Levering van nucleïnezuren door middel van Embryo micro-injectie in de Worldwide Landbouw Pest Insect, Middellandse-Zeevlieg
October 1st, 2016
De mediterrane fruitvlieg (Ceratitis capitata) (Diptera: Tephritidae) is een wereldwijde plaag in de landbouw. Een dieper begrip van zijn biologie is cruciaal voor het beheersen van fruitvliegpopulaties en daarmee het verminderen van de economische impact. Micro-injectie van embryo's is een fundamenteel hulpmiddel dat zowel transformatie van de kiemlijn als reverse genetica studies in deze soort mogelijk maakt.
Het algemene doel van deze procedure is om nucleïnezuren in de embryo's van Ceratitis Capitata, een belangrijke landbouwonkruid, te brengen om uiteindelijk de toolbox voor zijn controle uit te breiden. Deze methode helpt genen functioneel te corrigeren in een immobiel organisme, evenals transgene stammen te genereren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er zeer lage hoeveelheden nucleïnezuren worden geïnjecteerd om de gewenste effecten te bereiken.
Bewaar alle levensfasen van de medevliegkolonie bij 25 graden Celsius met 65% luchtvochtigheid en een 12 12-uurs licht/donker foto-periode met een foto-fase die om 8 uur begint. Plaats een sponstrip door een kleine opening in de basis van de kooi om de vliegen van water te voorzien door middel van capillaire actie. U vestigt een kooi van zes liter, laad deze met tussen de 1.500 en 2.000 poppen.
Voor voedsel laadt u de kooi met ongeveer 45 gram van een een op tien mengsel van gist en suiker. Om eieren te verzamelen, plaatst u een bord gevuld met water onder de kooi. Vrouwtjes zullen eieren afzetten door het gaas, die vervolgens in het water terechtkomen.
Omdat maagdelijke vrouwtjes kunnen ova-posit, zorg ervoor dat de eieren allemaal bevrucht zijn door te wachten tot de vliegen minstens een week oud zijn voordat u eieren verzamelt. Om eieren te verzamelen, filtert u het water met een fijne zeef. Gebruik vervolgens een pasteural pipette om de eieren over te brengen naar een plastic doos gevuld met ongeveer 0,5 liter standaard larfvoer.
Als er niet genoeg eieren zijn gelegd, verhoog dan het gistgehalte van het voedsel van de volwassenen tot 25%. Plaats elke doos in een transparante container, die een laag zemelen bevat om popvorming te bevorderen. Bedek de container met een netdeksel om luchtcirculatie mogelijk te maken. Controleer na ongeveer 10 dagen op larven van het derde stadium die naar de zemelenlaag zijn gesprongen om te popvormen.
Eens gevonden, bereid u voor om de volgende dagen op poppen te controleren. Om de poppen te verzamelen, gebruikt u een zachte borstel om ze uit de container te vegen. Verzamel de poppen aanvankelijk in een klein kopje.
Nadat de verzamelingen zijn voltooid, brengt u de poppen over naar een nieuwe volwassen kooi. De volwassenen zouden binnen ongeveer 10 dagen moeten uitkomen. Voor de micro-injectie, hebben vooraf schuiven voorbereid.
Bevestig een twee centimeter strook dubbel gecoate tape aan een schuif en markeer de randen met een china marker om een muur te maken voor een olie-laag die de embryo's gehydrateerd houdt. Om vers gelegde embryo's te verzamelen, laat u jonge bevruchte vrouwtjes 30 minuten op een nieuwe lade ova-posit en verzamel vervolgens de embryo's. Om het chorion van de embryo's te verwijderen, dompelt u de zeef en eieren gedurende vijf seconden in een commerciële 50% bleekoplossing.
Het is van cruciaal belang om de embryo's niet te veel te bleken. Was de gebleekte embryo's onmiddellijk door de zeef voorzichtig in schone ultra-zuiver water te dompelen. Doe dit minstens vier keer.
Bewaar vervolgens de zeef in helder ultra-zuiver water en injecteer de embryo's binnen twee uur. Verzamel vervolgens met een fijne verfkwast ongeveer 50 embryo's en plaats ze op een schijf van zwart filterpapier gedrenkt in water. Onder een dissecterend stereo-microscoop rijd de embryo's op het dubbel gecoate tape van een voorbereide microscoopslide.
Richt alle embryo's in dezelfde richting. Het is belangrijk om de embryo's voorzichtig te manipuleren omdat het doorboren van de embryomembraan met de verfkwast schade kan veroorzaken die de overleving van het embryo vermindert. Bedek nu de embryo's met een laag chloor-trifloro etholeen olie.
De olie moet worden bevat door de china marker randen. Laat de randen niet overstromen. Laad met een micropipet de injectienaald met een paar microliters nucleïnezuuroplossing op een tot twee microgram per microliter.
Verbind vervolgens de naald met het micro-injectieapparaat en stel het in om een injectie van een halve seconde bij 800 hectopascal met een tegendruk van 150 hectopascal te geven. Gebruik een voetpedaal om te injecteren en gebruik de micro-manipulator om de naald te besturen terwijl u de podiumbediening gebruikt om de schuif te verplaatsen. Bevestig dat de injectiebolus correct wordt uitgeworpen en richt vervolgens de naald op de achterste pool van het eerste embryo in de rij.
Door het podium te verplaatsen, steekt u de naald in het embryo en injecteert u de bolus nucleïnezuren. De geïnjecteerde vloeistof zal een toename van interne druk veroorzaken, wat resulteert in een lichte beweging van het embryo. Laat het pedaal los en verwijder de naald onmiddellijk maar voorzichtig uit het embryo.
Er zal een beetje cytoplasma lekken op de injectieplaats. Dit is normaal. Als embryo's barsten met de injectie, laat de embryo's dan een paar minuten drogen voordat u ze in olie bedekt.
Na de injectie, brengt u de schuif over naar een petrischaal. Plaats een schijf filterpapier in het deksel van de schaal. Week de filter met water en sluit de petrischaal af met paraffinefolie.
Incubeer de kamer bij 25 graden Celsius. Twee dagen na de injectie, controleert u de schuiven meerdere keren gedurende de dag op uitgekomen larven. Zoek naar larven in de olie en gebruik een fijne verfkwast om ze over te brengen naar een petrischaal met wortelgebaseerd larfvoer.
Laad elke schaal met maximaal 200 larven. De larve kan niet lang in de olie overleven, dus zoek vaak. Incubeer de larven met het deksel meestal gesloten, zodat er nog steeds luchtstroom naar de larven is.
Controleer de schalen dagelijks en bereid na een week voor om larven te verzamelen door de schalen in een container met zemelen te plaatsen. Verzamel de poppen en verwacht binnenkort dat ze zullen uitkomen. Anesthetiseer later uitgekomen volwassenen met koolstofdioxide en inspecteer ze op transformatie.
Bij het screenen kan die
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
De mediterrane fruitvlieg (medfly), Ceratitis capitata, is een belangrijke landbouwongedierte. Dit artikel bespreekt een methode voor het leveren van nucleïnezuren in medfly-embryo's om controlestrategieën te verbeteren.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Genetica
- Landbouwbiologie
Achtergrond
- De medfly is een wereldwijd ongedierte dat de landbouw beïnvloedt.
- Het begrijpen van zijn biologie is cruciaal voor populatiecontrole.
- Embryo-microinjectie is een belangrijke techniek voor genetische studies.
- Deze methode maakt transformatie van de kiemcellen en omgekeerde genetica mogelijk.
Doel van de studie
- Nucleïnezuren leveren in medfly-embryo's.
- De genetische toolbox uitbreiden voor het controleren van medfly-populaties.
- Transgene stammen genereren voor onderzoek en ongediertebestrijding.
Gebruikte methoden
- Medfly-kolonies onderhouden bij 25 graden Celsius met 65% vochtigheid.
- Gebruik van een 12-uur licht/donkercyclus voor optimale omstandigheden.
- Injectie van lage hoeveelheden nucleïnezuren in embryo's.
- Een zes-liter kooi opzetten met 1.500 tot 2.000 poppen voor experimenten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle levering van nucleïnezuren in medfly-embryo's.
- Generatie van transgene stammen voor verder onderzoek.
- Aangetoonde efficiëntie van lage nucleïnezuurinjectie.
- Inzichten verschaft in genetische manipulatietechnieken.
Conclusies
- De methode verbetert het vermogen om medfly-genetica te bestuderen.
- Het biedt potentiële strategieën voor ongediertebestrijding.
- Verder onderzoek kan op deze bevindingen voor landbouwtoepassingen voortbouwen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Embryo microinjection of nucleic acids in Ceratitis capitata enables direct genetic manipulation for functional gene interrogation and transgenic strain development. This capability is pivotal for de-risking biological targets and accelerating the creation of genetically modified lines for pest control strategies. The method supports translational continuity from discovery biology to applied agricultural biotechnology, impacting both research and field deployment pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of gene targets by direct gene silencing or overexpression in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by linking gene perturbation to phenotypic outcomes in a relevant organism.
- Facilitates rapid hypothesis testing for genes implicated in pest invasiveness or reproductive biology.
Screening & Assay Development
- Generates validated transgenic lines for downstream phenotypic or molecular screening workflows.
- Standardizes genetic backgrounds for reproducible assay development and comparative studies.
- Provides quantitative readouts such as fluorescence markers for efficient screening of transformants.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic manipulation with translational goals for population control and trait introduction.
- Enables continuity from gene discovery to preclinical validation of engineered strains for field application.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate genetic modifications based on in vivo performance.
Pipeline & Workflow Integration
This embryo microinjection method bridges early discovery, target validation, and translational research in agricultural biotechnology pipelines.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis-driven gene function studies and pathway elucidation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for transformant identification and trait validation.
- Analytics: Enables measurement of gene expression changes and phenotypic effects post-injection.
- Translational Research: Connects laboratory genetic modifications to field-relevant strain development.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for ongoing genetic tool development in pest species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function and target validation for pest control.
- Operational Value: Standardizes genetic manipulation protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for advancing genetic modifications to field trials.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of genetic strategies for population management.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in embryo handling and microinjection instrumentation.
- Demands access to fluorescence microscopy and molecular analysis infrastructure for screening.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible genetic manipulation and phenotypic assessment.
- Adaptation may be needed for different pest species or genetic backgrounds.
- Survival rates and transformation efficiency are practical limitations that must be optimized.
