Genereren van tweekleurige Antigen Microarrays voor de simultane detectie van IgG en IgM Autoantistoffen

Het algemene doel van deze techniek is om autoantistoffen snel op multiplex-wijze te screenen. Deze methode kan helpen bij het identificeren van kernvragen op het gebied van autoimmuniteit, zoals welke autoantistoffen gecorreleerd zijn met verschillende ziektestadia. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat autoantistoffen parallel gescreend kunnen worden, er slechts microliters serum nodig zijn en er slechts microgrammen antigeen vereist zijn.

Om antigeen-microarrays te genereren, begint u met het verdunnen van antigenen in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 2 mg/mL. Stel een configuratie van de microarrayer in met negen pinnen om maximaal 162 unieke antigenen in dubbeltoets te printen. Neem IgG- en IgM-antigenen op in de antigeenbibliotheek als positieve controles.

Gebruik uitsluitend PBS als negatieve controle. Voeg 20 µL van elk antigeen toe aan de 384-well bronplaat in groepen die overeenkomen met de configuratie van de printhoofd. Dek de bronplaat af met aluminiumfolie en vries de plaat in bij -80 °C tot het moment dat de arrays geprint kunnen worden.

Reinig de pinnen van de vaste microarray door ze drie keer gedurende één minuut in een ultrasoon bad met gedeïoniseerd water te incuberen. Plaats de pinnen in een rek om te drogen. Plaats de pinnen vervolgens in de microarray-printkop.

Gebruik voor negen pinnen een configuratie van drie bij drie. Programmeer vervolgens de microarrayer voor de printrun door het aantal pinnen op de printkop, het aantal te printen objectglazen, het aantal pads op elk objectglas en het aantal replica-spots voor elk antigeen in te stellen. Programmeer de microarrayer daarnaast zo dat de pinnen in water worden gesoniceerd tussen verschillende groepen antigenen.

Centrifugeer daarna, na het ontdooien van de bronplaat, deze gedurende één minuut bij 100 ×g. Plaats de bronplaat op de aangewezen positie in de microarrayer en verwijder vervolgens het stuk folie dat de eerste groep antigenen bedekt die geprint moeten worden. Plaats de ongeprinte objectglazen op het oppervlak van de arrayer en start het printprogramma. Print de objectglazen bij kamertemperatuur, waarbij de luchtvochtigheid op de arrayer is ingesteld op 55 tot 60%. Pauzeer de microarrayer nadat elke groep antigenen op alle objectglazen is geprint.

Dek de zojuist geprinte antigenen af met folie om verdamping te voorkomen en maak de volgende groep te printen antigenen vrij. Vervolg daarna het printprogramma. Nadat alle antigenen zijn geprint, dient de bronplaat met een nieuw stuk folie te worden afgedekt en bij minus 80 degrees Celsius te worden ingevroren.

Plaats de geprinte slides in een slide-doos en seal deze vacuüm. De slides kunnen de volgende dag of tot een maand later worden gebruikt. Om microarrays te sonderen met verdunde sera met behulp van incubatiekamers, moeten de slides in frames worden geplaatst.

Voeg vervolgens 700 microliters blokkeringsbuffer toe aan elk array-oppervlak. Plaats de adhesieve folie over het frame en breng dit over naar een afgesloten container met een stukje nat vloeipapier. Incubeer de slides daarna gedurende de nacht bij vier graden Celsius op een rocker.

Verdun de serummonsters de volgende dag 1 op 100 in blokkeringsbuffer. Aspireer vervolgens de blokkeringsoplossing uit de arrays en voeg 500 microliters van het verdunde monster toe aan elk arrayoppervlak. Dek de arrays daarna af met adhesiefilm en incubeer één uur bij vier graden Celsius, onder voortdurend schudden.

Aspire vervolgens de serummonsters uit de arrays en spoel de array-oppervlakken vier keer met spoelbuffer door de buffer over de slides te gieten en deze snel af te schudden. Gebruik 700 microliters blokkeringsbuffer om elk array-oppervlak te wassen en laat dit 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur onder schudden. Voeg daarna 500 microliters verdunde secundaire antilichamen toe aan elk slide-oppervlak en dek dit af met adhesieve folie.

Incubeer de coupes bij vier graden Celsius onder schudden gedurende 45 minuten. Aspireer na de incubatie het mengsel van secundaire antilichamen van de coupes en spoel vier keer af, zoals zojuist gedemonstreerd. Was de coupes vervolgens drie keer gedurende 10 minuten met 700 microliters blokkeringsdilutiebuffer.

Verwijder de objectglaasjes uit de frames, plaats ze vervolgens in een metalen objectglasrekje en dompel ze onder in PBS. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur onder orbitale schudding. Plaats een objectglasrekje gedurende 15 seconden in een bak met gedeïoniseerd water.

Plaats het rek vervolgens in een nieuwe bak met water en laat dit nog 15 seconden incuberen. Om de coupes te drogen, plaatst u het couperek op een ELISA-plaatadapter in de centrifuge en centrifugeert u vijf minuten bij 220 ×g en kamertemperatuur. Bewaar de coupes in een lichtdichte doos tot ze gescand worden.

Gebruik voor het scannen van de slides een microarray-scanner die SI drie en SI five fluorescente signalen kan detecteren. Bepaal de optimale multiplier tube, of PMT-instellingen, door vooraf een volledige antigenbibliotheek-slide te scannen die uitsluitend met secundaire antilichamen is beproefd. Stel de gebruikte PMT-waarden in door op de hardwareknop te drukken, zodanig dat de menselijke IgG-kenmerken op het SI drie-kanaal en de menselijke IGM-kenmerken op het SI vijf-kanaal een vergelijkbare mediane fluorescentie-intensiteit minus achtergrond, of MFIB, hebben, wat doorgaans 40 000 is.

Scan vervolgens de experimentele slides op de twee kanalen door op de scan-knop te drukken. Sla de slide-afbeeldingen van beide kanalen na elke scan op. Laad met de bestandsknop de te analyseren slide in de microarray-software.

Gebruik vervolgens de bestandsknop om de gen-arraylijst, of GAL-bestand, te laden, waarin de indeling van de array staat met de identiteiten van de array-kenmerken. Plaats het array-sjabloon over de gescande afbeelding, zodat de kenmerken van de array zo nauwkeurig mogelijk met het sjabloon overeenkomen. Druk op de uitlijnknop om de kenmerken in alle blokken uit te lijnen met het sjabloon.

De software berekent vervolgens een MFI minus achtergrond voor elk van de antigenen. Gebruik tenslotte de bestandsknop om de resultaten als tekstbestand te exporteren en analyseer de gegevens volgens het tekstprotocol. In deze figuur, waarin positieve en negatieve controle-dia's worden getoond, is de negatieve dia alleen behandeld met secundaire antilichamen en is de positieve controledia behandeld met serum van een patiënt met systemische lupus erythematosus.

Zoals hier aangegeven, blijkt het positieve controleserum, met bekende reactiviteit voor riboP, IgM-antilichamen tegen enkelstrengs DNA en IgG-antilichamen tegen riboP te bevatten. Lineaire responsen werden waargenomen voor IgM bij alle serumverdunningen, en voor IgG tot een MFI minus achtergrond van ongeveer 30 000. In dit experiment wordt de array onderzocht met menselijk serum van een patiënt met cryoglobulinemische vasculitis, met een gedocumenterde reumafactor, wat een IgM-antilichaam tegen IgG is.

Het IgG-kenmerk is geel-groen vanwege de binding van IgM in het serum van de patiënt aan het geïmmobiliseerde IgG op de array. Bij gebruik van enkel secundaire antilichamen is geen IgM-reactiviteit zichtbaar tegen het IgG dat op de array is gespot. Hier is te zien dat muis IgM en IgG, gespot op de array, uitsluitend worden gedetecteerd met respectievelijk anti-muis secundaire antilichamen tegen IgM en IgG.

Deze figuur toont de uitlijning van een sjabloonraster op een gescande array-afbeelding, met behulp van microarray-analyse-software. Zodra de uitlijning is voltooid, kunnen de array-kenmerken worden geanalyseerd om de mediane fluorescentie-intensiteit minus de achtergrond voor elk kenmerk te verkrijgen. Zodra men hiermee bekend is, kan de probing van antigeen-microarrays in vier uur worden voltooid als dit correct wordt uitgevoerd.

Na deze procedure kunnen andere technieken, zoals ELISA, worden uitgevoerd om de resultaten van de antigeen-microarrays te valideren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u antigeen-microarrays print, hoe u antigeen-microarrays met serum sondeert en hoe u antigeen-microarrays met een scanner scant. Vergeet niet dat werken met menselijk serum risicovol kan zijn en dat universele voorzorgsmaatregelen in acht moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.