Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Het algemene doel van deze procedure is om de bindende eiwitten van kleine moleculen te identificeren door gebruik te maken van een fotoaffiniteitsprobe, die zich kan binden aan het doelwit in levende cellen, waardoor de daaropvolgende isolatie en identificatie van het doelwit mogelijk wordt. Deze methode kan worden gebruikt om de moleculaire werkingsmechanisme van geneesmiddelen of andere kleine moleculen te verduidelijken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat binding en covalente markering van de doelwitten plaatsvinden binnen de native cellulaire omgeving, waardoor het risico van verstoring van de native eiwitstructuur en bindingsomstandigheden bij cellyse wordt geëlimineerd.

Begin deze procedure door steriele zes centimeter celcultuurschalen voor te bereiden, voor het gewenste aantal monsters. Typisch wordt één schaal met cellen gebruikt per behandelingsconditie. Voor deze demonstratie worden drie schalen met cellen voorbereid, en een negatieve controle met alleen DMSO, gelabeld D, probe-behandeling alleen, gelabeld P, en probe plus concurrent, gelabeld C.Voeg aan elke kweekschaal 3,5 miljoen HEK 293 T-cellen toe in vier milliliter kweekmedium.

Incubeer de cellen een nacht. Voorafgaand aan het behandelen van de cellen, verdeel de benodigde geneesmiddelen in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Voor de concurrentbehandeling, voeg vier microliter DMSO toe aan elk van twee buisjes, en vier microliter 10 millimolair concurrent aan één buisje.

Voor de probe-behandeling, voeg 16 microliter DMSO toe aan één buisje, en 16 microliter 15 micromolair fotoaffiniteitsprobe aan elk van twee buisjes. Breng de celkweekschalen in de celkweekkap voor de toevoeging van de vooraf verdeelde geneesmiddelen. Aspireer één milliliter kweekmedium uit de concurrentiebehandelingsschaal, breng het over naar het microcentrifugebuisje dat het vooraf verdeelde concurrent bevat, en suspendeer het geneesmiddel in het medium.

Voeg het medium en geneesmiddelmengsel druppelsgewijs terug toe aan de schaal. Voeg op dezelfde manier DMSO toe aan zowel de negatieve controleschaal als de probe-schaal. Breng de schalen terug in de incubator voor 30 minuten.

Na 30 minuten, breng de schalen terug naar de kweekkap en dim de verlichting. Voeg het vooraf verdeelde DMSO toe aan de negatieve controleschaal, en probe aan de probe- en concurrentieschalen. Breng de schalen terug in de incubator voor één uur.

Na één uur, plaats de schalen op ijs. Was de cellen in elke schaal voorzichtig met vijf milliliter ijskoud PBS om overtollig probe te verwijderen. Bedek de cellen opnieuw met vier milliliter ijskoud PBS.

Plaats een schaal met cellen, gecentreerd drie centimeter onder de UV-lamp boven een ijspak, om verwarming van de lamp te minimaliseren, en bestraal gedurende drie minuten. Verwijder de schaal en plaats deze op ijs. Op deze manier bestraal je alle monsters.

Na bestraling van alle monsters, aspireer het PBS van de cellen, en voeg 200 microliter ijskoud PBS met proteaseremmers toe aan elke schaal. Verwijder de cellen van de schaal met behulp van een rubberen schraper, en breng over naar vooraf gelabelde microcentrifugebuisjes op ijs. Voeg SDS toe aan elk monster tot een eindconcentratie van 0,4%Lyse de cellen door de suspensie te soniceren gedurende 10 pulsen, incubatie op ijs gedurende één minuut, en vervolgens soniceren voor nog eens 10 pulsen.

Kook de monsters op een hitteblok ingesteld op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten om cellyse te voltooien en alle eiwitten te denatureren. Na het meten van de eiwitconcentratie in elk monster, zoals beschreven in het tekstprotocol, normaliseer de eiwitconcentratie naar 2,5 milligram per milliliter, door PBS PH 8,5 plus 0,4%SDS toe te voegen zoals nodig is. Om deze procedure te beginnen, breng 40 microliter van elk cellysaat, bereid in het vorige segment, over naar een nieuw microcentrifugebuisje.

Voeg de volgende reagentia toe in deze volgorde, 0,2 microliter flour-azide, 0,58 microliter TCEP, en 3,38 microliter TBTA. Vortex om te mengen. Voeg 1,14 microliter kopersulfaat pentahydraat toe om de reactie te starten.

Vortex kort en incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur in het donker. Voeg 50 microliter 2X SDS monsterbuffer toe om de reactie te stoppen. Laat de monsters lopen op een SDS-PAGE-gel, en wanneer de kleurfront het einde van de gel heeft bereikt, laat de gel nog vijf minuten lopen om ervoor te zorgen dat al het overtollige ongereageerde flour-azide de gel volledig heeft verlaten.

Na het wegspoelen van al het overtollige flour-azide, plaats de gel op een glazen plaat en scan de gel met een fluorescente gelscanner, volgens de instructies van de fabrikant. Voor de aanhechting van een biotin tag, gebruik de maximale hoeveelheid cellysaat na eiwitnormalisatie, zodat alle monsters hetzelfde volume hebben. Reinig de lysaten vooraf door elk monster toe te voegen aan een nieuwe buis, die 50 microliter vooraf gewassen hoge capaciteit streptavidine agarose kralen bevat.

Incubeer gedurende één uur bij vier graden Celsius met rotatie. Bepaal de kralen door centrifugatie. Verwijder het supernatant naar een nieuw microcentrifugebuisje op ijs, en gooi de kralen weg.

Voeg per 500 microliter lysate de volgende reagentia toe, 1,38 microliter biotin-azide, 5,5 microliter TCEP, en 32,5 microliter TBTA. Vortex om te mengen. Voeg 11 microliter kopersulfaat pentahydraat per 500 microliter lysate toe en vortex kort.

Incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Voeg vier monstervolumes aceton toe, gekoeld tot 20 graden Celsius, vortex de monsters, en incubeer een nacht bij 80 graden Celsius, om de eiwitten volledig te bezinken en ongereageerde biotin-azide te verwijderen. De volgende dag centrifugeert u de monsters bij 17.000 x g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om de bezonken eiwitten te bepalen.

Aspireer het supernatant volledig, voeg 150 microliter PBS PH 7,4 en 1%SDS toe aan elk monster, en los de eiwitten opnieuw op door sonicatie. Voeg 600 microliter PBS toe aan elk monster