><td>Watervrij is kritiek. Alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>MnCl2*4H2O</td><td>AppliChem</td><td>A2087</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Na2-EDTA*2H2O</td><td>AppliChem</td><td>A2937</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Na2MoO4*2H2O</td><td>Roth</td><td>0274.2</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Grüssing GmbH</td><td>12174</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S316060</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ChemSolute</td><td>13.751.000</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>NH4NO3</td><td>Roth</td><td>K299.1</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Nicotinezuur (vrij zuur)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>Nourseothricine dihydrogesulfaat&nbsp;&nbsp;</td><td>Werner BioAgents</td><td>5.001.000</td><td></td></tr><tr><td>Voedingsbouillon&nbsp;</td><td>Difco</td><td></td><td>lokale leveranciers</td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3803</td><td>Gevaarlijke stof. Raadpleeg de veiligheidsinstructies van de fabrikant.</td></tr><tr><td>polyethyleenglycol (PEG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumacetaat</td><td>AppliChem</td><td>121479</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Pyridoxine (monohydrochloride)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-9755</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavine&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R5503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>Cn30.3</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>kleine spuit</td><td>BD</td><td>300300</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>steriele filter, 22 &micro;m</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Roth</td><td>6213.1</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Thiamin-hydrochloride</td><td>Serva</td><td>36020.02</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>tri-Na-Citraat</td><td>Fisher Chemical</td><td>S332060</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Tris- (hydroxymethyl) aminomethaan</td><td>VWR</td><td>103156X</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Roth</td><td>9090.4</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Serva&nbsp;</td><td>37240</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Fluka</td><td>96470</td><td>alternatief lokale leverancier gebruiken</td></tr><tr><td>Samenstelling van oplossingen/voorbereiding van materiaal</td><td></td><td></td><td>Samenstelling van oplossingen</td></tr><tr><td>Carboxin</td><td></td><td></td><td>Voorraad: 5 mg/ml in methanol, eindconcentratie: 2 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>CM platen</td><td></td><td></td><td>0,25 % (w/v) Casamino zuren, 0,1 % (w/v) Gistextract, 1,0 % (v/v) Holliday vitamineoplossing, 6,25 % (v/v); Holliday zout oplossing, 0,05 % (w/v) DNA degr

genetische manipulatie van de plant pathogeen<em&gt; ustilago maydis</em&gt; om fungal biology and plant microbe interactions studie

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gendeletie speelt een belangrijke rol bij de analyse van genfunctie. Een van de meest efficiënte werkwijzen om genen doelgericht verstoren is de vervanging van het gehele gen met een selecteerbare merker via homologe recombinatie. Tijdens homologe recombinatie, uitwisseling van DNA vindt plaats tussen sequenties met hoge gelijkenis. Daarom kan lineair genomische sequenties die een doelgen worden gebruikt om specifiek richten een selecteerbare marker om de gewenste integratieplaats. Stompe uiteinden van het deletieconstruct activeren DNA herstel systemen van de cel en daarmee integratie van het construct bevorderen hetzij via homologe recombinatie of door niet-homologe-uiteinden. In organismen met een efficiënte homologe recombinatie, kan de snelheid van succesvolle gendeletie oplopen tot meer dan 50% waardoor deze strategie een waardevolle gendisruptie systeem. De vuiligheid schimmel Ustilago maydis is een eukaryotisch micro-organisme model toont een dergelijke efficiënte homologe recombination. Van de ongeveer 6900 genen, vele zijn functioneel gekarakteriseerd met behulp van deletiemutanten en herhaalde niet van genvervanging pogingen wijst op wezenlijke functie van het gen. Daaropvolgende karakterisering van het gen functie door tagging met fluorescerende markers of mutaties van de voorspelde domeinen beroept zich ook op DNA-uitwisseling via homologe recombinatie. Hier presenteren we de U. maydis generatie strategie stam in detail met behulp van de eenvoudigste voorbeeld, het gen deletie.

De schrapping constructies voor alle vier chitinolytische genen gecodeerd in het U. maydis genoom werden gegenereerd door Golden Gate klonen met behulp van de hygR cassette voor het verwijderen van CTS1, de natR voor verwijdering van CTS2, de G418R cassette voor het verwijderen van cts3 en de cbxR voor het verwijderen van cts4 20. Een algemeen overzicht van de vervangingsstrategie gen wordt geïllu...

We beschrijven een robuuste gen vervangende strategie om de vuiligheid schimmel Ustilago maydis genetisch te manipuleren. Dit protocol wordt uitgelegd hoe u deletiemutanten genereren om infectie fenotypes onderzoeken. Kan worden uitgebreid tot genen in elke gewenste wijze, bijvoorbeeld wijzigen door toevoeging van een sequentie die codeert voor een fluorescerend eiwit tag.

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Het algemene doel van dit protocol is om de roetschimmel, ustilago maydis, genetisch te modificeren. Deze methode voor het genereren van stammen maakt functionele karakterisering van genen op verschillende manieren mogelijk. Bijvoorbeeld, we kunnen de genen verwijderen, we kunnen de promotus uitwisselen, of we kunnen fusieconstructen genereren.Het grote voordeel van deze methode is dat we de wijziging precies kunnen verifiëren, zodat elk fenotype direct kan worden gekoppeld aan de wijziging in het gen van belang. Visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat het weten wanneer de protoplast-reactie moet worden gestopt, cruciaal is voor een succesvolle transformatie. Ter voorbereiding, koel twee milliliter ronde bodembuizen af op min 20 graden Celsius.Vervolgens inoculeert u een drie milliliter precultuur in YEPS-Light met een verse plaat. Incubeer deze gedurende 24 uur op een roterend wiel bij 28 graden Celsius. De volgende dag, voeg 25 microliter van de precultuur toe aan 50 milliliter YEPS-Light in een schuin flesje.Laat vervolgens de cultuur groeien op een orbitale schudder totdat deze de exponentiële fase bereikt. Een optische dichtheid van 1,0 komt overeen met één tot twee keer 10 tot de zevende cellen in ustilago maydis. Controleer de optische dichtheid bij 600 nanometer.Een waarde van 0,6 tot 1,0 is acceptabel. Controleer vervolgens de cellen op besmetting onder 40x vergroting. Bacteriële besmettingen kunnen worden geïdentificeerd als kleine en vaak bewegende cellen.Schimmelbesmettingen kunnen worden geïdentificeerd op basis van hun vorm of grootte. Gooi altijd besmette culturen weg en werk alleen met schone culturen. Na het pellen van de cellen gedurende vijf minuten bij 1.500 G, gooi het supernatant weg.Vervolgens resuspendeer de pellet in 25 milliliter SCS. Herhaal de centrifugatie. En ondertussen, bereid drie milliliter protoplast-oplossing voor per celpellet.Leidt deze oplossing door een 22-micron filter. Gooi nu het supernatant weg en resuspendeer de pellet in twee milliliter protoplast-oplossing. Laat de cellen vervolgens rusten bij kamertemperatuur totdat 30 tot 40% van hen rond of speldkopvormig zijn.De reactie kan vijf tot twintig minuten duren. Begin na vijf minuten met observeren onder de microscoop. Om de maximale transformatie-efficiëntie te verkrijgen, moet de protoplastische reactie op het juiste moment worden gestopt.En dan moeten de protoplasten zeer voorzichtig worden behandeld alsof het zeepbellen zijn. Ga door met het protocol, houd de protoplasten altijd op ijs. De volgende stap is om ze te wassen met 10 milliliter koude SCS en ze vervolgens te verzamelen met een vijf minuten spin bij 1.000 G. Herhaal deze wasstap in totaal drie keer.Na de wasbeurten, resuspendeer de pellet in 10 milliliter koude STC. Verzamel de cellen vervolgens opnieuw met een andere vijf minuten spin bij 1.000 G, gevolgd door het resuspenderen in 1 milliliter koude STC. Maak nu 100 microliter aliquots in de koude buisjes en bewaar deze aliquots op min 80 graden Celsius.Om ustilago maydis protoplasten te transformeren, bereidt u twee selecties per transformatie voor. Eerst smelt u RegLight-agar en koelt u deze af tot 60 graden Celsius. Voeg vervolgens bij een deel van de gesmolten agar het selectieve antibioticum toe in tweemaal de werkconcentratie, en voeg 12 milliliter toe aan elke plaat om de onderste laag te vormen.Het monster moet voorzichtig worden gemengd. Vermijd het maken van luchtbellen. Houd de resterende RegLight zonder antibiotica bij 60 graden Celsius.Vervolgens ontdooit u voor elke transformatie een buisje protoplasten op ijs. Zodra ontdooid, voegt u een microliter heparine-oplossing en één microgram geliniealiseerd construct-DNA toe. Bewaar ze vervolgens gedurende 10 minuten op ijs.Terwijl u wacht, verspreidt u 12 milliliter RegLight zonder antibiotica over de RegLight met antibiotica. Voeg vervolgens 500 microliter STC/PEG toe aan elke transformatiebuis en meng ze voorzichtig met inversies. Vervolgens gaat u verder met de incubatie op ijs gedurende nog eens 15 minuten.Verdeel nu elke transformatiereactie over twee afzonderlijke selectieve RegLight-platen. Zorg ervoor dat alle vloeistof in de platen is geweekt voordat u verder gaat. Incubeer vervolgens de platen rechtop bij 28 graden Celsius gedurende vijf tot zeven dagen om 100 tot 200 kolonies te krijgen.Als er maar een paar kolonies groeien, kunnen de protoplasten te veel celwand bevatten en dit kan worden getest door ze te transformeren met een cel-fabricerende plasma of ze kunnen zich mogelijk niet regenereren en dit kan worden getest door ze op platen zonder antibiotica te planten. Selecteer later 24 transformanten voor testen. Zuiver ze opnieuw op selectieve YEPS-Light om enkele kolonies te verkrijgen.Op elke plaat, streek ook wat van de oorspronkelijke stam uit om er zeker van te zijn dat de antibiotica selecteren tegen niet-transformanten. Het is van cruciaal belang om de mutaties te verifiëren met een driestapsproces dat twee PCR's en een Southern Blot-analyse omvat. Deze worden gedetailleerd beschreven in het tekstprotocol.Deze sectie legt uit hoe u het genomische DNA kunt voorbereiden dat nodig is voor deze analyses. Eerst inoculeert u vijf milliliter YEPS-Light met de kandidaat-transformant en incubeert u deze gedurende 24 uur op een roterend wiel bij 28 graden Celsius. De volgende dag, druppelt u twee microliter van de cultuur op een CM-plaat.Houd de cultuur steriel. Bereid vervolgens een twee milliliter buisje voor met ongeveer 200 microliter zoutzuur-gewassen glaskralen en twee milliliter van de 24-uurs cultuur. Na het draaien van het buisje gedurende vijf minuten bij 12.000 G, zuigt u het supernatant af en gooit u het weg.Voeg aan de pellet, die bevroren kan worden opgeslagen, 500 microliter usti-lysebuffer twee toe. Schud het buisje vervolgens gedurende vijf tot vijftien minuten bij 1.000 RPM op een Vibra

genetic-manipulation-plant-pathogen-ustilago-maydis-to-study-fungal

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Hier beschrijven we een werkwijze voor het gebruik van type I en type...

Genetische Manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen voor Functionele genomische analyse van<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Het gebruik van een naaldinjectiemethode om maïs- en teosinteplanten te enten met de biotrofe ziekteverwekker Ustilago maydis wordt beschreven.  De inentingsmethode voor naaldinjectie vergemakkelijkt de gecontroleerde afgifte van de schimmelpathogenese tussen de bladeren van de plant waar de ziekteverwekker de plant binnenkomt door de vorming van appresoria. Deze methode is zeer efficiënt, waardoor reproduceerbare inentingen met U. maydis mogelijk zijn.

Een snelle en efficiënte methode voor het beoordelen van pathogeniteit van Ustilago maydis op maïs- en teosintelijnen

Het beschreven hydroponische cocultivatiesysteem ondersteunt intacte planten met metalen maasschermen en cocultivateert ze met bacteriën. Plantweefsel, bacteriën en gescheiden moleculen kunnen vervolgens afzonderlijk worden geoogst voor stroomafwaartse analyses, waarbij tegelijkertijd wordt toegelaten dat de moleculaire reacties van zowel plantaardige hosts als interactieve microben of microbiomen worden onderzocht.

Een hydroponisch co-cultuursysteem voor gelijktijdige en systematische analyse van plant- / microbe moleculaire interacties en signalering

Smut schimmels veroorzaken vele verwoestende landbouw ziekten. Zij worden verspreid als slapende teliospores die in antwoord op het milieu signalen ontkiemen. Duidelijk naar voren komt twee methoden voor het onderzoek naar moleculaire veranderingen tijdens kieming: meten van verhoging van de ademhaling voor het detecteren van metabole activering en beoordelen van moleculaire gebeurtenissen wijzigen door het isoleren van teliospores in verschillende morfologische stadia.

Onderzoek naar Teliospore kieming met behulp van Microrespiration analyse en Microdissection

Hier presenteren we een protocol om te testen van de virulentie van de plant met de plant pathogen Magnaporthe grisea. Dit verslag zal bijdragen tot de grootschalige screening van de biotypen van schimmels isolaten en dienen als een uitstekend uitgangspunt voor het begrijpen van de resistente mechanismen van planten tijdens de moleculaire veredeling.

De Plant infectie Test: Spray en wond-gemedieerde inoculatie met de Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Dit werk beschrijft het klonen van een Ustilago maydis Trojaans paard stam voor de in-situ levering van secreted maïseiwitten in drie verschillende types van maïs weefsels.

Met behulp van Ustilago maydis als een paard van Troje voor In Situ levering van maïs eiwitten

Hier presenteren we een protocol om Aspergillus flavus groei en productie van aflatoxine in maïs kernels uiting van een antischimmel eiwit te analyseren.  Met behulp van een stam GFP-uiten A. flavus bewaakt we de infectie en de verspreiding van de schimmel in volwassen kernels in real-time. De bepaling is snel, betrouwbaar en reproduceerbaar.

Remming van de groei van de Aspergillus flavus en aflatoxine productie in transgene maïs uiten van de α-amylase Inhibitor van Lablab purpureus L.

Het CRISPR-Cas9 genoombewerkingssysteem is een gebruiksvriendelijke genoomeditor die is gebruikt in model- en niet-modelsoorten. Hier presenteren we een eiwit-gebaseerde versie van dit systeem dat werd gebruikt om een voortijdige stop codon te introduceren in een paring gen van een niet-model filamenteuze ascomycete schimmel.

CRISPR-Cas9-Gemedieerd Genoombewerking in de filamenteuze Ascomycete Huntiella omanensis

Vanwege de ondoorzichtigheid van de bodem kunnen interacties tussen de samenstellende microben niet gemakkelijk worden gevisualiseerd met cellulaire resolutie. Hier worden twee microfluïdische hulpmiddelen gepresenteerd, die nieuwe mogelijkheden bieden voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties. De apparaten zijn veelzijdig en eenvoudig te gebruiken, waardoor hoge spatiotemporale controle en beeldvorming met hoge resolutie op cellulair niveau mogelijk is.

Microfluïdische hulpmiddelen voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties op cellulair niveau

We presenteren een eenvoudig, effectief en reproduceerbaar protocol voor Agrobacterium-gemedieerde transformatie van Phytophthora palmivora, dat ook toepasbaar is op P. capsici.

Een vereenvoudigde methode voor agrobacterium-gemedieerde transformatie van Phytophthora palmivora

Leer genetische manipulatie van Ustilago maydis voor functionele karakterisering van genen en fenotypische analyse. Deze methode maakt precieze verificatie van modificaties mogelijk voor onderzoek naar schimmelinfecties.

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen

Meer video's verkennen