Imaging levensvatbaarheid van de cellen op niet-transparante Steigers - Met behulp van het voorbeeld van een Novel Gebreide Titanium Implant

Het algemene doel van dit experiment is om de microstructuur van, en celhechting op, een niet-transparant gebreid titanium nucleaire implantaat te visualiseren, met behulp van fluorescentiebeeldtechnieken. Deze methode breidt de analyse van weefselengineering met niet-transparante scaffolds uit. Een voordeel van deze techniek is dat men de celviabiliteit en de proliferatie op de scaffold kan volgen met een gedefinieerde cultuurped-air.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de fluorescente kleuring en, later, de visualisatie uitdagend zijn. Individuele scaffold-eigenschappen zoals de poriegrootte kunnen het tijdstip beïnvloeden, en/of de fluorescentie van de scaffold kan de keuze van fluoroforen die je gebruikt beïnvloeden. Plaats maximaal vijf scaffolds van zes of zeven millimeter dik in een 50 milliliter buis, en was ze drie keer met water gedurende 20 minuten per wasbeurt.

Doe dit op kamertemperatuur met zachte agitatie. Was vervolgens de scaffolds in 30 milliliter 1% Triton X-100 oplossing onder dezelfde omstandigheden. Voer daarna nog twee waterwasbeurten uit.

Sonificeer nu sequentieel de scaffolds in reagenskwaliteit 99% aceton, 99% isopropanol en 99% ethanol. Voer elke sonificatiestap twee keer uit gedurende vijf minuten per sonificatie. Sonificeer vervolgens de scaffold nog drie keer in water voor een totaal van 15 minuten.

Werk af door de scaffolds op een pluisvrij doekje te plaatsen en ze een nacht bij kamertemperatuur te laten drogen. De volgende dag, autoclaveer de scaffolds gedurende 15 minuten bij 121 graden Celsius en 15 PSI. Gebruik indirecte fluorescentie om te bevestigen dat het reinigen werkte.

Laad een putje van een 12-putjesplaat met 2000 microliter van de vers gemaakte sulfur-Rhodamine B kleuroplossing, en gebruik pincetten om een scaffold in dat putje te brengen. Vang vervolgens negatieve beelden van de scaffold op met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een RFP LED cube filterset en zoek naar onzuiverheden bij hoge vergroting. Gebruik de bioveiligheidskast om de schone scaffolds over te brengen naar de putjes van een 24-putjesplaat.

Voeg 500 microliter 37 graden Celsius cultuurmedium toe aan elke put en laat de scaffold 15 minuten weken. Bereid ondertussen 500.000 Ad-GFP geïnfecteerde SEP1 cellen per 1 milliliter medium. Na 15 minuten, aspireer het medium volledig uit de scaffolds en bedekken ze met 100 microliter van de celsuspensie.

Incubeer ze vervolgens 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg na de korte incubatie 500 extra microliter cultuurmedium toe en incubeer de scaffolds gedurende 24 uur. De volgende dag, ververs het cultuurmedium om niet-hechtende cellen te verwijderen.

Beoordeel vervolgens de hechting en verspreiding van de cellen op de scaffolds, met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een GFP LED cube filterset. Voor een levend-dood kleuring, plateer eerst de SEP1 cellen op de scaffold zoals eerder. Na 24 tot 48 uur, aspireer het cultuurmedium volledig en was de scaffolds met DPBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Kleur de cellen nu met cultuurmedium dat Calcein AM, Hoechst 33342 en Ethidium homodimer bevat. Deze drie fluoroforen zijn allemaal lichtgevoelig, dus het is van vitaal belang om de cellen in het donker te houden. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten met de fluoroforen om een gelijkmatige verdeling door de scaffold te krijgen.

Specifieke scaffoldkenmerken zullen deze incubatietijd beïnvloeden. Was de cellen na de incubatie drie keer met DPBS met één milliliter per put. Voer elke wasbeurt uit gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Direct na de wasbeurten, documenteer de scaffolds met behulp van fluorescentiemicroscopie. Gebruik resazurinconversiemetingen om de celviabiliteit in de loop van de tijd te meten. Aspireer eerst het cultuurmedium volledig van de SEP1 cellen geplaatst in een 24-putjesplaat en was de cellen met 500 microliter DPBS per put.

Bedek de cellen vervolgens met het vereiste volume steriel resazurin werkoplossing en neem één put met alleen resazurin op. Incubeer vervolgens de cellen gedurende ongeveer 30 minuten bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, breng 100 microliter van de geconditioneerde supernatant van elke put over in een 96 micro-wellplaat om de fluorescentie te meten zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voor verdere cultivatie, verwijder de resazurin uit de put en was drie keer met één milliliter DPBS. Voer elke wasbeurt uit gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na de derde wasbeurt, voeg 500 microliter cultuurmedium toe aan elke celput en vervolg de incubatie voor verdere tijdsverloopmetingen.

Met behulp van indirecte fluorescentiekleuring werden voorreinigingsonzuiverheden gedocumenteerd om het reinigingsprotocol te optimaliseren. Een significante vermindering van de stofbelasting op de scaffold toont de efficiëntie van het beschreven reinigingsprotocol. De opeenvolgende implantaten gebruikt voor artroplastiekbehandeling worden bepaald door gebeurtenissen die plaatsvinden op het cel-materiaal grensvlak.

Na 24 uur hechting met de scaffolds, waren de SEP1 cellen gehecht. Fluoroforen werden vervolgens aangebracht om celdood en proliferatie gedurende een periode op de scaffolds te onderzoeken. Levend-dood kleuring toonde blauwe nucleaire kleuring met rode fluorescentie in dode cellen en groene fluorescentie in levensvatbare cellen.

Bovendien werd de celviabiliteit op de scaffold gekwantificeerd met behulp van de resazurinconversietest. Gedurende twee weken werden gegevens verzameld over cellen gekweekt met, of zonder, scaffolds. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat je de gebruikte fluoroforen moet aanpassen aan de scaffold en microscoop die je beschikbaar hebt.

Na dit protocol kunnen andere methoden, zoals immunofluorescente kleuring, worden toegepast om de aanwezigheid van eiwitten of de activering van signaalcascades te visualiseren. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de therapie van artroplastiek, omdat de interactie van de cel met het omringende weefsel in vivo zijn functie en duurzaamheid zal be