Name: Levering van nucleïnezuren door middel van Embryo micro-injectie in de Worldwide Landbouw Pest Insect, Middellandse-Zeevlieg (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer nucleïnezuren leveren aan Ceratitis capitata embryo's via micro-injectie. Deze methode genereert transgene stammen voor genetisch onderzoek en verbetert plagenbeheersing in de landbouw.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen alle leden van het laboratorium "Insect Genetics and Genomics" bedanken, met name Lorenzo Ghiringhelli die de afgelopen dertig jaar heeft gewerkt aan het ontwikkelen, aanpassen en onderhouden van de kweek van de fruitvlieg. Een deel van de representatieve resultaten van dit artikel zijn herdrukt uit N. Biotechnology, 25(1) door Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, met toestemming van Elsevier (Licentienummer 3796240759880). Dit werk ontving steun van Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1. Experimental Set-up <ol><li> insectary eisen <ol><li> Onderhouden van alle C. capitata levensstadia bij 25 ° C, 65% luchtvochtigheid en 12/12 uur licht / donker fotoperiode. </li><li> Plaats ongeveer 1500-2000 medfly poppen in een 6 L kooi. Gebruik een kooi met een koperen gaas aan de ene kant met gaten klein genoeg om ovipositie 42 stimuleren. Plaats een spons strip door een kleine opening in de basis van de kooi om vliegen met water te verschaffen door middel van capillaire werking. Gebruik een mengsel van gist en suiker (01:10) als voedselbron voor volwassenen (Figuur 1A). Verhoog de hoeveelheid gist (tot 1: 3, gist: suiker) moet de vrouwtjes niet om eieren te leggen. </li><li> Plaats een bord gevuld met water onder de kooi om de eieren afgezet door de mazen te verzamelen. Zoals maagdelijke vrouwtjes eieren leggen, wachten tot de vliegen zijn ten minste 6-7 dagen voor het verzamelen van eieren voor de micro-injectie experimenten. Dit zal ervoor zorgen dat de vrouwtjes zullen gepaard hebbenen dat de eieren zijn bevrucht. </li><li> Verzamel de eieren door het filteren van het water met een fijne net zeef. Breng de eitjes uit de zeef in een plastic doos met standaard larven eten (1,5 LH 2 O, 100 ml HCl 1%, 5 g breedspectrum antimicrobiële stof opgelost in 50 ml ethanol, 400 g suiker, 175 g gedemineraliseerd biergist, 1 kg zachte tarwezemelen) met een Pasteur pipet. </li><li> Plaats elke doos in een transparante container afgesloten met een netto-deksel om luchtcirculatie mogelijk te maken en met een laag van zemelen te verpoppen (Figuur 1B) te bevorderen. </li><li> Na ongeveer 10 dagen, te controleren op 3 e instar larven die voortkomen uit de larven eten en spring naar beneden in de zemelen laag voor de verpopping. </li><li> 24 uur later, het verzamelen van de poppen in een kleine beker met behulp van een zachte borstel en overbrengen naar een nieuwe volwassen kooi. Volwassenen normaal ontstaan ​​10 dagen na verpopping. De opkomende fly maakt gebruik van de ptilinum, een opblaasbare zak zich op zijn hoofd boven the basis van de antennes, kracht van het uiteinde van de puparium. Na de opkomst, de ptilinum stort definitief terug in het hoofd. </li></ol></li><li> Bereiding van 1 L voedsel voor de micro-injectie larven <ol><li> Los op 2,5 g agar in 300 ml H2O </li><li> Warm 500 ml H 2 O op een hete plaat roeren en los 4 g natriumbenzoaat, 4,5 ml 37% HCl, 42 g gistextract en 115 g gedroogde wortel poeder. </li><li> Toevoegen aan het mengsel een oplossing van 2,86 g breedspectrum antimicrobiële stof opgelost in 10 ml absolute ethanol. </li><li> Verdeel het medium in 15 cm rond petrischaaltjes en laat afkoelen. Eventueel, bewaren bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Slide voorbereiding <ol><li> Plaats een 2 cm strook dubbelzijdig plakband op een microscoopglaasje (75 x 26 mm 2) en markeer de randen met een porseleinen marker, olie verspreid en de daaruit uitdrogen van de geïnjecteerde embryo&#39;s te voorkomen. </li></ol></li><li><strong&gt; Nucleic Acid Voorbereiding <ol><li> Isoleer plasmide-DNA met behulp van commercieel verkrijgbare kits 34. Precipitaat het plasmide met behulp van ethanol en resuspendeer in injectie buffer (0,1 mM fosfaatbuffer pH 7,4, 5 mM KCl) in de gewenste concentratie. </li><li> Zuiver in vitro gesynthetiseerd lange dsRNA met behulp van fenol-chloroform, neer te slaan met behulp van isopropanol en resuspendeer in injectie buffer 43. </li></ol></li></ol> 2. Embryo Voorbereiding <ol><li> Plaats een bak gevuld met water onder een kooi met 6-7 dagen oude volwassenen. </li><li> Laat de vrouwtjes eieren leggen gedurende 30 min en vervolgens het verzamelen van de embryo&#39;s door het filteren van het water met behulp van een fijne zeef. Houd altijd de zeef in water om uitdrogen van de embryo&#39;s te vermijden. </li><li> Dechorionate de embryo&#39;s door alom tegenwoordige de zeef gedurende 5 sec in een commercial van 50% bleekwater oplossing. </li><li> Was de embryo&#39;s zorgvuldig door herhaaldelijk alom tegenwoordige de zeef in een schone ultrapuur water (minstens4-5 keer). Tot slot plaatst u de zeef in een schone ultrapuur water. Gebruik de embryo&#39;s binnen maximaal 2 uur. OPMERKING: De timing van microinjectie is gerelateerd aan de noodzaak te injecteren in vooraf blastoderm embryo, tijdens een fase van nucleaire divisies vóór cellularization. Hierdoor kan de geïnjecteerde DNA te nemen boven in de kernen, in het bijzonder in de primordiale kiemcellen celkernen dat de gameten zal ontstaan. In Drosophila, cellularization op de paal cellen begint ongeveer 90 minuten na de bevruchting (bij 25 ° C), met blastoderm vorming optreedt ongeveer 30 minuten later 44, terwijl in de medfly cellularization plaatsvindt tussen 9 en 12 uur 45,46. </li><li> Embryo oriëntatie in rijen <ol><li> Met behulp van een fijn penseel, verzamelen ongeveer 50 embryo&#39;s en leg ze op een schijf van zwarte filter papier doorweekt met water. </li><li> Onder een dissectie stereomicroscoop, regelen de embryo&#39;s in een rij op het bovenoppervlak van de dubbelzijdige tapede microscoop dia met een fijn penseel (000) (figuur 1C). LET OP: Breng de embryo&#39;s allemaal in dezelfde richting, als injectie wordt uitgevoerd in het achterste paal, waar de kiem-lijn zal zijn ontstaan; de achterpool tegengesteld is aan de micropyle regio. </li><li> Bedek de embryo&#39;s met een laag van chloortrifluorethyleen olie om ervoor te zorgen dat de olie niet overlopen china marker grenzen (zie 1.3). Opmerking: Voor afdekking van de embryo met olie, een verdere stap kan worden uitgevoerd: het embryo kan worden gedroogd gedurende enkele minuten om de vloeistof te verlagen en daarmee de ingang van de geïnjecteerde DNA-oplossing te vergemakkelijken. Dit kan helpen bij injectie of overmatig lekken van de geïnjecteerde oplossing voorkomen embryo barsten als gevolg van de hoge vloeistofdruk. </li></ol></li></ol> 3. Embryo Micro-injectie <ol><li> Vul een naald (1-2 ul) met plasmide DNA of dsRNA oplossing (1-2 ug / ul) met een micropipet. </li><li&gt; Sluit de naald op de micro-injectie apparaat, waarbij de injectie tijd (0,5 sec) controleert, de druk (800 hPa) en de tegendruk (150 hPa). </li><li> Voer microinjectie onder een stereomicroscoop, met een micromanipulator om de bewegingen van de naald (figuur 1D) regelen. Gebruik de microscoop podium aan de dia te verplaatsen. <ol><li> Plaats het preparaat op het stadium van het toepassingsgebied. </li><li> Steek de punt van de naald in de achterste pool van de embryo (figuur 1E). </li><li> Injecteer de oplossing door het activeren van de micro-injectie-systeem met het pedaal. De geïnjecteerde vloeistof induceert een toename van de inwendige druk, resulterend in een lichte beweging van de embryo. </li><li> Laat het pedaal en meteen, maar voorzichtig, verwijder de naald uit het embryo. </li><li> Observeer een beetje cytoplasma lekkage op de injectieplaats. OPMERKING: Om onderscheid te maken tussen potentiële dodelijke effecten van DNA / dsRNA / siRNA en sterfte als gevolg van de micro-injectie proprocedure zelf, moet controle-experimenten worden uitgevoerd. Deze omvatten de injectie van alleen buffer of, in het geval van omgekeerde genetica experimenten, een groen fluorescerend eiwit (GFP) -afgeleide dubbelstrengs RNA (dsRNA-GFP) of siRNA. </li></ol></li><li> Na injectie incubeer de embryo&#39;s bij 25 ° C. </li></ol> 4. na injectie Procedures <ol><li> Twee dagen na de injectie, controleer dan de dia&#39;s voor uitgekomen larven (figuur 1F) onder een stereomicroscoop. Larven kunnen bewegen in de olie, maar moeten zo snel mogelijk worden overgedragen aan larven eten. Om deze reden is, controleert u de dia&#39;s meerdere keren per dag. </li><li> Met behulp van een fijn penseel (000), zachtjes de uitgekomen larven te dragen aan de wortel-gebaseerde larven eten. Transfer tot maximaal 200 larven per elke petrischaal. </li><li> Incubeer de larven aan 65% vochtigheid (25 ° C). Zorg ervoor dat het deksel kleeft niet aan het gerecht, afbreuk te doen aan de uitwisseling van lucht. </li><li> Houd de Petrischalen met het dekselmeestal gesloten, zodat er nog luchtstroom naar de larven. Om uitdroging te voorkomen, controleert u de gerechten dagelijks en, indien nodig, voeg water toe om te compenseren voor verdamping. </li><li> Leg de Petrischalen in een duidelijke container afgesloten met een netto-deksel en met een laag van zemelen te verpoppen bevoordelen. Zoals voor routine insectary opfok, 3 e instar larven sprong uit de larvale voedsel en verpoppen in de zemelen. </li><li> Verzamel de poppen en leg ze in een kleine kooi voor volwassen opfok en screening (dit is Generation 0, G0). Achter het nageslacht op standaard larvale voedsel. </li><li> In het geval van kiem-lijn transformatie-experimenten, controleren op mogelijke omgevormd individuen in de volgende generatie (G1), zoals geïnjecteerd individuen meestal hersenschimmen. Transposities inderdaad zou kunnen optreden in een van de kernen van de embryonale syncytium, waarbij ofwel de kiemlijn of soma zal vormen. <ol><li> Kort na opkomst, verdoven G1 individuen met behulp van CO 2 en controleer transformatie gebeurtenissen onder een epifluorescentie stereomicroscoop. Om te screenen op de aanwezigheid van rode fluorescentie, gebruik dan een DsRedwide filter (Ext 546/12;.. Emm 605/75), terwijl voor het screenen op groene fluorescentie gebruik maken van de EYFP filter (Ext 500/20;.. Emm 535/30) . </li><li> Plaats veranderd individuen in een kleine kooi met wildtype volwassenen van het andere geslacht en ontstaan ​​nieuwe, aanvankelijk heterozygoot stam. </li></ol></li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Micro-injectie van nucleïnezuren in insectencellen embryo is een universele techniek die zowel de analyse van genfuncties en biotechnologische toepassingen vergemakkelijkt. De recente publicatie van de genoomsequenties van steeds insectensoorten leidt tot een dringende behoefte aan instrumenten voor de functionele karakterisering van genen van nog onbekende functie. RNA-interferentie heeft bewezen een van de meest waardevolle methoden om moleculaire functies 49 afleiden en embryo ...

De Mediterrane fruitvlieg (medfly) Middellandse-Zeevlieg is een kosmopolitische soort die op grote schaal schade fruit en cultuurgewassen. Het behoort tot de familie Tephritidae, die verschillende soorten ongedierte, zoals die welke behoren tot de geslachten Bactrocera en Anastrepha omvat. De medfly is de meest bestudeerde soorten van deze familie, en het heeft een model niet alleen voor de studie van insecten invasies 1, maar ook voor het optimaliseren gewasbeschermingstrategieën 2 geworden. De medfly is een multivoltine soort die kan aanvallen meer dan 300 soorten wilde en gekweekte planten 3,4. De schade wordt veroorzaakt door zowel de volwassenen als de larvale stadia: bevruchte vrouwtjes doorboren het oppervlak van de vrucht voor het leggen van eitjes, waardoor micro-organismen om hun commerciële kwaliteit beïnvloeden, terwijl de larven voeden zich met het vruchtvlees. Na drie larvale stadia, larven van de gastheer en verpoppen in de bodem. Ceratitiscapitata toont een bijna wereldwijde distributie, met inbegrip van Afrika, het Midden-Oosten, West-Australië, Midden- en Zuid-Amerika, Europa en delen van de Verenigde Staten 5. De meest voorkomende strategieën te beperken medfly parasitaire aandoeningen gepaard met het gebruik van insecticiden (bijv Malathion, spinosad) en de milieuvriendelijke Steriele Insect Techniek (SIT) 6. De laatste benadering betreft de introductie in het wild van honderdduizenden mannen gemaakt steriel door blootstelling aan ioniserende straling. Het koppelen van dergelijke gesteriliseerde mannetjes wild vrouwtjes resulteert in geen nageslacht, waardoor een verkleining populatie, uiteindelijk leidend tot uitroeiing. Hoewel SIT effectief in meerdere campagnes wereldwijd heeft bewezen, haar belangrijkste nadelen zijn de hoge kosten van het grootbrengen en steriliseren miljoenen insecten worden vrijgegeven. Markering van de vrijgelaten personen is noodzakelijk om onderscheid te maken steriele van wilde insecten gevangen in het gebied tijdenstoezicht op de activiteiten en het wordt momenteel bereikt met behulp van fluorescerende poeders. Deze procedures zijn duur en ongewenste neveneffecten 7. Om te optimaliseren en / of effectievere aanpak voor de bestrijding van deze plagen te ontwikkelen, hebben medfly biologie en genetica grote schaal onderzocht door vele onderzoekers wereldwijd. De beschikbaarheid van de genoomsequentie 8,9 medfly zullen nieuwe onderzoeken naar genfuncties vergemakkelijken. RNA-interferentie is een krachtig hulpmiddel voor dergelijke studies en kan worden bereikt door de micro-injectie van dsRNA (dubbelstrengs RNA) of siRNA (kleine interfererende RNA). Deze techniek is gebruikt, bijvoorbeeld aantonen dat de geslachtsbepaling moleculaire cascade in C. capitata slechts gedeeltelijk geconserveerd ten opzichte van die van Drosophila 10. De ontwikkeling van protocollen bij medfly embryo&#39;s toegestaan C. microinject capitata de eerste niet zijn-Drosophilid Fly soorten genetisch te modificeren. Zoals de eieren zijn vergelijkbaar met die van Drosophila, zowel qua morfologie en weerstand tegen uitdroging 11 het protocol om plasmide DNA te leveren in pre-embryo blastoderm eerst ontwikkeld D. melanogaster 12,13 werd aanvankelijk aangepast voor gebruik in C. capitata. Deze eerste experimenten toegestaan medfly kiemlijn transformatie op basis van het transponeerbare element Minos 11. Vervolgens werd het oorspronkelijke systeem gemodificeerde 14 op andere transposon gebaseerde benaderingen. Dit is het geval van piggyBac van de Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Het protocol is inmiddels verder geoptimaliseerd en dit heeft de transformatie van andere Tephritid soorten 16-21 en ook van vele andere Diptera 22-31 toegestaan. Al deze systemen zijn gebaseerd op het gebruik van een typische binaire vector / helper plasmide transformatiesysteem: kunstmatige defecte transpozonen die gewenste genen worden samengevoegd in plasmide-DNA en in het genoom van het insect geïntegreerde, door in de transposase enzym 32. Een aantal transgene medfly lijnen werden gegenereerd, met meerdere functies, waaronder stammen die een conditionele dominant letale gen dat letaliteit induceert, stammen die alleen mannen nageslacht en dus zonder eigen extra sexing strategieën en stammen met fluorescerende sperma, die de nauwkeurigheid kunnen versterken van het SIT toezichtsfase 33-37. Hoewel de inbreng in het wild transgene organismen opgetreden in piloottesten tegen muggen slechts 38,39, ten minste één onderneming evalueren van een aantal transgene stammen medfly voor het gebruik in het veld 40. Embryo micro-injectie kan ook voorstander van de ontwikkeling van nieuwe genoom-editing tools, zoals transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens), geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom herhalingen (CRISPR) / CRISPR geassocieerd eiwit 9 nuclease (Cas9) en homing endonucleases genen (HEGS), die nieuwe evolutionaire en ontwikkelingsstudies in staat zal stellen, alsook de uitbreiding van de beschikbare biotechnologische gereedschapskist. Genoom-editing benaderingen al kon de generatie van gen-aandrijfsystemen in muggen 41, en hun overdracht aan de medfly staat voor de deur. Hier beschrijven we een algemeen protocol voor microinjecting nucleïnezuren in medfly embryo&#39;s die nuttig kunnen zijn voor alle bovengenoemde toepassingen.

<table><tbody><tr><td>1 x injectie Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1 mM fosfaatbuffer pH 7.4, 5&nbsp;mM KCl</td></tr><tr><td>Construct Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helper Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td>Fenol-Chloroform gezuiverd</td></tr><tr><td>Standaard larvenvoer</td><td></td><td></td><td>1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g breedspectrum antimicrobieel middel gebruikt in farmaceutische producten opgelost in 50&nbsp;ml ethanol, 400 g suiker, 175 g gedemineraliseerde brouwersgist, 1 kg zachte tarwezemelen</td></tr><tr><td>Wortel larvenvoer</td><td></td><td></td><td>2.5 g agar, 4 g natriumbenzoaat, 4.5 ml 37% HCl, 42 g gistextract, 115 g wortelpoeder, 2.86&nbsp;g breedspectrum antimicrobieel middel, water tot 1 L</td></tr><tr><td>Voer voor volwassenen</td><td></td><td></td><td>gistextract en suiker (1:10)</td></tr><tr><td>Microscoopglazen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z692247</td><td></td></tr><tr><td>Injectienaalden&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956000</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Dubbelzijdig plakband</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman zwarte cirkelpapier</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695505</td><td></td></tr><tr><td>Bleekmiddel</td><td></td><td></td><td>Verdun 1:2 voor gebruik</td></tr><tr><td>Verfkwast (000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Femtojet</td></tr><tr><td>Volwassen kooitjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloortrifluorethyleenolie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Ceratitis capitata</td><td></td><td></td><td>De gebruikte stam is ISPRA</td></tr></tbody></table>

levering van nucleïnezuren door middel van embryo micro-injectie in de worldwide landbouw pest insect,<em&gt; middellandse-zeevlieg</em

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

De Mediterrane fruitvlieg (medfly) Middellandse-Zeevlieg (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is een schadelijke soorten met een extreem hoge agrarische relevantie. Dit is te wijten aan het voortplantingsgedrag: vrouwtjes schade aan de buitenkant van groenten en fruit als ze eieren en de larven voeden zich met hun pulp te leggen. Wild C. capitata populaties zijn traditioneel gecontroleerd door middel van insecticide sproeien en / of eco-vriendelijke benadering, de meest succesvolle zijn de Steriele Insect Techniek (SIT). Het SIT is gebaseerd op massa-fokken, straling gebaseerde sterilisatie en veld vrijlating van de mannen die hun vermogen om te paren te behouden, maar zijn niet in staat om vruchtbaar nageslacht te genereren. De komst en de daaropvolgende snelle ontwikkeling van biotechnologische hulpmiddelen, evenals de beschikbaarheid van de medfly genoomsequentie, sterk gestimuleerd ons begrip van de biologie van deze soort. Dit voordeel van de proliferatie van nieuwe strategieën voor genoom manipulatie, die can worden toegepast controlepopulatie. In deze context, embryo micro-injectie speelt een dubbele rol in de uitbreiding van de toolbox voor medfly controle. Het vermogen om te interfereren met de functie van genen die belangrijke biologische processen reguleren inderdaad vergroot ons begrip van de moleculaire machinerie onderliggende medfly invasiviteit. Bovendien de mogelijkheid om kiemlijn transformatie te bereiken maakt de productie van meerdere transgene stammen die kunnen worden getest voor toekomstige veldtoepassingen in nieuwe SIT instellingen. Inderdaad, kan genetische manipulatie worden gebruikt om gewenste eigenschappen die kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om steriele mannelijke prestaties in het veld te verlenen, of die leiden tot vroege levensfase letaliteit. Hier beschrijven we een methode om nucleïnezuren microinject in medfly embryo&#39;s van deze twee belangrijke doelen te bereiken.

Hier beschrijven we twee toepassingen van micro-injectie embryo gericht op de functionele karakterisatie van een gen van belang (Geval 1), en bij het genereren van transgene stammen (Geval 2), respectievelijk. Levering van dsRNA tot embryo&#39;s om de functie van genen te ontrafelen. De innexin 5-gen codeert voor een gap-junction dat in insecten, wordt spec...

De mediterrane fruitvlieg (Ceratitis capitata) (Diptera: Tephritidae) is een wereldwijde plaag in de landbouw. Een dieper begrip van zijn biologie is cruciaal voor het beheersen van fruitvliegpopulaties en daarmee het verminderen van de economische impact. Micro-injectie van embryo's is een fundamenteel hulpmiddel dat zowel transformatie van de kiemlijn als reverse genetica studies in deze soort mogelijk maakt.

Levering van nucleïnezuren door middel van Embryo micro-injectie in de Worldwide Landbouw Pest Insect,<em&gt; Middellandse-Zeevlieg</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Het algemene doel van deze procedure is het afleveren van nucleïnezuren in de embryo's van Ceratitis Capitata, een belangrijke landbouwplaag, om uiteindelijk de instrumenten voor de bestrijding ervan uit te breiden. Deze methode helpt bij het functioneel corrigeren van genen in een immobiel organisme, alsof bij het genereren van transgene stammen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er zeer kleine hoeveelheden nucleïnezuren worden geïnjecteerd om de gewenste effecten te bereiken.Houd alle levensstadia van de medfly-kolonie aan bij 25 graden Celsius met een luchtvochtigheid van 65% en een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur donker, waarbij de lichtfase om 8 uur 's ochtends begint. Plaats een sponsstrip door een kleine opening in de bodem van de kooi om de vliegen via capillaire werking van water te voorzien. Richt een kooi van zes liter in en plaats hierin tussen de 1.500 en 2.000 pupae.Vul de kooi voor het voer met ongeveer 45 gram van een mengsel van gist en suiker in een verhouding van 1:10. Plaats ter verzameling van de eieren een schaal gevuld met water onder de kooi. De vrouwtjes zullen de eieren door het gaas afzetten, waarna deze in het water verzamelen.Omdat maagdelijke vrouwtjes eitjes kunnen leggen die niet bevrucht zijn, dient men te wachten tot de vliegen ten minste een week oud zijn voordat de eitjes worden verzameld, om er zeker van te zijn dat alle eitjes bevrucht zijn. Om de eitjes te verzamelen, wordt het water gefiltreerd met een fijne zeef. Breng vervolgens met een Pasteurpipet de eitjes over naar een plastic bak met ongeveer 0,5 liter standaard larvenvoedsel.Als er onvoldoende eieren zijn gelegd, verhoog dan het gistgehalte van het voer voor de volwassenen tot 25%. Plaats elke doos in een transparante container met een laag zemelen om de verpopping te bevorderen. Dek de container af met een netdeksel om luchtcirculatie mogelijk te maken. Controleer na ongeveer 10 dagen op derde-instar larven die naar de zemelenlaag zijn gesprongen voor de verpopping.Zodra ze zijn gevonden, dient men zich voor te bereiden op het controleren van de poppen op de volgende dagen. Gebruik om de pop te verzamelen een zachte kwast om ze uit de container te vegen. Verzamel de poppen in eerste instantie in een klein bekertje.Nadat de collecties zijn voltooid, worden de poppen overgebracht naar een nieuwe kooi voor volwassenen. De volwassenen zullen na ongeveer 10 dagen uitkomen. Bereid voor de micro-injectie vooraf objectglazen voor.Bevestig een strip dubbelzijdige tape van twee centimeter aan een objectglas en markeer de randen met een marker om een wand te creëren voor een olielaag die de embryo's gehydrateerd houdt. Om vers gelegde embryo's te verzamelen, laat je jonge bevruchte vrouwtjes gedurende 30 minuten eieren leggen op een nieuwe tray en verzamel vervolgens de embryo's. Om het chorion van de embryo's te verwijderen, dip je de zeef en de eieren gedurende vijf seconden in een commerciële 50% bleekmiddeloplossing.Het is van cruciaal belang om de embryo's niet te lang te bleken. Was de gebleekte embryo's onmiddellijk door de zeef voorzichtig in schoon ultrapuur water te dippen. Herhaal dit ten minste vier keer.Bewaar vervolgens de zeef in helder ultrapuur water en injecteer de embryo's binnen twee uur. Verzamel daarna met een fijn penseel ongeveer 50 embryo's en plaats deze op een schijfje zwart filterpapier dat met water is verzadigd. Plaats de embryo's onder een dissectiestereomicroscoop in een rij op de dubbelzijdige plakband van een geprepareerde microscoopglasplaat.Oriënteer alle embryo's in dezelfde richting. Het is belangrijk om de embryo's zorgvuldig te manipuleren, omdat het doorprikken van het embryonale membraan met het penseel schade kan veroorzaken die de overleving van het embryo vermindert. Bedek de embryo's nu met een laag chloortrifluoretheleenolie.De olie moet binnen de randen van de porseleinstift blijven. Zorg dat de olie niet over de randen stroomt. Vul met een micropipet de injectienaald met enkele microliters nucleïnezuuroplossing met een concentratie van één tot twee microgram per microliter.Sluit vervolgens de naald aan op het micro-injectieapparaat en stel dit zo in dat er een injectie van een halve seconde wordt gegeven bij 800 hectopascal met een tegendruk van 150 hectopascal. Gebruik voor de injectie een voetpedaaltrigger en hanteer de micromanipulator om de naald te besturen, terwijl u de tafelbediening gebruikt om het preparaat te verschuiven. Bevestig dat de injectiebolus correct wordt uitgestoten en richt de naald vervolgens op de posterieure pool van het eerste embryo in de rij.Beweeg de tafel om de naald in het embryo in te brengen en injecteer de bolus nucleïnezuren. De geïnjecteerde vloeistof zal een toename van de interne druk veroorzaken, wat leidt tot een lichte beweging van het embryo. Laat het pedaal los en verwijder onmiddellijk maar voorzichtig de naald uit het embryo.Er zal een kleine hoeveelheid cytoplasma lekken bij de injectieplaats. Dit is normaal. Als embryo's knappen tijdens de injectie, laat de embryo's dan enkele minuten uitdrogen voordat ze met olie worden bedekt.Breng na de injectie het preparaat over naar een petrischaal. Plaats een schijfje filterpapier in het deksel van de schaal. Bevochtig het filter met water en sluit de petrischaal af met paraffinefolie.Incubeer de kamer bij 25 °C. Controleer de objectglazen twee dagen na de injectie meerdere keren per dag op uitgekomen larven. Zoek naar larven in de olie en breng deze met een fijn penseel over naar een petrischaal met larvenvoer op basis van wortel.Vul elke petrischaal met maximaal 200 larven. De larven overleven niet lang in de olie, dus controleer regelmatig. Incubeer de larven met het deksel grotendeels gesloten, zodat er nog steeds luchtstroom naar de larven is.Controleer de schalen dagelijks en bereid het na een week voor om de larven te verzamelen door de schalen in een container met zemelen te plaatsen. Verzamel de poppen en verwacht dat ze kort daarna zullen uitkomen. Anestheseer de uitgekomen volwassenen later met koolstofdioxide en inspecteer ze op transformantie.Bij het screenen kan de mobilisatiemethode kritiek zijn. Volwassen medfly's kunnen worden geanestheseerd met ijs of CO2, maar langdurige blootstelling kan de overleving van andere exemplaren verminderen. Controleer op de aanwezigheid van rode fluorescentie met een DS red breedbandfilter.Of controleer op groene fluorescentie met behulp van een EYFP-filter. Plaats de getransformeerde individuen in een kleine kooi met wild-type volwassenen van het tegenovergestelde geslacht om een heterozygote stam te vestigen. In één experiment werd dubbelstrengs RNA gebruikt om de expressie van het inx5-gen te onderdrukken.De volwassen kiembaan van niet-geïnjecteerde controles lijkt zoals verwacht normaal, terwijl behandelde individuen onderontwikkelde testikels en eierstokken vertoonden. Kwantificering van de abundantie van inx5-transcripten in de abdomens van individuen van beide geslachten bevestigde de significant lagere expressie van het gen vergeleken met de controles. In een tweede experiment werden twee stammen met gelabelde zaadcellen gegenereerd waarbij de bèta-2 tubuline-promotor werd gebruikt om verschillende fluorescente markers aan te sturen.Transgene mannetjes vertoonden een duidelijk fluorescentiepatroon in het lichaam en in de testikels. Met deze video presenteren wij onze geoptimaliseerde protocollen voor het fokken en het micro-injecteren van nucleïnezuren in embryo's van de medfly. Zodra deze techniek beheerst is, kunnen er tot 1.000 embryo's worden geïnjecteerd gedurende een werkdag van acht uur.Na deze procedure kunnen andere metalen zoals thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine worden uitgevoerd om een nieuwe generatie medfly-stammen te ontwikkelen.

delivery-nucleic-acids-through-embryo-microinjection-worldwide

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Microinjection van Nasonia vitripennis embryo's is een essentiële methode voor het genereren van de wijzigingen van het erfelijk genoom. Hier beschreven is een gedetailleerde procedure voor microinjection en transplanteren van Nasonia vitripennis embryo's, die toekomstige genoom manipulatie in dit organisme aanzienlijk zal vergemakkelijken.

Embryo Microinjection en transplantatie techniek voor Nasonia vitripennis genoom manipulatie

Dit artikel demonstreert nieuwe technieken ontwikkeld voor mondelinge levering van double-stranded RNA (dsRNA) via de vaatbundels weefsels van planten voor RNA-interferentie (RNAi) in het floëem sap voederen van insecten.

Double-stranded RNA orale afleveringsmethoden voor het opwekken van RNA-interferentie in het floëem en Hemipteran insecten Plant-sap-voeding

Hier presenteren we protocollen voor het verzamelen en microinjecting precellular westelijke maïs rootworm embryo's bestemd voor de uitoefening van functionele-genomic assays zoals germline transformatie en CRISPR/Cas9-genoom bewerken.

Microinjection van Western maïswortelboorder, Diabrotica virgifera virgifera, embryo's voor Germline transformatie of CRISPR/Cas9 genoom bewerking

Hier presenteren we een protocol om Cricket eieren te injecteren, een techniek die als basismethode dient in vele experimenten in de cricket, inclusief, maar niet beperkt tot, RNA-interferentie en genomische manipulatie.

Het injecteren van gryllus krekel eieren

Dit protocol beschrijft micro-injectieprocedures voor Culex quinquefasciatus embryo's die zijn geoptimaliseerd om te werken met CRISPR/Cas9 genbewerkingstools. Deze techniek kan efficiënt site-specifieke, erfelijke, kiembaanmutaties genereren die kunnen worden gebruikt voor het bouwen van genetische technologieën in deze onderbelichte ziektevector.

Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus

We bieden een gedetailleerd protocol voor het fokken, micro-injectie van eieren en voor een efficiënte paring van de firebrat Thermobia domestica om mutante stammen te genereren en te onderhouden na genoombewerking.

Ei micro-injectie en efficiënte paring voor genoombewerking in de Firebrat Thermobia domestica

Hier beschrijven we methoden voor efficiënte pop- en volwassen injecties in Nasonia vitripennis als toegankelijke alternatieven voor embryomicro-injectie, waardoor functionele analyse van genen van belang mogelijk is met behulp van RNA-silencing via RNA-interferentie (RNAi) of gen knock-out via CRISPR / Cas9 genoombewerking.

Pupal en volwassen injecties voor RNAi en CRISPR Gen editing in Nasonia vitripennis

Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.

Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Hierin staan protocollen voor het verzamelen en micro-injecteren van precellulaire maïsplanthopperembryo's met als doel hun genoom te wijzigen via CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerking of voor de toevoeging van gemarkeerde transponeerbare elementen door kiembaantransformatie.

Micro-injectie van Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryo's voor CRISPR/Cas9 Genome Editing

Micro-injectietechnieken zijn essentieel om exogene genen in het genoom van muggen te introduceren. Dit protocol verklaart een methode die door het James-laboratorium wordt gebruikt om DNA-constructies in Anopheles gambiae-embryo's te micro-injecteren om getransformeerde muggen te genereren.

Micro-injectie methode voor Anopheles gambiae embryo's

Entomopathogene nematoden leven in symbiose met bacteriën en samen infecteren ze met succes insecten door hun aangeboren immuunsysteem te ondermijnen. Om onderzoek naar de genetische basis van nematodeninfectie te bevorderen, worden methoden beschreven voor het handhaven en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden.

Kweken en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden

Leer nucleïnezuren leveren aan Ceratitis capitata embryo's via micro-injectie. Deze methode genereert transgene stammen voor genetisch onderzoek en verbetert plagenbeheersing in de landbouw.

Levering van nucleïnezuren door middel van Embryo micro-injectie in de Worldwide Landbouw Pest Insect,

Meer video's verkennen