Levering van nucleïnezuren door middel van Embryo micro-injectie in de Worldwide Landbouw Pest Insect, Middellandse-Zeevlieg

Het algemene doel van deze procedure is om nucleïnezuren in de embryo's van Ceratitis Capitata, een belangrijke landbouwonkruid, te brengen om uiteindelijk de toolbox voor zijn controle uit te breiden. Deze methode helpt genen functioneel te corrigeren in een immobiel organisme, evenals transgene stammen te genereren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er zeer lage hoeveelheden nucleïnezuren worden geïnjecteerd om de gewenste effecten te bereiken.

Bewaar alle levensfasen van de medevliegkolonie bij 25 graden Celsius met 65% luchtvochtigheid en een 12 12-uurs licht/donker foto-periode met een foto-fase die om 8 uur begint. Plaats een sponstrip door een kleine opening in de basis van de kooi om de vliegen van water te voorzien door middel van capillaire actie. U vestigt een kooi van zes liter, laad deze met tussen de 1.500 en 2.000 poppen.

Voor voedsel laadt u de kooi met ongeveer 45 gram van een een op tien mengsel van gist en suiker. Om eieren te verzamelen, plaatst u een bord gevuld met water onder de kooi. Vrouwtjes zullen eieren afzetten door het gaas, die vervolgens in het water terechtkomen.

Omdat maagdelijke vrouwtjes kunnen ova-posit, zorg ervoor dat de eieren allemaal bevrucht zijn door te wachten tot de vliegen minstens een week oud zijn voordat u eieren verzamelt. Om eieren te verzamelen, filtert u het water met een fijne zeef. Gebruik vervolgens een pasteural pipette om de eieren over te brengen naar een plastic doos gevuld met ongeveer 0,5 liter standaard larfvoer.

Als er niet genoeg eieren zijn gelegd, verhoog dan het gistgehalte van het voedsel van de volwassenen tot 25%. Plaats elke doos in een transparante container, die een laag zemelen bevat om popvorming te bevorderen. Bedek de container met een netdeksel om luchtcirculatie mogelijk te maken. Controleer na ongeveer 10 dagen op larven van het derde stadium die naar de zemelenlaag zijn gesprongen om te popvormen.

Eens gevonden, bereid u voor om de volgende dagen op poppen te controleren. Om de poppen te verzamelen, gebruikt u een zachte borstel om ze uit de container te vegen. Verzamel de poppen aanvankelijk in een klein kopje.

Nadat de verzamelingen zijn voltooid, brengt u de poppen over naar een nieuwe volwassen kooi. De volwassenen zouden binnen ongeveer 10 dagen moeten uitkomen. Voor de micro-injectie, hebben vooraf schuiven voorbereid.

Bevestig een twee centimeter strook dubbel gecoate tape aan een schuif en markeer de randen met een china marker om een muur te maken voor een olie-laag die de embryo's gehydrateerd houdt. Om vers gelegde embryo's te verzamelen, laat u jonge bevruchte vrouwtjes 30 minuten op een nieuwe lade ova-posit en verzamel vervolgens de embryo's. Om het chorion van de embryo's te verwijderen, dompelt u de zeef en eieren gedurende vijf seconden in een commerciële 50% bleekoplossing.

Het is van cruciaal belang om de embryo's niet te veel te bleken. Was de gebleekte embryo's onmiddellijk door de zeef voorzichtig in schone ultra-zuiver water te dompelen. Doe dit minstens vier keer.

Bewaar vervolgens de zeef in helder ultra-zuiver water en injecteer de embryo's binnen twee uur. Verzamel vervolgens met een fijne verfkwast ongeveer 50 embryo's en plaats ze op een schijf van zwart filterpapier gedrenkt in water. Onder een dissecterend stereo-microscoop rijd de embryo's op het dubbel gecoate tape van een voorbereide microscoopslide.

Richt alle embryo's in dezelfde richting. Het is belangrijk om de embryo's voorzichtig te manipuleren omdat het doorboren van de embryomembraan met de verfkwast schade kan veroorzaken die de overleving van het embryo vermindert. Bedek nu de embryo's met een laag chloor-trifloro etholeen olie.

De olie moet worden bevat door de china marker randen. Laat de randen niet overstromen. Laad met een micropipet de injectienaald met een paar microliters nucleïnezuuroplossing op een tot twee microgram per microliter.

Verbind vervolgens de naald met het micro-injectieapparaat en stel het in om een injectie van een halve seconde bij 800 hectopascal met een tegendruk van 150 hectopascal te geven. Gebruik een voetpedaal om te injecteren en gebruik de micro-manipulator om de naald te besturen terwijl u de podiumbediening gebruikt om de schuif te verplaatsen. Bevestig dat de injectiebolus correct wordt uitgeworpen en richt vervolgens de naald op de achterste pool van het eerste embryo in de rij.

Door het podium te verplaatsen, steekt u de naald in het embryo en injecteert u de bolus nucleïnezuren. De geïnjecteerde vloeistof zal een toename van interne druk veroorzaken, wat resulteert in een lichte beweging van het embryo. Laat het pedaal los en verwijder de naald onmiddellijk maar voorzichtig uit het embryo.

Er zal een beetje cytoplasma lekken op de injectieplaats. Dit is normaal. Als embryo's barsten met de injectie, laat de embryo's dan een paar minuten drogen voordat u ze in olie bedekt.

Na de injectie, brengt u de schuif over naar een petrischaal. Plaats een schijf filterpapier in het deksel van de schaal. Week de filter met water en sluit de petrischaal af met paraffinefolie.

Incubeer de kamer bij 25 graden Celsius. Twee dagen na de injectie, controleert u de schuiven meerdere keren gedurende de dag op uitgekomen larven. Zoek naar larven in de olie en gebruik een fijne verfkwast om ze over te brengen naar een petrischaal met wortelgebaseerd larfvoer.

Laad elke schaal met maximaal 200 larven. De larve kan niet lang in de olie overleven, dus zoek vaak. Incubeer de larven met het deksel meestal gesloten, zodat er nog steeds luchtstroom naar de larven is.

Controleer de schalen dagelijks en bereid na een week voor om larven te verzamelen door de schalen in een container met zemelen te plaatsen. Verzamel de poppen en verwacht binnenkort dat ze zullen uitkomen. Anesthetiseer later uitgekomen volwassenen met koolstofdioxide en inspecteer ze op transformatie.

Bij het screenen kan die