Name: Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Ontdek hoe je kleine molecuul-bindende eiwitten identificeert met fotoaffiniteitslabeling in levende HEK 293 T-cellen. Deze methode behoudt de native cellulaire omgeving voor betrouwbare eiwitbindingstudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Ben Nacev voor advies over het ontwerp van het fotoaffiniteit labelprotocol, Dr. Wei Shi voor het synthetiseren van de itraconazool fotoaffiniteit sonde, Dr. Yongjun Dang voor advies over affiniteits pull-down experimenten, en andere leden van het J.O.L. laboratorium voor nuttige commentaren en ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een PhRMA Foundation Fellowship in Farmacologie/Toxicologie (aan S.A.H.); National Cancer Institute Grant R01CA184103; het Flight Attendant Medical Research Institute; de Prostate Cancer Foundation (J.O.L.); en het Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, dat gedeeltelijk wordt gefinancierd door Grant UL1 TR 001079 van het National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).

LET OP: Dit protocol werd aangepast van MacKinnon en Taunton 10 voor gebruik in levende cellen. 1. Bereiding van gekweekte cellen <ol><li> Bereid steriele 6-cm celcultuurschalen het gewenste aantal monsters (zie hieronder). LET OP: Een gerecht van de cellen wordt gebruikt per behandeling staat, maar als er meer eiwit nodig is 2 of 3 gerechten worden bereid per staat en gecombineerd na UV straling. <ol><li> Maak minstens 3 gerechten van de cellen; Negatieve controle met alleen DMSO (D), alleen Probe behandeling (P), en probe concurrent + (C). </li><li> Eventueel stelt een 4 th schotel als geen UV controle, worden behandeld met probe maar niet blootgesteld aan UV-licht. Opmerking: Als er meerdere concurrerende moleculen worden getest, zoals verschillende analogen van het kleine molecuul van belang, bereiden extra concurrent Platen eventueel. </li></ol></li><li> Voeg HEK293T cellen aan de cultuur gerechten in 4 ml kweekmedium. Gebruik 3,5 miljoen cells per plaat. Opmerking: Het aantal cellen moet worden bepaald voor elk celtype zodat cellen bijna 100% confluent bij het begin van het experiment, om het maximale rendement te bereiken eiwit. Voor HUVEC, gebruiken 0,3 miljoen cellen per plaat. Een goede benadering is 1/10 van de cellen in een confluente 15 cm schaal. HEK293T cellen worden gekweekt in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagles Medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine. </li><li> Zet de cellen aan de incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende de nacht. </li></ol> 2. Behandeling van cellen en fotoverknopende <ol><li> De volgende dag, pre-fractie de volgende geneesmiddelen in 1,5 ml microcentrifugebuizen: <ol><li> Voor de eerste behandeling wordt 4 pl DMSO 2 buizen en 4 ui 10 mM concurrent (dwz de ongemodificeerde moederstof) tot 1 tube. </li><li> Voor de tweede behandeling, voeg 16 ul van DMSO tot 1 tube en 16 ul van 50 &amp;# 181; M affiniteit sonde 2 tubes. LET OP: De optimale concentratie kan verschillend zijn voor verschillende probes (zie bespreking), maar tussen de 200-500 nm is een goed uitgangspunt (hier gebruiken we 200 nm). De concentratie van competitief hoger zijn dan dat van de probe ten minste 20 maal (hier gebruiken we 10 uM). De eindconcentratie van DMSO moet gelijk in platen bevinden en niet meer dan 0,5% (20 pi volume). </li></ol></li><li> Breng de celplaten in de celkweek kap en voeg de pre-porties drugs uit stap 2.1.1 als volgt: Zuig 1 ml kweekmedia resuspenderen de pre-gealiquoteerde geneesmiddel in de media, en voeg dan voorzichtig terug naar de plaat druppel wijs. Voeg de DMSO aan de DMSO (D) bord en de sonde (P) plaat, en voeg de concurrent van de competitie (C) plaat. Zet de platen naar de incubator gedurende 30 minuten. </li><li> Met verlichting in de cultuur kap gedimd, voeg de pre-gealiquoteerde probe uit stap 2.1.2 tot sonde (P) en de concurrentie (C) borden en voeg deDMSO aan de DMSO (D) plaat, zoals hierboven. Zet de platen naar de incubator gedurende 1 uur. </li><li> Tijdens de incubatie, bereid de volgende artikelen; Een dienblad van ijs dat alle platen past; ijskoude lysisbuffer (PBS [pH 8,5] + 1x proteaseremmer cocktail [compleet EDTA-vrij, verdund van 50x voorraad-oplossing in water], 200 pl / plaat); microcentrifugebuizen gelabeld D, P of C voor elk van de verschillende behandelingsomstandigheden, op ijs. </li><li> 15 minuten voor het einde van de 1 uur incubatie, instellen van de UV-lamp (365 nm) in de koude kamer en zet hem op te warmen de lamp. </li><li> Na 1 uur incubatie met de sonde, plaatst gerechten op het ijs. Was de cellen voorzichtig met 5 ml ijskoude PBS (pH 7,4) om overmaat probe te verwijderen. Opnieuw omvatten de cellen met 4 ml ijskoude PBS. </li><li> Zet de schaal van cellen gecentreerd 3 cm onder de UV lamp bovenop een ijslaag verwarming van de lamp te minimaliseren. Bestralen gedurende 3 min. Verwijder de schotel naar de tray ijs en herhaal voor alle monsters. </li><li> EENN a bestraling zuig het PBS uit de cellen en voeg 200 ul van ijskoude PBS (pH 8,5) met proteaseremmers aan elke plaat. Maak de cellen van de plaat met een rubberen schraper en overdracht naar de gelabelde microcentrifugebuizen op ijs. </li><li> Voeg SDS tot een eindconcentratie van 0,4% (10 pl 10% SDS in 250 pl monster). LET OP: SDS poeder is gevaarlijk. Vermijd het inademen van SDS poeder door het dragen van een masker over de neus en mond. </li><li> Lyseren de cellen door sonicatie de suspensie gedurende 10 pulsen (output 1, duty cycle 30%) en incubeer op ijs gedurende 1 min voor een tweede ronde van 10 pulsen. </li><li> Indien nodig, verwijder 2 pl ophanging en laat onder een lichtmicroscoop te zorgen voor volledige cellysis. </li><li> Kook de monsters op een hete plaat die op 95 ° C gedurende 5 minuten om cellysis te voltooien en denatureren de eiwitten. </li><li> Meet de eiwitconcentratie in elk monster onder toepassing van een spectrofotometrische detergent compatibel eiwit assay, zoals the Dc eiwitassay 19, volgens de instructies van de fabrikant, met een spectrofotometer ingesteld op absorptie gemeten bij 750 nm. </li><li> Normaliseren van de proteïne concentratie 2,5 mg / ml (of als concentraties lager dan 2,5 mg / ml, normaliseert het monster met de laagste eiwitconcentratie) door toevoeging van PBS pH 8,5 + 0,4% SDS als nodig is (bijvoorbeeld als monsters 5 mg / ml in 250 pl, voeg 250 pl PBS pH 8,5 + 0,4% SDS tot een eindconcentratie van 2,5 mg / ml te verkrijgen). </li></ol> 3. Bevestiging van Fluorescent Tag per Klik Chemie voor Visualisatie van gelabelde eiwitten <ol><li> Verwijder 40 pi van het cellysaat overgebracht in een nieuwe microcentrifugebuis. Houd de resterende lysaten voor reactie met azide-biotine (stap 4). </li><li> Voeg de volgende reagentia in deze volgorde: 0,2 ul fluor-azide (1 mM voorraad oplossing in DMSO), 0,58 pl TCEP (100 mM voorraad in water met 4 equivalenten NaOH toegevoegd, vers bereid), en 3,38 ul TBTA (1.7 mM voorraad in een 4: 1 verhouding van t-butanol DMSO). Vortex te mengen. </li><li> Voeg 1,14 ul CuSO4 5H 2 O (50 mM in water) om de reactie te starten. Kort vortexen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker. </li><li> Voeg 50 ul 2x SDS-monsterbuffer om de reactie te blussen. Op dit moment lopen de monsters direct op een SDS-PAGE gel 20 voor de beste resultaten, of op te slaan bij -20 ° C gedurende de nacht indien nodig. </li><li> Vries bij monsters, verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C vóór het laden op de gel. OPMERKING: Aangezien het moleculair gewicht van het doeleiwit typisch niet in dit stadium bekend is, is het raadzaam om 2 gels met verschillende acrylamide concentraties zijn (ie 8% en 15%), of een brede moleculair gewichtsbereik gradiënt gel (dat wil zeggen, 4-15%), om volledige dekking gewicht moleculair waarborgen. </li><li> Als de kleurstof voor het einde van de gel bereikt, blijven draaien de gel gedurende nog 5 min om alle overmaat unreacte waarborgend fluor-azide volledig verlaten de gel. </li><li> Verwijder de gel een container met DDH 2 O en incubeer gedurende 10 minuten onder zacht schudden om alle overtollige fluor-azide wegspoelen. </li><li> Plaats de gel op een glasplaat en scan het onder gebruikmaking van een Typhoon fluorescerende gel scanner volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> 4. Bevestiging van biotine Tag per Klik Chemie voor Affiniteit Zuivering van gelabelde eiwitten <ol><li> Van de overige lysaten van stap 3,1, is de maximale na-eiwit normalisatie zodanig dat alle monsters hetzelfde volume (bijvoorbeeld als na normalisatie naar 2,5 mg / ml verkregen monster volumes 500, 550, en 600 pl, gebruiken 500 pl elk). </li><li> Vooraf duidelijk de lysaten door aan 50 gl hoge capaciteit streptavidine agarose kralen, voorgewassen 2x met PBS (pH 7,4). Incubeer 1 uur bij 4 ° C met rotatie. </li><li> Pellet de kralen door centrifugering bij 1000 g gedurende 3 minuten. Verwijder thij supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis op ijs en gooi de kralen. </li><li> Verwijder 1-2% van de DMSO monster naar een nieuwe buis label &quot;input&quot;. Voeg een gelijk volume 2 x SDS-monsterbuffer en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Per 500 pi van lysaat, voeg de volgende reagentia: 1,38 ul biotine-azide (10 mM voorraad in DMSO), 5,5 pi TCEP, en 32,5 pl TBTA. Vortex te mengen. </li><li> Voeg 11 ul CuSO4 5H 2 O per 500 ul lysaat en vortex kort. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Voeg 4 monstervolumes aceton gekoeld tot -20 ° C. Vortex de monsters en incubeer overnacht bij -80 ° C volledig precipiteren eiwitten en verwijder ongereageerd biotine-azide. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C om het geprecipiteerde eiwitten pelleteren. </li><li> Zuig het supernatant volledig en resolubilize de eiwitten door sonicatie in 150 ul PBS (pH 7,4) + 1% SDS. </li><li&gt; Voeg 600 ul PBS (pH 7,4) om de concentratie van SDS te verdunnen tot 0,2%. </li><li> Voeg de monsters 30 gl voorgewassen hoge capaciteit streptavidine agarose kralen en incubeer 1 uur bij 4 ° C met rotatie. </li><li> Pellet de kralen door centrifugering bij 1000 g gedurende 3 minuten. Zuig het supernatant die niet gebonden eiwitten en teruggooi. </li><li> Voeg 1 ml wasbuffer (400 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,2% SDS, pH 7,4) aan de korrels en incubeer 5 min bij kamertemperatuur met rotatie. </li><li> Herhaal stap 4.12 en 4.13 3 keer. </li><li> Zuig het wasbuffer geheel van de bolletjes en voeg 30 ul 2x SDS-monsterbuffer. </li><li> Incubeer gedurende 5 min op 95 ° C hitteblok de eiwitten los van de bolletjes. </li><li> Centrifugeer de kralen voor 1 min bij 13.000 xg bij kamertemperatuur. OPMERKING: Op dit punt, kunnen de monsters worden bewaard bij -20 ° C tot gebruik SDS-PAGE gerund. Vries bij monsters, verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C vóór gebruik. </li><li> Voorzichtigpipet het monster buffer bevattende eiwitten af van de kralen en laden op SDS-PAGE 20 (zie hieronder belangrijke overwegingen). De korrels kunnen worden opgeslagen voor latere opkoken indien nodig. OPMERKING: eiwit detectie door zilverkleuring, worden betere resultaten verkregen met een 1 mm dikke gel. Indien een band buiten de zilver gekleurde gel voor massa-analyse spectrometrie (MS) te snijden, bereiden alle reagentia vers uit steriele oplossingen en laat een lege put tussen monsters op de gel. Voor elke band gesneden uit de sonde baan moet een parallelle segment worden uit de DMSO baan zodat achtergrond eiwitten kunnen worden afgetrokken. Voor de validatie van eiwit-ID van western blot, is het essentieel om de input monster uit stap 4.4 ook laden wanneer het uitvoeren van de SDS-PAGE gel. </li><li> Volg een standaardprotocol voor zowel 21 zilverkleuring of Western blot 22 aan het doeleiwit (s) te detecteren. </li></ol>

<ol><li>Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li>
<li>Cook, D., Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+the+fate+of+AstraZeneca%27s+drug+pipeline%3A+a+five-dimensional+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).</li>
<li>Titov, D. V., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+protein+targets+of+bioactive+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules.</a> Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).</li>
<li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules%3A+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li>
<li>Sumranjit, J., Chung, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+Target+Characterization+and+Identification+by+Photoaffinity+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes.</a> Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).</li>
<li>Robles, O., Romo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemo-+and+site-selective+derivatizations+of+natural+products+enabling+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prod+Rep%22%5BJournal%5D)">Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies.</a> Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).</li>
<li>Zhou, Q., Gui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+by+Native+Chemical+Tagging+of+C-H+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds.</a> J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).</li>
<li>Li, Z., Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Synthesis+of+Minimalist+Terminal+Alkyne-Containing+Diazirine+Photo-Crosslinkers+and+Their+Incorporation+into+Kinase+Inhibitors+for+Cell-+and+Tissue-Based+Proteome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling.</a> Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).</li>
<li>Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazo+reagents+with+small+steric+footprints+for+simultaneous+arming%2FSAR+studies+of+alcohol-containing+natural+products+via+O-H+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chem+biol%22%5BJournal%5D)">Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion.</a> ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).</li>
<li>Mackinnon, A. L., Taunton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+Identification+by+Diazirine+Photo-Cross-linking+and+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry.</a> Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).</li>
<li>Smith, E., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoaffinity+labeling+in+target-+and+binding-site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Future+med+chem%22%5BJournal%5D)">Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification.</a> Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).</li>
<li>Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1.3-Dipolare+Cycloadditionen%2C+XXXII.+Kinetik+der+Additionen+organischer+Azide+an+CC-Mehrfachbindungen%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Ber%22%5BJournal%5D)">1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen.</a> Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%26%2334%3Bligation%26%2334%3B+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective &#34;ligation&#34; of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).</li>
<li>Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+Solid+Phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-Triazoles+by+Regiospecific+Copper%28I%29-Catalyzed+1%2C3-Dipolar+Cycloadditions+of+Terminal+Alkynes+to+Azides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides.</a> J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).</li>
<li>Head, S. A., Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+drug+itraconazole+targets+VDAC1+to+modulate+the+AMPK%2FmTOR+signaling+axis+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).</li>
<li>Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itraconazole+Side+Chain+Analogues%3A+Structure-Activity+Relationship+Studies+for+Inhibition+of+Endothelial+Cell+Proliferation%2C+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor+2+%28VEGFR2%29+Glycosylation%2C+and+Hedgehog+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling.</a> J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).</li>
<li>Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Absolute+Stereochemistry+on+the+Antiangiogenic+and+Antifungal+Activities+of+Itraconazole%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+silver+stain+for+detecting+proteins+and+peptides+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.</a> Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Verschillende benaderingen voor het identificeren van de doelen van kleine moleculen kunnen grofweg in twee categorieën: bovenaf, waarbij het cellulaire fenotype van het geneesmiddel wordt gebruikt om een ​​beperking van de potentiële doelen gebaseerd op hun bekende functies of bottom-up, waarbij het doelwit direct geïdentificeerd door chemische of genetische middelen 3. Top-down of fenotypische studies kan bepaalde cellulaire processen beïnvloed door het geneesmiddel te identificeren (bijvoorbeeld, ...

Bioactieve kleine moleculen fundamenteel werkt door interactie met de functie van één of meer &quot;target&quot; moleculen, meestal proteïnen veranderen, in de cel. In drug discovery, wanneer een werkzame verbinding wordt ontdekt door fenotypische screening, identificatie van de moleculaire target (s) van die verbinding is essentieel, niet alleen voor het begrijpen van het werkingsmechanisme en de mogelijke bijwerkingen van de verbinding, maar ook potentieel ontdekken nieuwe biologie ten grondslag liggen aan de ziekte model en de weg effenen voor de ontwikkeling van nieuwe mechanistische klasse van therapeutische middelen 1. Hoewel target identificatie is niet vereist voor een geneesmiddel om therapeutisch worden gebruikt, in de afgelopen jaren is er een toenemende erkenning dat nieuwe kandidaat-geneesmiddelen hebben meer kans om te slagen in klinische studies, en dus geven een beter rendement op de investering, als een gevalideerde doelwit is bekend 2. Er is dus een groeiende interesse in werkwijzen voor het identificeren van kleine geweestmolecule doeleiwitten. Een klassieke doel identificatieexperiment vertrouwt typisch op affiniteitszuivering, waarbij het ​​kleine molecuul van belang wordt geïmmobiliseerd op een hars en geïncubeerd met lysaten van gehele cellen, waarna ongebonden eiwitten weg gewassen en de resterende eiwitten worden geëlueerd en geïdentificeerd 3. Hoewel deze techniek is gebruikt om de doelstellingen van vele kleine moleculen identificeren 4, is ongeschikt als een universele prisma ID methode om verschillende redenen. Ten eerste moet het doeleiwit de natieve conformatie na cellyse om zijn vermogen te binden aan de kleine molecule behouden blijven. Dit kan bijzonder problematisch voor membraaneiwitten, die vaak conformatieveranderingen ondergaan na hun natieve omgeving verwijderd of gewoon aggregaat en neerslaan uit oplossing. Ten tweede moet het kleine molecuul chemisch worden gemodificeerd zodanig dat deze kan worden geïmmobiliseerd op de hars behoudhet vermogen om het doeleiwit binden. Diepe bindingsholtes kan dus niet toegankelijk voor een klein molecuul zodra het is bevestigd aan de hars. Ten derde moet de bindingsaffiniteit voldoende hoog zijn dat de interactie wordt gehandhaafd tijdens de wasstappen, waardoor identificatie van lagere affiniteit interacties uitdaging. Ten vierde, omgevingsfactoren zoals pH, ionconcentratie of de aanwezigheid van andere endogene moleculen ruimtelijk variëren binnen de cel en soms voorwaarden geneesmiddelresistente targetinteracties. Aldus vinden van de juiste voorwaarden te scheppen en handhaven binding buiten de cel kan een aanzienlijke hoeveelheid trial and error vereist. Fotoaffiniteitslabeling omzeilt deze problemen doordat de covalente binding van een klein molecuul en het doel binnen de context van een natieve cel. In plaats van het immobiliseren van het kleine molecuul een grote volumineuze hars, wordt het molecuul in plaats chemisch gemodificeerd om twee kleine functionele g installerenroups: een fotoactiveerbare groep die covalente verknoping mogelijk maakt om het doeleiwit bij bestraling met een bepaalde golflengte van licht, en een reporter groep waarmee het doeleiwit te detecteren en vervolgens geïsoleerd. Levende cellen worden behandeld met de affiniteit probe bindt de probe en covalent verknoopt aan het doeleiwit en het probe-eiwitcomplex wordt vervolgens geïsoleerd intact. De specificiteit van de probe binden aan het doelwit wordt aangetoond door het uitvoeren van een competitie experiment in parallel, waarbij een overmaat van de moederverbinding wordt gebruikt om te concurreren weg binding van de probe aan het doelwit eiwit. Het ontwerp en de synthese van affiniteit probes varieert sterk van de ene klein molecuul naar de andere, en zal niet worden behandeld in dit protocol; hebben echter een aantal uitstekende discussies over het onderwerp gepubliceerd 5-9. De belangrijkste overweging is dat de sonde blijft de biologische activiteit van de moederverbinding derhalve presumably binding aan hetzelfde doel (en). Structuur-activiteitsrelaties (SAR) studies moeten worden uitgevoerd om te bepalen welke delen van het molecuul kan worden gewijzigd zonder verlies van bioactiviteit. Een verscheidenheid van verschillende chemische groepen zijn gebruikt als fotoactiveerbare crosslinkers, zoals diazirine, benzofenon, azide en aryl, die elk voor- en nadelen 10. Ook zijn er meerdere reporter labels die zijn gebruikt om probe bindende eiwitten te isoleren. Reportergroepen kunnen functioneel op zichzelf, zoals de algemeen gebruikte biotine of fluorescente labels, of kan precursors dat verdere functionalisering na de fotoverknoping stap, die het voordeel dat kleinere en dus minder gemakkelijk bioactiviteit 11 compromis vereisen. In dit protocol, hebben we een affiniteit probe die een diazirine fotoverknoping groep, en een terminale alkyn voor de bevestiging van een reporter-groep door een Cu (I) gebruikte -catalyzed azide-Acetyleenalkoholen Sharpless-Huisgen cycloadditie (of klik) reactie 12-15. De SAR studies probe ontwerp en synthese, en de resultaten van deze onderzoeken zijn elders gepubliceerd 16-18.

<table><tbody><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP)</td><td>Life Technologies</td><td>20490</td><td>Maak vers op gebruiksdag. Bereid 100 mM stock in water met 4 eq NaOH.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA)</td><td>AnaSpec</td><td>63360-50&nbsp;</td><td>Bereid 1,7 mM stock in een 4:1 verhouding van t-butanol tot DMSO, bewaar bij -20&nbsp;&deg;C.</td></tr><tr><td>Kopersulfaat (CuSO4&#8226;5H2O)</td><td>LabChem, Inc.</td><td>LC13440-1</td><td>Bereid 50 mM stock in water, bewaar bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>Biotine-azide</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>AZ104-100</td><td>Bereid 10 mM stock in DMSO, bewaar bij -20&nbsp;&deg;C.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-azide&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10277</td><td>Bereid 1 mM stock in DMSO, bewaar bij -20&nbsp;&deg;C.</td></tr><tr><td>365 nm UV lamp</td><td>Spectroline</td><td>FC100</td><td>UV-blokkerende brillen moeten worden gedragen tijdens gebruik.</td></tr><tr><td>Protease inhibitor tabletten, EDTA-vrij</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Bereid 50x oplossing in water en bewaar bij -20&nbsp;&deg;C.</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>Sonifier 250</td><td>Stel in op output 1, duty 30%.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorescente gelscanner</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>FLA 9500</td><td>Gebruik rode laser om Alexa-fluor 647 te detecteren.</td></tr><tr><td>Detergentia-compatibele Dc eiwit assay kit</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity Streptavidine Agarose kralen&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium, laag glucose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Runderserum, gekwalificeerd</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine oplossing</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>SDS Sample Buffer (2x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2676</td><td></td></tr></tbody></table>

identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Het identificeren van de moleculaire doelwitten van kleine moleculen is een uitdagende maar noodzakelijke stap om hun werkingsmechanisme te begrijpen. Hoewel er verschillende methoden voor doelwitidentificatie zijn ontwikkeld en gebruikt om met succes de bindingseiwitten van een verscheidenheid aan kleine moleculen op te helderen, hebben deze technieken nadelen die ze ongeschikt maken voor het detecteren van bepaalde soorten interacties tussen kleine moleculen en doelen. Met name niet-covalente interacties die afhankelijk zijn van native cellulaire omstandigheden, zoals die van membraaneiwitten waarvan de structuren kunnen worden verstoord bij cellyse, zijn vaak niet geschikt voor op affiniteit gebaseerde doelwitidentificatiemethoden. Hier demonstreren we een methode waarbij een sonde met een fotolabiele groep wordt gebruikt om covalent te crosslinken met het eiwit dat kleine moleculen bindt binnen de omgeving van de levende cel, waardoor de detectie en isolatie van het doeleiwit mogelijk is zonder dat de interactie na cellyse hoeft te worden onderhouden. Deze techniek is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van biologisch interessante kleine moleculen met onbekende mechanismen, zowel in de context van fundamentele biologie als in de geneesmiddelontdekking.

De hier getoonde resultaten werden verkregen met een foto-affiniteit probe van het antimycoticum itraconazol, waarvan het gebruik is eerder gepubliceerd 16. Deze resultaten demonstreren het gebruik van de foto-affiniteit labeling techniek levende cellen een belangrijke itraconazol-bindend eiwit als het 35 kDa-membraaneiwit spanningsafhankelijke anion kanaal 1 (VDAC1) met succes te identificeren. Het bovenstaande pro...

We beschrijven hier een methode voor de identificatie van klein molecuul-bindende eiwitten met behulp van fotoaffiniteitslabeling. Het voordeel van deze techniek is dat binding en covalente labeling van de doeleiwitten plaatsvindt binnen de levende cellulaire omgeving, waardoor het risico van verstoring van de native eiwitstructuur en bindingscondities bij cellyse wordt geëlimineerd.

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van de bindende eiwitten van kleine moleculen met behulp van een fotoaffiniteitsonde, die aan zijn doelwit in levende cellen kan binden, wat de daaropvolgende isolatie en identificatie van het doelwit mogelijk maakt. Deze methode kan worden gebruikt om het moleculaire werkingsmechanisme van geneesmiddelen of andere kleine moleculen te ontrafelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de binding en covalente markering van de doeleiwitten plaatsvinden binnen de natuurlijke cellulaire omgeving, waardoor het risico op verstoring van de natuurlijke eiwitstructuur en bindingscondities bij cellyse wordt weggenomen.Begin deze procedure door steriele cellenkweekschalen van zes centimeter voor te bereiden voor het gewenste aantal monsters. Meestal wordt één schaal met cellen per behandelconditie gebruikt. Voor deze demonstratie worden drie schalen met cellen voorbereid: een negatieve controle met alleen DMSO, gelabeld met D, een behandeling met alleen de probe, gelabeld met P, en een behandeling met de probe plus een competitor, gelabeld met C. Voeg aan elke kweekschaal 3,5 miljoen HEK 293 T-cellen toe in vier milliliter kweekmedium.Incubeer de cellen overnacht. Verdeel de benodigde geneesmiddelen vooraf in aliquoten in microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter voordat de cellen worden behandeld. Voeg voor de voorbehandeling met de competitor vier microliters DMSO toe aan elk van de twee buisjes, en vier microliters 10 millimolar competitor aan één buisje.Voor de behandeling met de probe voegt u 16 µL DMSO toe aan één buisje en 16 µL van de 15 µM fotoaffiniteitsprobe aan elk van de twee andere buisjes. Plaats de cellentequelschalen in de cellentequelkap voor het toevoegen van de vooraf gedoseerde geneesmiddelen. Aspireer 1 mL kweekmedium uit de schaal voor de competitiebehandeling, breng dit over naar het microcentrifugebuisje met de vooraf gedoseerde competitor en resuspendeer het geneesmiddel in het medium.Voeg het mengsel van medium en geneesmiddel voorzichtig druppelgewijs terug toe aan de schaal. Voeg op dezelfde wijze DMSO toe aan zowel de schaal met de negatieve controle als aan de schaal met de probe. Plaats de schalen gedurende 30 minuten terug in de incubator.Breng de schaaltjes na 30 minuten terug naar de cultuurkap en dim de lichten. Voeg de vooraf verdeelde DMSO toe aan het schaaltje voor de negatieve controle, en probe toe aan de probe- en competitieschaaltjes. Plaats de schaaltjes gedurende één uur terug in de incubator.Plaats de schaaltjes na één uur op ijs. Was de cellen in elk schaaltje voorzichtig met vijf milliliter ijskoude PBS om overtollige probe te verwijderen. Bedek de cellen opnieuw met vier milliliter ijskoude PBS.Plaats een schaal met cellen, gecentreerd drie centimeter onder de UV-lamp op een icepack, om opwarming door de lamp te minimaliseren, en bestraal gedurende drie minuten. Verwijder de schaal en plaats deze op ijs. Bestraal alle monsters op deze wijze.Na bestraling van alle monsters wordt de PBS van de cellen geaspireerd en wordt aan elke schaal 200 microliters ijskoud PBS met protease-remmers toegevoegd. Los de cellen met een rubberen celschraper los van de schaal en breng ze over naar vooraf gelabelde microcentrifugebuisjes op ijs. Voeg SDS toe aan elk monster tot een eindconcentratie van 0,4%. Lyseer de cellen door de suspensie gedurende 10 pulsen te soniceren, één minuut op ijs te incuberen en vervolgens nogmaals gedurende 10 pulsen te soniceren.Kook de monsters vijf minuten op een heatblock ingesteld op 95 °C om de cellyse te voltooien en alle eiwitten te denatureren. Nadat de eiwitconcentratie in elk monster is gemeten, zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt de eiwitconcentratie genormaliseerd naar 2,5 mg/mL door indien nodig PBS pH 8,5 met 0,4% SDS toe te voegen. Om met deze procedure te beginnen, brengt u 40 µL van elk cellysaat, zoals voorbereid in het vorige segment, over naar een nieuwe microcentrifugebuis.Voeg de volgende reagentia in deze volgorde toe: 0.2 µL fluor-azide, 0.58 µL TCEP en 3.38 µL TBTA. Vortex om te mengen. Voeg 1.14 µL kopersulfaatpentahydraat toe om de reactie te starten.Vortex kortstondig en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg 50 µL 2X SDS-monsterbuffer toe om de reactie te stoppen. Analyseer de monsters op een SDS-PAGE gel; wanneer het kleurfront het einde van de gel heeft bereikt, laat u de gel nog vijf minuten doorlopen om te garanderen dat alle overmatige, ongereageerde flour-azide volledig uit de gel is verdwenen.Nadat al het overtollige fluor-azide is weggewassen, plaatst u de gel op een glasplaat en scant u de gel met een fluorescentiegelscanner, volgens de instructies van de fabrikant. Voor de bevestiging van een biotinyl-tag gebruikt u de maximale hoeveelheid cellysaten na proteïnenormalisatie, zodat alle monsters hetzelfde volume hebben. Preclear de lysaten door elk monster over te brengen naar een nieuwe buis met 50 microliters vooraf gewassen high capacity streptavidine-agarosebeads.Incubeer gedurende één uur bij four degrees Celsius onder rotatie. Pelleteer de beads door centrifugatie. Verplaats het supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis op ijs en gooi de beads weg.Voeg per 500 µL lysaat de volgende reagentia toe: 1,38 µL biotin-azide, 5,5 µL TCEP en 32,5 µL TBTA. Vortex om te mengen. Voeg 11 µL kopersulfaatpentahydraat toe per 500 µL lysaat en vortex kortstondig.Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vier monstervolumes aceton toe, gekoeld tot 20 °C, vortex de monsters en incubeer deze een nacht bij 80 °C om de eiwitten volledig te precipiteren en niet-gereageerd biotin-azide te verwijderen. Centrifugeer de monsters de volgende dag gedurende 15 minuten bij 17,000 x g bij 4 °C om de geprecipiteerde eiwitten als pellet te verkrijgen.Aspireer het supernatant volledig, voeg 150 µL PBS pH 7,4 en 1% SDS toe aan elk monster en resuspendeer de eiwitten door middel van sonicatie. Voeg 600 µL PBS toe aan elk monster om de SDS-concentratie te verdunnen tot 0,2%, en voeg vervolgens het monster toe aan een nieuwe buis met 30 µL vooraf gewassen streptavidine-agarosebeads met hoge capaciteit. Incubeer gedurende één uur bij 4 °C onder rotatie.Pellet de beads na één uur door centrifugatie bij 1000 x g gedurende drie minuten. Aspireer en verwijder het supernatant, dat de ongebonden eiwitten bevat. Voeg één milliliter wasbuffer toe aan de beads en incubeer deze vijf minuten bij kamertemperatuur onder rotatie.Centrifugeer, verwijder het supernatant en was opnieuw met wasbuffer. Na de laatste wasbeurt wordt de wasbuffer volledig van de beads geaspireerd en worden 30 µL 2X SDS-monsterbuffer toegevoegd. Incubeer vijf minuten in een heatblock op 95 °C om de eiwitten van de beads los te maken.Centrifugeer de kraaltjes bij 13000 x g bij kamertemperatuur gedurende één minuut. Pipetteer zorgvuldig de monsterbuffer, die de eiwitten bevat, van de kraaltjes af voor SDS-PAGE. De visualisatie van eiwitten na labelen met de fluorescente tag wordt geïllustreerd door deze fluorescentiescans van de gel.De belangrijkste specifieke bindingsproteïneband, op ongeveer 35 kilodalton, is alleen aanwezig in de probe-baan en wordt weggedrongen door een overmaat aan de moederverbinding. Dezelfde band van 35 kilodalton werd gevisualiseerd via zilverkleuring na biotin-pulldown en vervolgens via massaspectrometrie geïdentificeerd als het membraaneiwit VDAC1. De identiteit van het eiwit werd verder gevalideerd met behulp van een specifiek antilichaam tegen VDAC1.Het signaal is aanwezig in de probe-lane en afgenomen in de competitie-lane. Het meenemen van de input-fractie garandeert dat het antilichaam werkt en dat het eiwit van belang in het lysaat kan worden gedetecteerd. De geringe toename in molecuulgewicht van de pulldown-monsters is te wijten aan de covalent gebonden probe.De gevolgen van het niet correct uitvoeren van bepaalde stappen in het protocol worden geïllustreerd. Onvolledige verwijdering van overtollig flour-azide resulteert in grote zwarte vegen aan de onderkant van de fluorescentie-gescande gel, terwijl onvoldoende preclearing van de lysaten en/of het wassen van de beads resulteert in een zilvergekleurde gel met een zeer hoge achtergrondkleuring. Van begin tot eind duurt het pulldown-experiment twee tot drie dagen.Nadat het doeleiwit is geïsoleerd en is geïdentificeerd via massaspectrometrie of western blotting, moeten verdere doelwitspecifieke validatie-experimenten worden uitgevoerd om de relevantie van het doelwit voor het door het geneesmiddel geïnduceerde fenotype te beoordelen.

identification-small-molecule-binding-proteins-native-cellular

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

SNAP-tag en CLIP-tag eiwit labeling systemen maken het mogelijk de specifieke, covalente aanhechting van moleculen, inclusief fluorescente kleurstoffen, om een ​​eiwit van interesse in levende cellen. Eenmaal gekloond en uitgedrukt, kunnen de gelabelde eiwit gebruikt worden met een verscheidenheid van substraten voor tal van downstream-applicaties zonder opnieuw te klonen.

Fluorescerende Labeling van COS-7 tot expressie SNAP-tag fusieproteïnen voor live cell imaging

Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.

Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Eiwit-eiwit-interacties worden in cellen met een ruimtelijke resolutie van nanometer gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM). Hier wordt het gebruik van BiFC-PALM beschreven voor het beeldvormen van Ras-Raf-interacties in U2OS-cellen voor het visualiseren van de nanoschalige clustervorming en diffusie van individuele Ras-Raf-complexen.

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

Dit manuscript beschrijft hoe (enkele molecuul) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-gebaseerde assays uit te voeren om de bindingsdynamiek tussen T-cel antigeen receptor (TCR) en antigeen peptide-geladen MHC-moleculen te meten zoals ze optreden binnen de immunologische synaps van een T-cel in contact met een gefunctionaliseerde planaire ondersteunde lipide bilayer.

Het meten van TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Met een FRET-gebaseerde Microscopie Assay

Een nieuwe techniek voor de detectie van lage abundantie endogeen receptoren aanwezig in zebravis embryo's wordt beschreven. We hebben het AFLIP genoemd omdat het bestaat uit affiniteitslabeling van de receptor door zijn ligand gekoppeld aan immunoprecipitatie.

Affiniteit Labeling Detectie van endogene receptoren van zebravis embryo&#39;s

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Wij bieden een stapsgewijze protocol voor split-BioID, een eiwit fragmenten-complementatie test gebaseerd op de nabijheid-labeling techniek BioID. Geactiveerd op de interactie tussen twee bepaalde eiwitten, hierdoor de proteomics analyse van context-afhankelijke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving. De methode is eenvoudig, kosteneffectief en vereist alleen gebruikelijke laboratoriumbenodigdheden.

Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Van veel intrinsiek ongeordende eiwitten is aangetoond dat ze deelnemen aan de vorming van zeer dynamische biomoleculaire condensaten, een gedrag dat belangrijk is voor tal van cellulaire processen. Hier presenteren we een op beeldvorming gebaseerde methode met één molecuul voor het kwantificeren van de dynamiek waarmee eiwitten met elkaar interageren in biomoleculaire condensaten in levende cellen.

Meting van de dynamiek van eiwitinteracties in biomoleculaire condensaten

Dit protocol beschrijft single-antibody labeling (SAL) om de nanoschaal ruimtelijke organisatie van plasmamembraaneiwitten op te lossen. Door cumulatieve antilichaam-epitoopinteracties op het niveau van één molecuul te benutten, brengt membraan SAL (mSAL) lokale epitoopverdelingen in kaart terwijl het tegelijkertijd het bindingsgedrag van antilichamen in de natuurlijke cellulaire omgeving vastlegt.

Single-molecule localisatiemicroscopie van membraaneiwitten met single-antibody labeling

Ontdek hoe je kleine molecuul-bindende eiwitten identificeert met fotoaffiniteitslabeling in levende HEK 293 T-cellen. Deze methode behoudt de native cellulaire omgeving voor betrouwbare eiwitbindingstudies.

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling (Video) | JoVE Journal

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Meer video's verkennen