Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van de bindende eiwitten van kleine moleculen met behulp van een fotoaffiniteitsonde, die aan zijn doelwit in levende cellen kan binden, wat de daaropvolgende isolatie en identificatie van het doelwit mogelijk maakt. Deze methode kan worden gebruikt om het moleculaire werkingsmechanisme van geneesmiddelen of andere kleine moleculen te ontrafelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de binding en covalente markering van de doeleiwitten plaatsvinden binnen de natuurlijke cellulaire omgeving, waardoor het risico op verstoring van de natuurlijke eiwitstructuur en bindingscondities bij cellyse wordt weggenomen.

Begin deze procedure door steriele cellenkweekschalen van zes centimeter voor te bereiden voor het gewenste aantal monsters. Meestal wordt één schaal met cellen per behandelconditie gebruikt. Voor deze demonstratie worden drie schalen met cellen voorbereid: een negatieve controle met alleen DMSO, gelabeld met D, een behandeling met alleen de probe, gelabeld met P, en een behandeling met de probe plus een competitor, gelabeld met C. Voeg aan elke kweekschaal 3,5 miljoen HEK 293 T-cellen toe in vier milliliter kweekmedium.

Incubeer de cellen overnacht. Verdeel de benodigde geneesmiddelen vooraf in aliquoten in microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter voordat de cellen worden behandeld. Voeg voor de voorbehandeling met de competitor vier microliters DMSO toe aan elk van de twee buisjes, en vier microliters 10 millimolar competitor aan één buisje.

Voor de behandeling met de probe voegt u 16 µL DMSO toe aan één buisje en 16 µL van de 15 µM fotoaffiniteitsprobe aan elk van de twee andere buisjes. Plaats de cellentequelschalen in de cellentequelkap voor het toevoegen van de vooraf gedoseerde geneesmiddelen. Aspireer 1 mL kweekmedium uit de schaal voor de competitiebehandeling, breng dit over naar het microcentrifugebuisje met de vooraf gedoseerde competitor en resuspendeer het geneesmiddel in het medium.

Voeg het mengsel van medium en geneesmiddel voorzichtig druppelgewijs terug toe aan de schaal. Voeg op dezelfde wijze DMSO toe aan zowel de schaal met de negatieve controle als aan de schaal met de probe. Plaats de schalen gedurende 30 minuten terug in de incubator.

Breng de schaaltjes na 30 minuten terug naar de cultuurkap en dim de lichten. Voeg de vooraf verdeelde DMSO toe aan het schaaltje voor de negatieve controle, en probe toe aan de probe- en competitieschaaltjes. Plaats de schaaltjes gedurende één uur terug in de incubator.

Plaats de schaaltjes na één uur op ijs. Was de cellen in elk schaaltje voorzichtig met vijf milliliter ijskoude PBS om overtollige probe te verwijderen. Bedek de cellen opnieuw met vier milliliter ijskoude PBS.

Plaats een schaal met cellen, gecentreerd drie centimeter onder de UV-lamp op een icepack, om opwarming door de lamp te minimaliseren, en bestraal gedurende drie minuten. Verwijder de schaal en plaats deze op ijs. Bestraal alle monsters op deze wijze.

Na bestraling van alle monsters wordt de PBS van de cellen geaspireerd en wordt aan elke schaal 200 microliters ijskoud PBS met protease-remmers toegevoegd. Los de cellen met een rubberen celschraper los van de schaal en breng ze over naar vooraf gelabelde microcentrifugebuisjes op ijs. Voeg SDS toe aan elk monster tot een eindconcentratie van 0,4%. Lyseer de cellen door de suspensie gedurende 10 pulsen te soniceren, één minuut op ijs te incuberen en vervolgens nogmaals gedurende 10 pulsen te soniceren.

Kook de monsters vijf minuten op een heatblock ingesteld op 95 °C om de cellyse te voltooien en alle eiwitten te denatureren. Nadat de eiwitconcentratie in elk monster is gemeten, zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt de eiwitconcentratie genormaliseerd naar 2,5 mg/mL door indien nodig PBS pH 8,5 met 0,4% SDS toe te voegen. Om met deze procedure te beginnen, brengt u 40 µL van elk cellysaat, zoals voorbereid in het vorige segment, over naar een nieuwe microcentrifugebuis.

Voeg de volgende reagentia in deze volgorde toe: 0.2 µL fluor-azide, 0.58 µL TCEP en 3.38 µL TBTA. Vortex om te mengen. Voeg 1.14 µL kopersulfaatpentahydraat toe om de reactie te starten.

Vortex kortstondig en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg 50 µL 2X SDS-monsterbuffer toe om de reactie te stoppen. Analyseer de monsters op een SDS-PAGE gel; wanneer het kleurfront het einde van de gel heeft bereikt, laat u de gel nog vijf minuten doorlopen om te garanderen dat alle overmatige, ongereageerde flour-azide volledig uit de gel is verdwenen.

Nadat al het overtollige fluor-azide is weggewassen, plaatst u de gel op een glasplaat en scant u de gel met een fluorescentiegelscanner, volgens de instructies van de fabrikant. Voor de bevestiging van een biotinyl-tag gebruikt u de maximale hoeveelheid cellysaten na proteïnenormalisatie, zodat alle monsters hetzelfde volume hebben. Preclear de lysaten door elk monster over te brengen naar een nieuwe buis met 50 microliters vooraf gewassen high capacity streptavidine-agarosebeads.

Incubeer gedurende één uur bij four degrees Celsius onder rotatie. Pelleteer de beads door centrifugatie. Verplaats het supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis op ijs en gooi de beads weg.

Voeg per 500 µL lysaat de volgende reagentia toe: 1,38 µL biotin-azide, 5,5 µL TCEP en 32,5 µL TBTA. Vortex om te mengen. Voeg 11 µL kopersulfaatpentahydraat toe per 500 µL lysaat en vortex kortstondig.

Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vier monstervolumes aceton toe, gekoeld tot 20 °C, vortex de monsters en incubeer deze een nacht bij 80 °C om de eiwitten volledig te precipiteren en niet-gereageerd biotin-azide te verwijderen. Centrifugeer de monsters de volgende dag gedurende 15 minuten bij 17,000 x g bij 4 °C om de geprecipiteerde eiwitten als pellet te verkrijgen.

Aspireer het supernatant volledig, voeg 150 µL PBS pH 7,4 en 1% SDS toe aan elk monster en resuspendeer de eiwitten door middel van sonicatie. Voeg 600 µL PBS toe aan elk monster om de SDS-concentratie te verdunnen tot 0,2%, en voeg vervolgens het monster toe aan een nieuwe buis met 30 µL vooraf gewassen streptavidine-agarosebeads met hoge capaciteit. Incubeer gedurende één uur bij 4 °C onder rotatie.

Pellet de beads na één uur door centrifugatie bij 1000 x g gedurende drie minuten. Aspireer en verwijder het supernatant, dat de ongebonden eiwitten bevat. Voeg één milliliter wasbuffer toe aan de beads en incubeer deze vijf minuten bij kamertemperatuur onder rotatie.

Centrifugeer, verwijder het supernatant en was opnieuw met wasbuffer. Na de laatste wasbeurt wordt de wasbuffer volledig van de beads geaspireerd en worden 30 µL 2X SDS-monsterbuffer toegevoegd. Incubeer vijf minuten in een heatblock op 95 °C om de eiwitten van de beads los te maken.

Centrifugeer de kraaltjes bij 13000 x g bij kamertemperatuur gedurende één minuut. Pipetteer zorgvuldig de monsterbuffer, die de eiwitten bevat, van de kraaltjes af voor SDS-PAGE. De visualisatie van eiwitten na labelen met de fluorescente tag wordt geïllustreerd door deze fluorescentiescans van de gel.

De belangrijkste specifieke bindingsproteïneband, op ongeveer 35 kilodalton, is alleen aanwezig in de probe-baan en wordt weggedrongen door een overmaat aan de moederverbinding. Dezelfde band van 35 kilodalton werd gevisualiseerd via zilverkleuring na biotin-pulldown en vervolgens via massaspectrometrie geïdentificeerd als het membraaneiwit VDAC1. De identiteit van het eiwit werd verder gevalideerd met behulp van een specifiek antilichaam tegen VDAC1.

Het signaal is aanwezig in de probe-lane en afgenomen in de competitie-lane. Het meenemen van de input-fractie garandeert dat het antilichaam werkt en dat het eiwit van belang in het lysaat kan worden gedetecteerd. De geringe toename in molecuulgewicht van de pulldown-monsters is te wijten aan de covalent gebonden probe.

De gevolgen van het niet correct uitvoeren van bepaalde stappen in het protocol worden geïllustreerd. Onvolledige verwijdering van overtollig flour-azide resulteert in grote zwarte vegen aan de onderkant van de fluorescentie-gescande gel, terwijl onvoldoende preclearing van de lysaten en/of het wassen van de beads resulteert in een zilvergekleurde gel met een zeer hoge achtergrondkleuring. Van begin tot eind duurt het pulldown-experiment twee tot drie dagen.

Nadat het doeleiwit is geïsoleerd en is geïdentificeerd via massaspectrometrie of western blotting, moeten verdere doelwitspecifieke validatie-experimenten worden uitgevoerd om de relevantie van het doelwit voor het door het geneesmiddel geïnduceerde fenotype te beoordelen.