Creatie en transplantatie van een blad van de stamcel adipeus afkomstige (ASC) in een diabetische wondgenezing Model

Het algemene doel van deze procedure is om het effect van adipositiecellen gecombineerd met kunstmatige huid op wondgenezing voor een groot huiddefect met volledige dikte bij diabetische ratten te verifiëren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de genezing van chronische wonden, zoals diabetische grote wond met blootgestelde botten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat cellen in vaste vellen worden getransplanteerd naar de wond met behulp van celveentechnologie, en het resultaat is een levensvatbare, stabiele transplantatie.

Voor een vetkussen donor, is het de bedoeling om acht tot 33 weken oude Lewis ratten te gebruiken. Bereid op de operatieplaats verschillende steriele wattenstaafjes, gaasjes, een scalpel, een naaldhouder, operatiescharen, een paar pincetten en 5-0 nylondraad. Laad voor tijdelijke weefselplaatsing een 100 milliliter petrischaal met 10 milliliter PBS.

Weeg de PBS-geladen schaal om later de massa van het geoogste weefsel te vinden. Na het verdoven van de rat, plaats deze op de rug op een steriele doek. Scheer vervolgens het operatiegebied en schrob de blootgestelde huid met verschillende afwisselende scrubs van 70% ethanol.

Maak nu een drie centimeter huid incisie in de laterale onderbuik. Blootstel en dissecteer vervolgens de externe schuine buikspier. Belicht vervolgens het epididymale vetweefsel rond de epididymis.

Vervolgens, verwijder voorzichtig het epididymale vetweefsel. Vermijd schade aan de epididymis, testikels en epididymale bloedvaten. Breng het weefsel over in de schaal met PBS.

Sluit vervolgens de donorrat en volg standaard postoperatieve zorgpraktijken. Isoleer de ASC's uit twee tot drie gram geoogst vetweefsel. Digest het weefsel gedurende een uur in 0,1% type A collageenase om de stromale vasculaire fractie, of SVF, te verkrijgen.

Na zuivering van de SVF, schors de SVF in 20 milliliter medium. Verdeel de suspensie in twee 60 vierkante centimeter kweekschotels en kweek ze 24 uur onder standaard omstandigheden. De volgende dag, was de schotels drie keer met PBS om eventuele niet-bevestigde cellen en puin te verwijderen.

Na de laatste wasbeurt, voeg vers compleet medium toe. Ga vervolgens door met het doorvoeren van cellen totdat ze bijna sub confluent zijn op de derde dag van het kweken. Gebruik vervolgens één milliliter van 0,25% trypsine EDTA in een korte incubatie.

Verwijder de cellen van de plaat. Laat de cellen niet meer dan 10 minuten blootgesteld zijn aan actief trypsine. Na het observeren en tellen van de cellen, subcultureer ze in een dichtheid van 1.700 per vierkante centimeter.

Geef vervolgens de cellen om de drie dagen en voltooi drie passages voordat u doorgaat. Na het doorvoeren van de gesubcultureerde rat ASC's voor de derde keer, plateer 150.000 cellen op een 35 millimeter diameter temperatuurgevoelige kweekschaal en twee milliliter kweekmedium. Kweek de schaal drie dagen in een incubator om een uniforme celveen te maken.

Drie dagen later, verander het medium en voeg 16,4 microgram per milliliter van AA toe. Kweek vervolgens de cellen, verander het AA-medium om de andere dag. Controleer na vier of vijf dagen op het AA-bevattende medium de proliferatie van de ASC's. Kijk naar openingen tussen de cellen en de aaneengesloten celveen.

Zodra een aaneengesloten celveen is gevestigd, kunnen de cellen voor het model worden gebruikt. Wanneer nodig, verzamel het celveen door de plaat gedurende 15 tot 20 minuten op kamertemperatuur te plaatsen. Omdat de plaat temperatuurgevoelig is, zullen de cellen zich spontaan losmaken als een aaneengesloten veen en kan het veen met pincetten worden verwijderd.

Voor het obesitas wondgenezingsmodel, gebruik volwassen mannelijke ZDF ratten, 16 tot 18 weken oud en weegt tussen 500 en 600 gram. Positioneer en verdooft de rat op het operatiegebied, en reinig het voordat het hoofd wordt geschoren, met 70% ethanol. Scheer vervolgens het operatiegebied en reinig de blootgestelde huid met afwisselende scrubs van 70% ethanol.

Rond deze tijd, breng de temperatuurgevoelige plaat van adipositiecellen naar de werkbank. Voordat het celveen zich losmaakt van de plaat, verwijder het medium en was het celveen drie keer met PBS. Na het verzamelen van het celveen, laat het weken in PBS tot het nodig is.

Zodra de cellen klaar zijn, maak een 15 bij 10 millimeter volledige dikte huiddefect op het hoofd van de rat. Verwijder eerst het cutane weefsel tot aan het periosteum. Vervolgens, verwijder de huid en cutaan weefsel met een scalpel en een paar chirurgische schaar.

Om het defect te voltooien, verwijder het periosteum met de periostale rasp. Plaats vervolgens het celveen over het defect. Het stamcelveen is zacht en flexibel.

Gebruik pincetten om het uit te strekken tot elke hoek van het defect. Bedek nu het celveen en defect met een 10 bij 15 millimeter patch van kunstmatige huid gedrenkt in zoutoplossing vlak voor gebruik, en sluit het wond met ongeveer 10 steken met behulp van 5-0 nylondraad. Om de wond te beschermen, gebruik 5-0 nylondraad om een 15 bij 20 millimeter stuk niet-klevend verband boven de kunstmatige huid vast te zetten.

Plan om het verband om de andere dag te observeren, omdat de rat het onvermijdelijk zal verwijderen, en indien nodig, vervang het verband onmiddellijk. In twee groepen van zes Zucker diabetische vette ratten, werd het beschreven protocol gebruikt om een schedeldefect te creëren. Experimentele ratten werden behandeld met een rat adipositiecellen veen, en de controles niet.

Na 14 dagen waren de wonden van de behandelingsgroep significant kleiner dan die van de controles. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een grote wond met blootgestelde botten bij ratten kunt maken en vervolgens die wond kunt behandelen met adipositiegeleidende