Genereren van tweekleurige Antigen Microarrays voor de simultane detectie van IgG en IgM Autoantistoffen
15 september 2016
We beschrijven hier een methode om aanpasbare antigeen-microarrays te genereren die kunnen worden gebruikt voor de gelijktijdige detectie van serum IgG en IgM auto-antilichamen van mensen en muizen. Deze arrays maken een doorvoer en kwantitatieve detectie mogelijk van antilichamen tegen willekeurige antigenen of epitopen van belang.
Het algemene doel van deze techniek is om snel en in multiplex te screenen op autoantilichamen. Deze methode kan helpen bij het identificeren van belangrijke vragen op het gebied van auto-immuniteit, zoals welke autoantilichamen gecorreleerd zijn met verschillende ziektetoestanden. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat autoantilichamen parallel gescreend kunnen worden, slechts microliters serum nodig zijn en slechts microgram antigen nodig zijn.
Om antigeen-microarrays te genereren, begint u met het verdunnen van antigenen in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 2 milligram per milliliter. Stel een micro arrayer-configuratie in met negen pennen om maximaal 162 unieke antigenen in duplicaat af te drukken. Neem IgG- en IgM-antigenen op in de antigeenbibliotheek als positieve controles.
Neem alleen PBS op als negatieve controle. Voeg 20 microliter van elk antigeen toe aan de 384-wells bronplaat in groepen die de indeling van de printkop weerspiegelen. Bedek de bronplaat met folie en bevries de plaat tot minus 80 graden Celsius, totdat u klaar bent om arrays af te drukken.
Reinig de vaste microarray-pennen door ze driemaal gedurende één minuut in een sonerend bad met gedeïoniseerd water te incuberen. Plaats de pennen in een rek om te drogen. Schik vervolgens de pennen in de printkop van de microarray.
Gebruik voor negen pennen een drie bij drie configuratie. Programmeer vervolgens de microarrayer voor de afdrukrun door het aantal pennen op de printkop in te stellen, het aantal te afdrukken slides, het aantal pads op elke slide en het aantal replica spots voor elk antigeen. Programmeer bovendien de microarrayer om de pennen in water te sonificeren tussen verschillende groepen antigenen.
Nadat u de bronplaat hebt ontdooid, centrifugeert u deze één minuut bij 100 keer G. Plaats de bronplaat op de aangewezen plek in de microarrayer en verwijder het deel van de folie dat de eerste groep antigenen bedekt die moeten worden afgedrukt. Schik de onbedrukte slides op het arrayoppervlak en voer het afdrukprogramma uit. Druk slides af bij kamertemperatuur met de vochtigheid ingesteld op de arrayer op 55 tot 60%Nadat elke groep antigenen op alle slides is afgedrukt, pauzeert u de microarrayer.
Bedek de net bedrukte antigenen met folie om verdamping te voorkomen en ontdek de volgende groep antigenen die moeten worden afgedrukt. Ga vervolgens verder met het afdrukprogramma. Nadat alle antigenen zijn afgedrukt, bedekt u de bronplaat met een nieuw stuk folie en bevriest u deze op minus 80 graden Celsius.
Plaats de bedrukte slides in een slidebox en sluit deze vacuüm. Slides kunnen de volgende dag worden gebruikt, of tot een maand later. Om microarrays te sonderen met verdunde sera met behulp van incubatiekamers, plaatst u de slides in frames.
Voeg vervolgens 700 microliter blokkeringsbuffer toe aan elk arrayoppervlak. Plaats de kleeffilm over het frame en breng het over in een verzegeld vat met een stuk nat weefsel. Bewaar vervolgens de slides bij vier graden Celsius op een rokker gedurende een nacht.
De volgende dag verdunt u de serummonsters een op honderd in blokkeringsbuffer. Asptereer vervolgens de blokkeringsoplossing van de arrays en voeg 500 microliter verdund monster toe aan elk arrayoppervlak. Bedek vervolgens de arrays met kleeffilm en incubeer bij vier graden Celsius, met rokken gedurende een uur.
Asptereer vervolgens de serummonsters van de arrays en gebruik spoelbuffer om de arrayoppervlakken vier keer te spoelen door de buffer op de slides te gieten en snel af te kloppen. Gebruik 700 microliter blokkeringsbuffer om elk arrayoppervlak te wassen en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur met rokken. Voeg vervolgens 500 microliter verdunde secundaire antilichaam toe aan elk slideoppervlak en bedek het met kleeffilm.
Incubeer de slides bij vier graden Celsius met rokken gedurende 45 minuten. Na de incubatie, asptereer het secundaire antilichaammengte van de slides en spoel vier keer, zoals zojuist is gedemonstreerd. Was vervolgens de slides met 700 microliter blokkeringsverdunningsbuffer, drie keer gedurende 10 minuten.
Verwijder de slides uit de frames, plaats ze in een metalen sliderek en dompel ze onder in PBS. Incubeer bij kamertemperatuur met orbitaal schudden gedurende 20 minuten. Plaats een sliderek in een vat met gedeïoniseerd water gedurende 15 seconden.
Plaats vervolgens het rek in een nieuwe container met water en incubeer gedurende nog eens 15 seconden. Om de slides te drogen, plaats u het sliderek op een ELISA-plateadapter in de centrifuge en draai het gedurende vijf minuten bij 220 keer G en kamertemperatuur. Plaats de slides in een lichtdichte doos totdat ze klaar zijn om te scannen.
Gebruik voor het scannen van de slides een microarray-scanner die SI drie en SI vijf fluorescente signalen kan detecteren. Bepaal de optimale vermenigvuldigerbuis, of PMT-instellingen, door een volledige antigeenbibliotheek-slide vooraf te scannen die alleen is besonderd met secundaire antilichamen. Stel de gebruikte PMT-waarden in door op de hardwareknop te drukken, zodat de menselijke IgG-functies op het SI drie-kanaal en de menselijke IGM-functies op het SI vijf-kanaal een vergelijkbare mediane fluorescentie-intensiteit minus achtergrond, of MFIB, hebben, wat doorgaans 40.000 is.
Scan vervolgens de experimentele slides op de twee kanalen door op de scanknop te drukken. Sla de slide-afbeeldingen op beide kanalen op na elke scan. Gebruik de bestandsknop om het te analyseren slide in de microarray-software te laden.
Gebruik vervolgens de bestandsknop om de gene array-lijst, of GAL-bestand, te laden, die de lay-out van de array heeft, met de identiteiten van de array-functies. Plaats de array-sjabloon over de gescande afbeelding, zodat de array-functies zo nauw mogelijk overeenkomen met de sjabloon. Druk op de uitlijnknop om functies in alle blokken met de sjabloon uit te lijnen.
De software berekent vervolgens een MFI minus achtergrond voor elk van de antigenen. Gebruik ten slotte de bestandsknop om de resultaten te exporteren als een tekstbestand en analyseer de gegevens volgens het tekstprotocol. In deze figuur,
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van aanpasbare antigeen-microarrays die de gelijktijdige detectie van serum IgG en IgM-autoantilichamen van mensen en muizen mogelijk maken. De techniek maakt hoge doorvoer en kwantitatieve detectie van antilichamen mogelijk tegen verschillende antigenen of epitopen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Auto-immuniteit
- Immunologie
- Hoge doorvoer screening
Achtergrond
- Auto-antilichamen spelen een cruciale rol bij auto-immuunziekten.
- Het identificeren van specifieke auto-antilichamen kan correleren met verschillende ziektetoestanden.
- Traditionele methoden kunnen beperkt zijn in doorvoer en gevoeligheid.
- Deze methode maakt de analyse van meerdere auto-antilichamen tegelijkertijd mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om een techniek te ontwikkelen voor snelle screening van auto-antilichamen.
- Om correlaties tussen auto-antilichamen en ziektetoestanden te identificeren.
- Om de efficiëntie van antilichaamdetectie met microarrays te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Verdunning van antigenen in PBS tot een concentratie van 2 mg/mL.
- Installatie van een micro arrayer met negen pinnen voor het afdrukken van antigenen.
- Opname van IgG en IgM antigenen als positieve controles.
- Screening van auto-antilichamen met slechts microliters serum.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van antigeen-microarrays voor de detectie van auto-antilichamen.
- Demonstratie van hoge doorvoer capaciteiten in screening.
- Kwantitatieve beoordeling van antilichamen tegen verschillende antigenen.
- Mogelijkheid om belangrijke auto-antilichamen te identificeren die zijn gekoppeld aan auto-immuunziekten.
Conclusies
- De ontwikkelde methode verbetert de mogelijkheid om te screenen op auto-antilichamen.
- Het biedt een platform voor verder onderzoek naar auto-immuniteit.
- Deze techniek kan leiden tot verbeterde diagnostische hulpmiddelen voor auto-immuunziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables multiplexed detection of IgG and IgM autoantibodies using minimal sample volumes, supporting early-stage target validation in autoimmune disease research. By providing quantitative, parallel readouts of autoantibody reactivity, it enhances predictive confidence in biomarker discovery and reduces reliance on low-throughput ELISA workflows. The two-color detection system improves assay efficiency and data consistency for immunoprofiling applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by profiling autoantibody reactivity against multiple antigens in parallel.
- Operational Value: Reduces sample consumption to microliters of serum, preserving limited clinical specimens for downstream analysis.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through simultaneous detection of IgG and IgM isotypes, clarifying immune complex formation mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible microarray slides with duplicate antigen spots for reliable signal quantification.
- Operational Value: Facilitates assay scalability through robotic printing of up to 162 antigens per slide, enabling high-content screening campaigns.
- Scientific Value: Produces quantitative MFI minus background readouts that allow comparison of autoantibody titers across sample sets.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables cross-species applicability with validated detection of both human and murine autoantibodies, supporting translational model consistency.
- Operational Value: Allows long-term storage of printed slides (up to one month), facilitating batch-to-batch assay reproducibility in preclinical studies.
- Scientific Value: Provides a platform for identifying autoantibody signatures linked to disease states, informing patient stratification strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, offering a reusable platform for immunoprofiling prior to functional assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling rapid screening of autoantibody reactivity patterns associated with disease phenotypes.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation and dual-isotype detection, ensuring consistent reagent performance.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence readouts (MFI minus background) that enable statistical comparison of antigen-specific responses.
- Translational Research: Connects discovery-phase autoantibody profiling to preclinical validation through cross-reactive detection in human and mouse systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a customizable microarray platform where antigen libraries can be rapidly reconfigured for new target panels without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false negatives through multiplexed, parallel detection.
- Operational Value: Enhances reproducibility via standardized printing, blocking, and washing steps that minimize technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early immunological risk assessment in autoimmune target programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on autoantibody prevalence and isotype distribution across sample cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microarray printing, serum handling, and fluorescence scanning instrumentation.
- Dependent on access to a robotic microarrayer with sonication capability and a dual-channel fluorescent scanner.
- Necessitates standardization of serum dilution, blocking buffer composition, and incubation conditions across users.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different antigen sources or species-specific secondary antibodies.
- Limited by the need for optimized PMT settings to balance IgG (SI three) and IgM (SI five) channel signals for accurate quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:35
Dilution Antigens and Generating Antigen Microarrays
3:21
Probe Antigen Microarrays with Diluted Sera
6:02
Scanning Antigen Microarrays and Exporting Data
7:40
Results: Detection of IgG and IgM Autoantibodies using Two-color Microarrays
9:29
Conclusion
