Name: De Voorbereiding van de Oblique Spinal Cord Slices voor Ventral Root Stimulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Leer hoe u schuine ruggenmergsneden van jonge muizen bereidt voor ventrale wortelstimulatie. Deze techniek maakt betrouwbare identificatie van motorneuronen en studie van ventrale cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Marin Manuel en Olivia Goldman-Szwajkajzer voor hun hulp bij het maken van de foto's. De auteurs danken ook Arjun Masukar en Tobias Bock voor het corrigeren van het manuscript. Financiële steun werd verleend door de Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-01), de NIH-NINDS (R01NS077863), de Thierry Latran Foundation (OHEX Project), de Franse vereniging voor myopathie (subsidienummer 16026) en Target ALS worden met dank erkend. Felix Leroy was de ontvanger van een "Contrat Doctoral" van de Ecole Normale Supérieure, Cachan.

De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese richtlijnen (86/609/CEE en 2010-63-UE) en de Franse wetgeving, en werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Paris Descartes University.
1. Preparatie van ruggenmergsnijden
<ol>
	<li>Bereid de volgende oplossingen dagelijks of één dag van tevoren. Indien ze overnight worden bewaard, belucht deze dan met 95% O2 en 5% CO2 en bewaar ze gekoeld in stevig gesloten flessen.
	<ol>
		<li>Bereid Low Na + kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF): 3 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 230 mM sucrose, 26 mM NaHCO3, 0.8 mM CaCl2, 8 mM MgCl2, 25 mM glucose, 0.4 mM ascorbinezuur, 1 mM Na-kynurenaat, 2 mM Na-pyruvaat. Belucht met 95% O2 en 5% CO2 (pH 7.4). Aangezien Na-kynurenaat vaak moeilijk oplosbaar is, dient u het type te kopen dat in de materialentabel wordt vermeld.</li>
		<li>Bereid K-gluconaatoplossing: 130 mM K-gluconaat, 15 mM KCl, 0.05 mM EGTA, 20 mM HEPES, 25 mM glucose, 1 mM Na-kynurenaat, 2 mM Na-pyruvaat, ingesteld op pH 7.4 met KOH.</li>
		<li>Bereid ACSF: 130 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 25 mM glucose, 0.4 mM ascorbinezuur, 2 mM Na-pyruvaat. Belucht met 95% O2 en 5% CO2 (pH 7.4).</li>
		<li>Los vóór het begin van de dissectie 2% agar op in 80 ml van de K-gluconaatoplossing en houd dit warm op 60 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Intracardiace perfusie
	<ol>
		<li>Voer deze preparatie uit bij vrouwelijke en mannelijke muizen met een leeftijd van P2 tot P11.</li>
		<li>Anestheseer de muis met een intraperitoneale injectie van 0.1 ml 25 mM pentobarbitalnatrium (50 mg/kg).</li>
		<li>Immobiliseer de muis op de rug in een grote petrischaal gevuld met siliconen met behulp van naalden of tape. Gebruik voor de rest van de dissectie een dissectiemicroscoop.</li>
		<li>Til de borstkas op door de punt van het borstbeen vast te houden en snijd het diafragma door met een fijne schaar. Open vervolgens de borstkas aan beide zijden door door de ribben te snijden om het hart bloot te leggen.</li>
		<li>Snijd het rechter atrium door voordat u de linker ventrikel puncteert met een 27G naald.</li>
		<li>Perfundeer met ijskoude low Na+ ACSF. Na 30 sec moet low Na+ ACSF uit het atrium worden gezien stromen. Lage hoeveelheden natrium voorkomen dat de cellen spikes vertonen en verminderen celsterfte tijdens de dissectie.</li>
		<li>Houd de naald in het hart onder de dissectiemicroscoop totdat de lever geel wordt wanneer het bloed is afgevoerd.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dissectie van het ruggenmerg
	<ol>
		<li>Decapiteer het dier en leg het op de buik.</li>
		<li>Verwijder snel de huid van de rug (Figuur 1A1). Maak twee sneden door de schouders, naar beneden langs de borstkas (Figuur 1A2). Snijd vervolgens het ruggenmerg zo laag mogelijk in het caudale gedeelte om de wervelkolom met het begin van de ribben te isoleren van het onderste deel van het dier. Draai het dier opnieuw om en verwijder de viscera die nog aan de ribben vastzitten.</li>
		<li>Verplaats de wervelkolom naar een andere, kleinere met siliconen gevulde petrischaal en gebruik 4 insectenspeldjes om deze met de dorsale zijde naar boven vast te zetten (Figuur 1A).</li>
		<li>Perfundeer het dier continu met carbogen-beluchte ACSF (op ongeveer 4 °C) terwijl u een laminectomie van de dorsale zijde uitvoert en het ruggenmerg vanaf het rostrale uiteinde blootlegt (Figuur 1B). Plaats hiervoor de punt van een fijne schaar tussen het bot en het ruggenmerg en snijd het bot stukje bij beetje door vanaf het rostrale uiteinde, waarbij u ervoor zorgt dat u uit de buurt van de witte stof blijft. Wissel af aan beide zijden terwijl u een pincet gebruikt om de reeds doorgesneden botrand weg te houden (Figure 1B1).</li>
		<li>Til de dura op met de kleinste beschikbare veerschaar en een pincet en snijd aan beide zijden terwijl u het losse deel van de dura vasthoudt om te voorkomen dat u het ruggenmerg met de schaar beschadigt. Snijd langs de rostro-caudale as. 
		OPMERKING: De dura is een semitransparant continu membraan; op deze leeftijd is de pia mater te fragiel en zal deze tijdens de dissectie en het snijden uit elkaar vallen (Figuur 1B2).</li>
		<li>Zodra de dura is verwijderd, gebruikt u een stompe glazen of plastic tip om het merg voorzichtig naar de linkerkant van de groef te duwen die gevormd is door de halfdoorgesneden wervelkolom, en snijdt u de ventrale en dorsale wortels aan de rechterkant door, beginnend aan de rostrale zijde, het verst van waar ze het merg binnengaan (minstens enkele mm, Figuur 1B2).</li>
		<li>Herhaal de handeling aan de linkerkant, altijd van rostral naar caudal. Indien u linkshandig bent, begin dan aan de linkerkant en ga daarna naar de rechterkant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inbedding in agar
	<ol>
		<li>Schuif het merg uit de wervelkolom. Gebruik een kleiner insectenspeldje om het merg met de dorsale zijde naar boven vast te zetten en verwijder voorzichtig elk stukje membraan dat er nog aan vastzit (Figuur 1C1).</li>
		<li>Trim na het schoonmaken beide uiteinden (Figuur 1C2). Steek een gebogen insectenspeldje in het anterieure deel van het merg om het merg te manipuleren en noteer de oriëntatie (pijl in Figuur 1C2). Verplaats het ruggenmerg vervolgens naar een ijskoude K-gluconaatoplossing. 
		OPMERKING: Deze oplossing bootst de intracellulaire samenstelling van de CSF na en zal voorkomen dat de cellen sterven door osmotische shock zodra de motoneuronen worden doorgesneden26.</li>
		<li>Zodra het ruggenmerg in de intracellulaire oplossing is, haalt u het bekerglas met de agar uit het droge bad en koelt u dit af op een mengsel van ijs en water.</li>
		<li>Blijf roeren terwijl u de temperatuur meet. Wanneer de temperatuur 38 °C bereikt, dompelt u het ruggenmerg onder, terwijl u het bij het insectenspeldje vasthoudt, en plaatst u het met de rostrale zijde naar beneden. Zorg ervoor dat het ruggenmerg zo recht mogelijk ligt, uit de buurt van de wanden, met het caudale deel licht omhoog (Figuur 1D1).</li>
		<li>Laat het bekerglas in het mengsel van ijs en water staan zodat de agar zo snel mogelijk kan stollen. Zorg ervoor dat het op zijn plek blijft en dat het merg zo recht mogelijk ligt (Figuur 1D1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Slicing
	<ol>
		<li>Snijd na stolling het agarblok met het ruggenmerg zodanig dat de basis van het blok in een hoek van 35° staat ten opzichte van het lumbale deel van het merg (pijl in Figuur 1D2). Het dorsale oppervlak moet van de basis afgekeerd zijn (Figuur 1D2). 
		OPMERKING: Dit is een kritische stap in de procedure om de continuïteit van de motoneuron-pools naar de ventrale wortels waarlangs ze uittreden te behouden.</li>
		<li>Lijm het blok in de kamer van de vibratoom met cyanoacrylaatlijm. Dompel het onder in K-gluconaatoplossing en voeg slush-bevroren K-gluconaatoplossing toe om het bad gekoeld te houden (onder 2 °C).</li>
		<li>Snijd coupes van 350 - 400 µm dik uit de lumbale regio (herkenbaar aan de kromming en grotere diameter). Gebruik in de juiste oriëntatie (zie 1.4.1.) het mes om van het dorsale naar het ventrale oppervlak te snijden en maak coupes die continu meer rostral liggen. Meestal zijn er 4-5 geschikte coupes met ventrale wortels die 2 mm of meer extenderen. Gebruik de volgende parameters: 10° hoek, 70 Hz vibratiefrequentie en een snijsnelheid van 10 mm/min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Incubatie
	<ol>
		<li>Verplaats de coupes naar ACSF op 34 °C. Koel de coupes na ongeveer 30 min af tot RT en begin de registratiesessie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Dissectieproces en weefselpreparatie, serie experimentele afbeeldingen, biologisch onderzoek." src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. Dissectie 
A1: Verwijderen van de huid van de rug om de dorsale kolom bloot te leggen. A2: Doorsnijden van de schouders en ribben om de dorsale kolom vrij te maken. B1: Wervelkolom vastgepind op de met siliconen gevulde petri-schaal (dorsale zijde boven, caudale zijde links). B2: Hetzelfde met het blootgelegde en gedissecteerde ruggenmerg. C1: Geïsoleerd ruggenmerg (rostrale zijde links). C2: Ruggenmerg klaar om ingebed te worden (ventrale zijde boven, rostrale zijde links). Let op de kleinere insectennaald aan de rostrale zijde. D1: Ruggenmerg in het agar-bekerglas (rostrale zijde naar beneden, ventrale zijde naar de bodem gericht). D2: Doorgesneden agaarblok met het ingebedde ruggenmerg. Let op de hoek van 35° die het ruggenmerg vormt met de basis van het blok en de lumbale verdikking (pijl). Schaalbalken 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
2. Het plaatsen van de slice in de kamer
OPMERKING: Ventrale wortels variëren in grootte.
<ol>
	<li>Bereid vooraf een doos met diverse pipetten voor met tipdiameters variërend van 40 tot 170 µm. Om zuigpipetten te maken, bereid je meerdere pipetten voor met een lange taps toelopende punt. Maak met een diamantmes een snede op verschillende posities. Breek de punt vervolgens onder een dissectiemicroscoop door er met een pincet op te tikken.</li>
	<li>Verwijder de kamer uit de registratiemicroscoop en plaats deze onder een dissectiemicroscoop.</li>
	<li>Selecteer een coupesectie die een ventrale wortel van voldoende lengte bevat (2 mm of meer) om op een zuigstimulatie-elektrode te worden gemonteerd. Kies de juiste oriëntatie van de sectie met de ventrale wortels naar boven (Figuur 2A) en snijd voorzichtig de agar rond de ventrale wortels weg, terwijl de rest van de agar rond de sectie behouden blijft (Figuur 2B). 
	OPMERKING: Omdat de agar steviger is dan de sectie, zorgt dit ervoor dat de draden van het anker van de sectie op de agar rusten in plaats van op de sectie, waardoor het anker het weefsel niet beschadigt. Zorg ervoor dat de draden van het anker van de sectie zich boven de motoneuronpool bevinden (in rood weergegeven in Figuur 2C).</li>
	<li>Monteer de kamer terug op de microscoop en perfuseer de registratiekamer continu met ACSF met een snelheid van 1 - 2 ml/min, bij RT. Zuig met een glazen pipet gevuld met ACSF en verbonden met een spuit een van de ventrale wortels op (pijl in Figuur 2C). Om een goede stimulatie van de ventrale wortel te bereiken, moet de pipetpunt strak rond de ventrale wortel sluiten. Eén pool moet zich in de stimulerende elektrode bevinden en de andere in het bad (of verbonden zijn met de referentie van de patch-clamp elektrode).</li>
	<li>Voer een patch-clamp registratie uit van het gewenste celtype en registreer het effect van de stimulatie van de ventrale wortel zoals eerder beschreven10.
	<ol>
		<li>Gebruik hiervoor een versterker voor data-acquisitie. Filter whole-cell registraties op 3 kHz. Digitaliseer op 10 kHz. Compenseer de brugweerstand in current-clamp modus.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Histologische kleurstofpenetratie, microscopische beelden van weefseldoorsneden die kleuringstechnieken tonen." src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2. Preparatie van de ventrale wortel 
A: Lumbale dwarsdoorsnede van het ruggenmerg ingebed in agar met de ventrale wortel naar boven gericht. B: Lumbale dwarsdoorsnede van het ruggenmerg waarbij de ventrale wortels zijn vrijgemaakt uit de agar. C: Lumbale dwarsdoorsnede van het ruggenmerg met een stimulerende elektrode strak rond de ventrale wortels geplaatst (pijl). Let op de locatie van de Renshaw-cellen die rode fluorescentie tot expressie brengen in de chrna2-Cre muis28 gekruist met de reportermuis R26Tom 17. Schaalbalken 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<ol><li>Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After-potentials+and+excitability+of+spinal+motoneurones+following+antidromic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation.</a> J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).</li>
<li>Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+electrophysiological+abnormalities+in+lumbar+motoneurons+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).</li>
<li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+currents+in+visually+identified+motoneurones+of+neonatal+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord.</a> J Physiol. 423, 27-46 (1990).</li>
<li>Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+activity+of+rat+spinal+cord+motoneurons+in+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices.</a> J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).</li>
<li>Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventrolateral+origin+of+each+cycle+of+rhythmic+activity+generated+by+the+spinal+cord+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo.</a> PLoS One. 2 (5), e417(2007).</li>
<li>Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+monosynaptic+contacts+between+type-identified+alpha-motoneurons+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat.</a> Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).</li>
<li>Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+direct+synaptic+interconnections+between+cat+spinal+alpha-motoneurons+via+the+recurrent+axon+collaterals%3A+a+morphological+study+using+intracellular+injection+of+horseradish+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase.</a> Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).</li>
<li>Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+excitatory+interactions+between+spinal+motoneurones+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat.</a> J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).</li>
<li>Ichinose, T., Miyata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+excitation+of+motoneurons+in+the+isolated+spinal+cord+of+newborn+rats+detected+by+whole-cell+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording.</a> Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+excitatory+postsynaptic+ionotropic+receptors+coactivated+at+the+motoneuron-Renshaw+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+effects+of+centripetal+impulses+in+axons+of+spinal+ventral+roots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots.</a> J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+as+a+mechanism+in+central+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition.</a> Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86(1946).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+and+on+the+nature+of+central+inhibition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition).</a> Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).</li>
<li>Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+excitability+changes+in+lumbar+motoneurons+of+transgenic+SOD1G85R+and+SOD1G%2893A-Low%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice.</a> J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).</li>
<li>Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+postnatal+maturation+of+electrical+properties+in+spinal+motoneurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).</li>
<li>Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+alteration+of+motoneuronal+morphology+induces+hyperexcitability+in+the+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).</li>
<li>Hadzipasic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+degeneration+of+a+physiological+subtype+of+spinal+motor+neuron+in+mice+with+SOD1-linked+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).</li>
<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li>
<li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li>
<li>Manuel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics%2C+high-frequency+oscillations%2C+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li>
<li>Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+motoneuron+firing+by+recurrent+inhibition+in+the+adult+rat+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo.</a> J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+currents+dynamically+set+the+recruitment+and+firing+properties+of+F-type+motoneurons+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice.</a> J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+composition+and+kinetics+of+the+Renshaw+cell+heteromeric+nicotinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+shaping+the+slow+nicotinic+synaptic+current+at+the+motoneuron-renshaw+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).</li>
<li>Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-dependent+use+of+co-released+inhibitory+transmitters+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses.</a> J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).</li>
<li>Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+afferent+synapses+on+developing+and+adult+Renshaw+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells.</a> J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).</li>
<li>Perry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+properties+of+Renshaw+cells+defined+by+Chrna2+are+modulated+by+hyperpolarizing+and+small+conductance+ion+currents+Ih+and+ISK%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK.</a> Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).</li>
<li>Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+electrical+properties+of+ventral+horn+neurons+in+rat+spinal+cord+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices.</a> J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).</li>
<li>Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electrical+properties+and+prediction+of+motor-unit+type+of+medial+gastrocnemius+motoneurons+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat.</a> J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).</li>
<li>Cooper, S., Sherington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gower%27s+tract+and+spinal+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Gower's tract and spinal border cells.</a> Brain. 63, 123-124 (1940).</li>
<li>Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+of+the+spinothalamic+and+related+tracts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Psychiatr+Neurol+Scand%22%5BJournal%5D)">Experimental study of the spinothalamic and related tracts.</a> Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).</li>
<li>Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+projections+to+the+cerebellum+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).</li>
<li>Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-%2C+T-%2C+and+H-type+currents+shape+intrinsic+firing+of+developing+rat+abducens+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons.</a> J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).</li>
<li>Dourado, M., Sargent, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+nicotinic+receptors+underlying+Renshaw+cell+excitation+by+alpha-motor+neurons+in+neonatal+rat+spinal+cord%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord).</a> J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).</li>
<li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).</li>
<li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li>
<li>Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+specific+ions+in+glutamate+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The role of specific ions in glutamate neurotoxicity.</a> Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het schuine snijden van het ruggenmerg is belangrijk omdat het eenzijdige stimulatie van motoneuronpools en Renshaw-cellen mogelijk maakt op een enkel wervelsegment, op een betrouwbare, uitgebreide en specifieke manier. Bovendien maakt het een snelle, elegante en ondubbelzinnige identificatie van opgenomen motoneuronen mogelijk. Vervolgens benadrukken we de voordelen van deze techniek vergeleken met andere slice-voorbereidingsmethoden, en benadrukken we vervolgens de meest voorkomende valkuilen die moeten worden vermeden...

Historisch gezien werden motoneuronopnames met behulp van scherpe elektroden in vivo uitgevoerd op grote dieren zoals katten of ratten1 of op een geïsoleerde volledige ruggenmerg in muizen2. Het ontstaan van de patch-clamp opnametechniek in de jaren 1980, vereiste directe toegang tot de motoneuron soma's omdat het afdichten onder visuele begeleiding moest worden bereikt. Dus, ruggenmergsnede bereiding is gemakkelijk uitgevoerd sinds het begin van de jaren 19903. Echter, vroege snede bereiding liet vaak niet toe om de ventrale wortels te stimuleren. Voor zover wij weten, hebben slechts twee onderzoeken melding gemaakt van succesvolle stimulatie van de ventrale wortels in transversale sneden, en geen daarvan was afkomstig van muizen4,5.
In dit artikel presenteren we een techniek om levensvatbare ruggenmergsnedes van neonatale muizen (P2 - P11) te bereiken waarin het motoneuron pool zijn ventrale wortelafgaande axonen behoudt. Ventral wortel stimulatie veroorzaakt antidromische actiepotentialen terug naar de soma's van het motoneuron pool dat uit dezelfde ventrale wortel vertrekt. Het exciteert ook de motoneuron zijdoelaanvallen, andere motoneuronen6-10 en de Renshaw cellen11-13. Aangezien alleen motoneuronen hun axonen langs de ventrale wortels sturen, gebruiken we de opname van antidromische actiepotentialen als een eenvoudige en definitieve manier om motoneuronen fysiologisch te identificeren10.
Naast het gebruik van mogelijk niet-inclusieve of misleidende elektrofysiologische en morfologische criteria om de identiteit van het motoneuron te bevestigen, vertrouwden recente onderzoeken naar ruggenmerg motoneuronen ook op vervelende en tijdrovende post hoc kleuringen16. Dergelijke identificatie wordt meestal alleen uitgevoerd op een steekproef van de opgenomen cellen. Andere identificatiestrategieën zijn afhankelijk van muizenlijnen waarin de motoneuronen endogene fluorescentie uitdrukken17-19. Het gebruik van genetisch gecodeerde markers kan echter moeilijk zijn op jonge leeftijd wanneer markerexpressie nog variabel is of als het onderzoek al gebruik vereist van een transgene muizenlijn. Als alternatief kunnen antidromische actiepotentiaalopnames routinematig worden uitgevoerd op alle muizen vanaf het begin van celopname. Experimenteurs die werken aan intacte ruggenmergpreparaten bij katten, ratten en muizen, hebben sinds de jaren 1950 op betrouwbare wijze dergelijke identificatietechnieken gebruikt1,2,20,21. Onder optimale omstandigheden waren we in staat om antidromische actiepotentialen te veroorzaken van vrijwel alle opgenomen motoneuronen.
Bovendien kan ventrale wortelstimulatie worden gebruikt om op betrouwbare wijze andere motoneuronen22,23 of hun doelen te exciteren. de Renshaw cellen10,24,25. We presenteren hier toepassingen van de ventrale wortelstimulatie in de vorm van antidromische actiepotentiaalopnames van motoneuron soma's, evenals excitatie van Renshaw cellen.

<table><tbody><tr><td>Na-kynurenate</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td><td>lost beter op dan andere merken</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>sucrose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>G Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Quality Biological</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>glucose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>ascorbic acid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>Alomone</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>gluconic acid</td><td>Sigma</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Cesium hydroxide solution</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm&nbsp;</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>alleen gebruiken voor het snijden van de dura, kan beschadigd raken als u botten snijdt</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>A-M Systems</td><td>Isolated Pulse Stimulator Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden</td><td>Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2</td><td></td></tr></tbody></table>

de voorbereiding van de oblique spinal cord slices voor ventral root stimulation

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Elektrofysiologische opnames van ruggenmergsneden zijn een waardevolle techniek gebleken om een breed scala aan vragen te onderzoeken, van cellulaire tot netwerkeigenschappen. We laten zien hoe je levensvatbare schuine sneden van het ruggenmerg van jonge muizen (P2 - P11) kunt bereiden. In deze voorbereiding behouden de motoneuronen hun axonen die uit de ventrale wortels van de ruggengraat komen. Stimulatie van deze axonen veroorzaakt teruggaande actiepotentialen die de motoneuron somas binnendringen en de motoneuron collateralen in het ruggenmerg exciteren. Opname van antidrome actiepotentialen is een onmiddellijke, definitieve en elegante manier om motoneuron-identiteit te karakteriseren, die andere identificatiemethoden overtreft. Bovendien is het stimuleren van de motoneuron collateralen een eenvoudige en betrouwbare manier om de collaterale doelen van de motoneuronen in het ruggenmerg te exciteren, zoals andere motoneuronen of Renshaw-cellen. In dit protocol presenteren we antidrome opnames van de motoneuron somas evenals Renshaw-cel excitatie, resulterend uit ventrale wortel stimulatie.

Bevestiging van de motoneuron-identiteit met behulp van antidrome actiepotentialen
Cel-targeting
Motoneuronen bevinden zich in het ventrale hoorn (zichtbaar in rood in Figuur 2C). Begin bij de bundel axonen die de ventrale wortel vormt en ga omhoog tot de bundel volledig uiteenvalt en men grote cellen begint te zien (lan...

We laten zien hoe we schuine plakjes van het ruggenmerg in jonge muizen bereiden. Deze voorbereiding maakt de stimulatie van de ventrale wortels mogelijk.

De Voorbereiding van de Oblique Spinal Cord Slices voor Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Het algemene doel van deze procedure is het bereiden van schuine coupes van het ruggenmerg die stimulatie van de ventrale wortels mogelijk maken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het motoneurale identificaties mogelijk maakt voor stimulatie van de ventrale wortels en voor het bestuderen van de ventrale cellen die worden geïnnerveerd door motoneurale axonale collateralen. We kwamen oorspronkelijk op het idee voor deze methode toen we op zoek waren naar een betrouwbare manier om ventrale cellen te stimuleren.Personen die nieuw zijn met deze methode zullen moeite hebben vanwege de complexiteit bij het correct uitvoeren van de verschillende stappen van de dissectie. Begin met het perfunderen van een P2 tot P11 muis met natriumarme ACSF. Decapiteer vervolgens de muis, verwijder de huid op de rug en maak twee sneden door de schouders en langs de ribbenkast.Snijd vervolgens het ruggenmerg zo laag mogelijk in het caudale gedeelte door om de wervelkolom en ribben te scheiden van het onderste deel van het dier. Draai de wervelkolom om en verwijder de viscera die nog aan de ribben vastzitten. Verplaats de wervelkolom naar een andere, kleinere Petri-schaal gevuld met siliconen.Voeg koude ACSF toe en laat carbogen doorstroomen; gebruik vier insectenspeldjes om het weefsel met de dorsale zijde naar boven vast te zetten. Voer vervolgens een laminectomie van de dorsale zijde uit door eerst de punt van een fijne schaar tussen het bot en het ruggenmerg te plaatsen en het bot vanaf het rostrale uiteinde door te snijden, waarbij u ervoor zorgt dat u uit de buurt van de witte stof blijft. Wissel de sneden per zijde af, terwijl u een pincet gebruikt om de reeds weggesneden botstrook vast te houden.Gebruik vervolgens een kleine pincet om de dura op te tillen en een kleine schaar om langs de rostrale caudale toegang aan beide zijden te knippen. Het verwijderen van de dura is een kritische stap. Het loont zeker om hier een paar minuten extra aan te besteden om dit grondig uit te voeren.Zodra de dura is verwijderd, wordt een stompe glazen tip gebruikt om het ruggenmerg voorzichtig naar de linkerkant van de groef te duwen die is ontstaan door de half doorsneden wervelkolom. Snijd vervolgens de ventrale en dorsale wortels aan de heldere zijde zo ver mogelijk weg van de plek waar ze het ruggenmerg binnengaan. Herhaal deze handeling aan de linkerkant, waarbij altijd van rostral naar caudaal wordt gewerkt.Schuif na de dissectie het ruggenmerg uit de wervelkolom. Gebruik vervolgens een kleine insectennaald om het merg met de dorsale zijde naar boven vast te zetten. Verwijder voorzichtig alle resten van vastzittend membraan.Trim na het reinigen beide uiteinden van het ruggenmerg en steek een gebogen insectenpeld in het anterieure deel van het ruggenmerg om de oriëntatie te markeren. Breng het ruggenmerg vervolgens over naar ijskoude intracellulaire oplossing. Koel daarna de eerder bereide gesmolten agar af op een mengsel van ijs en water.Roer in de agar terwijl de temperatuur wordt gemeten. Wanneer de temperatuur van de agar 38 graden Celsius bereikt, houdt u het ruggenmerg vast met de insectennaald en dompelt u het in de agar, met de rostrale zijde naar beneden. Zorg ervoor dat het ruggenmerg zo recht mogelijk ligt, vrij van de wanden, met het caudale deel lichtjes omhoog.Laat het bekerglas in het mengsel van ijs en water staan zodat de agar zo snel mogelijk rond het ruggenmerg kan stollen. Snij na stolling het agarbeblok met het ruggenmerg zodanig door dat de basis van het blok onder een hoek van 35 graden staat ten opzichte van het lumbale deel van het ruggenmerg. Het dorsale oppervlak moet van de basis afgekeerd zijn.Plak het blok in de kamer van de vibratoom met cyanoacrylaatlijm. Het is essentieel om het blok correct te monteren om de continuïteit van de motorische wortelbundels met de ventrale wortels waaruit ze voortkomen te behouden. Dompel het blok onder in een kaliumgluconaatoplossing.Stel de parameters van de vibratoom in. Snijd vervolgens 350 400 micron dikke coupes van de lumbale regio, die herkenbaar is aan de kromming en de grotere diameter. Breng de geschikte coupes over naar ACSF bij 34 graden Celsius.Meestal zijn er vier tot vijf geschikte coupes waarbij de ventrale wortels twee millimeter of meer uitsteken. Koel de coupes na ongeveer 30 minuten bij 34 graden Celsius af tot kamertemperatuur en begin vervolgens met de registratiesessie. Bereid vooraf een doos met diverse pipetten voor met tipdiameters variërend van 40 tot 170 micron.Om de sectiepipetten voor te bereiden, selecteert u pipetten met een lange tapsheid. Maak vervolgens met een diamantmes inkepingen op verschillende posities en breek elke pipette onder een dissectiemicroscoop door op de punt te tikken met een pincet. Verwijder daarna de kamer uit de registratiemicroscoop en plaats deze onder een dissectiemicroscoop.Selecteer een plakje dat een ventrale wortel bevat met voldoende lengte om op een zuigstimulatie-elektrode te worden gemonteerd. Monteer het plakje, waarbij de ventrale wortels naar boven zijn georiënteerd, snijd vervolgens voorzichtig de agar rond de ventrale wortels weg terwijl de rest van de agar rond het plakje behouden blijft, en plaats het rooster om het monster op zijn plaats te houden. Plaats de kamer terug op de microscoop en perfuseer de registratiekamer continu met ACSF met een snelheid van één tot twee milliliter per minuut bij kamertemperatuur.Zuig met een glaspipet gevuld met ACSF en verbonden met een spuit een van de ventrale wortels op. Om een goede stimulatie van de ventrale wortel te bereiken, moet de pipetpunt strak rond de ventrale wortel sluiten. Voer een patch-clamp registratie uit van het gewenste celtype en registreer het effect van de stimulatie van de ventrale wortel zoals eerder beschreven.Deze afbeelding toont de resultaten van voltage-clamp metingen. De opnames in de bovenste panelen zijn afkomstig van andere motoneuronen dan die in de onderste panelen. Het bovenste paneel toont de antidrome respons van een motoneuron op een stimulatie van één volt in het rood, en een stimulatie van vijf volt in het zwart.Het onderste spoor toont de orthodrome actiepotentiaalrespons op een stimulatie van 20 volt in rood, en een stimulatie van 30 volt in zwart. Zwarte stippen geven het tijdstip van de stimulatie aan. De dubbele pijlvormen benadrukken het verschil in latenties tussen ortho- en antidrome spikes.Hier worden current clamp-opnames getoond. Het bovenste paneel toont de antidrome respons op stimulaties van 10 volt en 15 volt in respectievelijk rood en zwart. Het onderste paneel toont de orthodrome respons op stimulaties van 25 en 40 volt in respectievelijk rood en zwart.Opnieuw worden de timing van de stimulus en de verschillen in latenties aangegeven. Deze afbeelding van de Renshaw-celpool is verkregen met een schuine condensor en een 20x objectief. Let op de motoneuronaxonen die samenvloeien in de ventrale wortel, zoals aangegeven door de pijl.Deze afbeelding van hetzelfde gebied is genomen met een 40x objectief. Vermoedelijke Renshaw-cellen zijn aangegeven met pijlpuntjes. Hier wordt een voltage-clamp registratie van een Renshaw-cel getoond na stimulatie van de ventrale wortel, aangegeven door de zwarte stip.QX-314 in de intracellulaire oplossing voorkwam dat de cel vuurde, en glycine- en gaba-responsen werden respectievelijk geblokkeerd door 3 micromolar gabazine en één micromolar strychnine. De rode lijn is het gemiddelde van de grijze lijnen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 20 of 30 minuten worden uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het preparaat te allen tijde in koud medium moet blijven. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u schuine coupes van het ruggenmerg bereidt die geschikt zijn voor stimulatie van de ventrale wortel. Ventrale-wortelstimulatie kan worden gebruikt om eenvoudig de motoneurale identiteit te bevestigen en, belangrijker nog, om de ventrale cellen betrouwbaar te stimuleren.

the-preparation-oblique-spinal-cord-slices-for-ventral-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven de procedures voor de voorbereiding en elektrofysiologische opname van de hersenen plakken dat de dorsale-ventrale as van de mediale entorhinale cortex (MEC) te handhaven. Omdat neurale codering van de locatie volgt een rug-buik organisatie binnen de MEC, deze procedures te vergemakkelijken onderzoek van cellulaire mechanismen van belang voor de navigatie en het geheugen.

Voorbereiding van Parasagittal Slices voor onderzoek naar Dorsale-ventrale Organisatie van het knaagdier Medial entorhinale cortex

This video describes the in vivo intracellular recording of rat motoneurons under trans-spinal direct current stimulation. The protocol describes how to measure membrane properties and record the rhythmic firing of motoneurons before, during, and after anodal or cathodal polarization of the spinal cord.

Trans-Spinal Direct Current Stimulation of a Rat&#39;s Spinal Motoneuron

This video demonstrates a microelectrode array-based assay for studying neuronal network activity in mouse spinal cord sections. First, the electrophysiological activity from the superficial dorsal horn (SDH) of the slice is recorded. Then, a potassium channel inhibitor is introduced to prolong depolarization, resulting in synchronous rhythmic activity across the neuronal network.

Microelectrode Array-Based Assessment of Neuronal Networks in Mouse Spinal Cord Slices

Het opnemen van Ca2+ stromen op het presynaptische afgiftevlak van het membraan is essentieel voor een nauwkeurig begrip van Ca2+-intrede en neurotransmitterafgifte. We presenteren een acute dissociatie van het rugsmerg van de kaakhaai die functionele geïsoleerde reticulospinale axonen oplevert, waardoor opname direct vanaf het afgiftevlak van het membraan van individuele presynaptische terminalen mogelijk is.

Acute Dissociatie van Lamprey Reticulospinal Axonen naar Opnemen inschakelen van de Release Gezicht Membraan van individuele functionele Presynaptische Terminals

De werkzaamheid van intramusculaire opname en retrograad transport van moleculen naar corresponderende motorische neuronen hangt af van de locatie van de injectieplaatsen ten opzichte van de motorische eindplaten (MEP's). Hier beschrijven we hoe je MEP's op skeletspieren kunt lokaliseren om het retrograad transport van tracers naar motorische neuronen te optimaliseren.

Intramusculaire injecties Langs de Motor End Plates: een minimaal invasieve benadering van Shuttle Tracers Rechtstreeks in Motor Neuronen

Hier beschrijven we de essentiële stappen voor geheel-cel patch-clamp opnamen gemaakt van substantia gelatinosa (SG) neuronen in het ruggenmerg in vitro segment. Met deze methode kunt de eigenschappen van het intrinsieke membraan, synaptische transmissie en morfologische karakterisering van SG neuronen worden bestudeerd.

Voorbereiding van Acute ruggenmerg segmenten geheel-cel Patch-clamp opname in neuronen van de Substantia Gelatinosa

Dit protocol zowel visueel communiceert de hersenstam-ruggenmerg voorbereiding en de voorbereiding van de hersenstam dwarse segmenten verduidelijkt in een uitgebreide stapsgewijze manier. Het werd ontworpen om de reproduceerbaarheid verhogen en de kans voor het verkrijgen van levensvatbare, langdurig, ritmisch-actieve segmenten voor het opnemen van neurale uitvoer uit de luchtwegen gebieden van de hersenstam te verbeteren.

Voorbereiding van ritmisch-actief In Vitro neonatale knaagdier hersenstam-ruggenmerg en dun plakje

Dit protocol beschrijft in vivo intracellulaire opname van rat lumbale motoneurons met gelijktijdige trans-spinale directe stroom stimulatie. De methode stelt ons in staat om membraaneigenschappen te meten en ritmisch afvuren van motoneurons op te nemen voor, tijdens en na anodale of kathodale polarisatie van het ruggenmerg.

In Vivo intracellulaire opname van type-geïdentificeerde Rat Spinal Motoneurons tijdens trans-spinale directe stroomstimulatie

Integratie van diverse synaptische ingangen naar neuronen wordt het best gemeten in een preparaat dat alle pre-synaptische kernen voor natuurlijke timing en circuit plasticiteit behoudt, maar hersenen plakjes meestal verbreken veel verbindingen. We ontwikkelden een gemodificeerde hersenen slice na te bootsen in vivo circuit activiteit met behoud van in vitro experimentatie vermogen.

In Vitro Wedge Slice Voorbereiding voor het nabootsen van in Vivo Neuronal Circuit Connectiviteit

Het gecombineerde gebruik van micro-elektrode array-technologie en 4-aminopyridine-geïnduceerde chemische stimulatie voor het onderzoeken van nociceptieve activiteit op netwerkniveau in de dorsale hoorn van het ruggenmerg wordt geschetst.

Netwerkactiviteit opnemen in spinale nociceptieve circuits met behulp van micro-elektrodearrays

Dit protocol beschrijft een methode met behulp van een patch-clamp om de elektrische reacties van motorneuronen op ruggenmergstimulatie (SCS) met een hoge spatiotemporele resolutie te bestuderen, wat onderzoekers kan helpen hun vaardigheden te verbeteren bij het scheiden van het ruggenmerg en het tegelijkertijd handhaven van de levensvatbaarheid van de cel.

De ex vivo bereiding van een doorsnede van het ruggenmerg voor de opname van de patchklem in motorneuronen met hele cellen tijdens stimulatie van het ruggenmerg

Leer hoe u schuine ruggenmergsneden van jonge muizen bereidt voor ventrale wortelstimulatie. Deze techniek maakt betrouwbare identificatie van motorneuronen en studie van ventrale cellen mogelijk.

De Voorbereiding van de Oblique Spinal Cord Slices voor Ventral Root Stimulation

Meer video's verkennen