Name: Visualisatie en kwantificering van de Cell-vrij laag in van de rat cremasterspier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Leer de chirurgische voorbereiding van de rattencremasterspier voor visualisatie en kwantificering van de celvrije laag in vivo. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van microhemodynamisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Medical Research Council (NMRC)/Cooperative Basic Research Grant (CBRG)/0078/2014.

Deze studie is in overeenstemming met de National University of Singapore Institutional Animal Care en gebruik Comite (goedgekeurd protocol nr. R15-0225). 1. Chirurgische Voorbereiding van de Animal Model <ol><li> Vessel canuleringen <ol><li> Verdoven een mannelijke Sprague-Dawley ratten (6-7 weken oud) met een gewicht (203 ± 20) g met ketamine (37,5 mg / ml) en xylazine (5 mg / ml) cocktail met intraperitoneale (ip) injectie (2 ml / kg) . Raak de naald niet samen te vatten of te verwijderen uit de spuit na de injectie. </li><li> Zodra het dier is verdoofd (bevestigd door de teen knijpen), leg het op een verwarmingselement om zijn lichaamstemperatuur op 37 ° C te houden. Voorzichtig scheren het haar op de schouderbladen, anterior baarmoederhals, onderbuik, mediale achterbeen en scrotum sac. Voorzichtig weerhouden de benen met behulp van zelfklevend papier tapes. </li><li> Voer alle chirurgische procedures met behulp van microdissectie schaar en schuine pincet tijdens het bekijken door middel vaneen stereomicroscoop. Plaats alle scherpe chirurgische instrumenten op een lekke band-bestendig lade om de schade tijdens de operatie te voorkomen. </li><li> Schrobben alle operatieplaatsen 3 maal afwisselend met jodium en 70% alcohol voordat de incisie. Spoel alle catheters met 30 IU / ml heparine-zoutoplossing. </li><li> Wordt 1-1,5 cm middellijn incisie op de scapulae met een paar chirurgische schaar via rechter halsader. Scheid de fascia door stompe dissectie van de halsader bloot te leggen en canule met een polyethyleen buis (PE-50) gevuld met heparine-zoutoplossing met behulp van 5-0 zijden hechtingen. Infuseren aanvullende verdoving indien nodig (1/3 tot 1/2 van de initiële dosering, intraveneuze (iv)) in de loop van de operatie en experiment. </li><li> Voer tracheotomie om openheid van de luchtweg te handhaven. Maak een 1 - cm incisie 1.5 in de voorste cervicale gebied. Canule de luchtpijp met behulp van een polyethyleen buis (PE-205) met 2-0 zijde hechtingen aan de katheter vast te zetten. </li><li> Monitor bloeddrukdoor de canule in de femorale slagader. Maak een 1 - cm incisie 1.5 aan de linker mediale oppervlak van de achterpoot. Scheid de dij slagader door stompe dissectie. Canule van de dijbeenslagader met een polyethyleen buis (PE-10) gevuld met heparine-zoutoplossing met behulp van 5-0 zijden hechtingen. </li></ol></li><li> Cremaster Muscle Voorbereiding en Flow Visualisatie <ol><li> Plaats een 5-0 zijden hechtdraad door de top van de scrotum sac om het te verlengen. Maak een incisie langs het ventrale oppervlak van het scrotum sac. Breng regelmatig warme isotone oplossing (37 ° C, pH 7,4) aan de blootgestelde spier. </li><li> Verwijder omringende bindweefsel zorgvuldig en grondig met behulp van een wattenstaafje. </li><li> Plaats een 5-0 zijden hechtdraad door de top van de cremaster spier. Snijd de hechtdraad in twee stukken van gelijke lengte en een knoop aan elke kant. Snijd de spier tussen de twee knopen en rek het op een op maat gemaakte transparante plexiglas platform door zachtjes trekken van de hechtdraad. reparerenhet einde van de hechtdraad op het platform met blauwe tack. LET OP: Grondige verwijdering van de omliggende bindweefsel is van cruciaal belang bij het verkrijgen van een optimaal beeldcontrast. </li><li> Herhaal stap 1.2.3 tot 5-6 fixaties zijn gemaakt. Haal de cremaster spier uit de bijbal met behulp van hoge temperatuur cauterisatie. Superfuse warme isotone oplossing blootgestelde spieren om uitdroging van het weefsel te voorkomen. <ol><li> Omringen de cremaster spier met gevouwen stukken van gaas. Bedek de blootgestelde spier met een polyvinyl film. Het gaas stukken met de film vormen een ondiepe bassin te warm isotone oplossing voor de water-immersie microscoop doelstelling (Figuur 1A) vast te houden. </li></ol></li><li> Breng het dier op het dier fase van een intravitale microscoop (Figuur 1C). Sluit de arteriële canule een fysiologische data-acquisitie systeem voor continue druk controle (figuur 1E). </li><li> Handhaving van de spier temperature bij 35 ° C met een verwarmingselement onder zo&#39;n dier platform (Figuur 1B). Plaats een temperatuursensor naast de spier negatieve feedback aan de vermogensbesturing van het verwarmingselement (figuur 1D) verschaffen. </li><li> Laat het dier op het podium voor 15 min in evenwicht met de omgeving. </li><li> Visualiseer de bloedstroom onder een intravitale microscoop met een 40X water-immersie objectief en een lang werkende condensor. </li><li> Kies een onvertakte arteriole (&lt;60 pm) op een duidelijke beeldscherpte en het contrast tussen de RBC kern, CFL en vaatwanden teneinde de microscoop richten op de diametrale vlak van het bloedvat. Draai de camera gemonteerd op de microscoop op de vaatwand verticaal uitgelijnd. </li><li> Noteer de bloedstroom met een high-speed video camera met een framesnelheid van 3000 / sec gedurende 1 sec. Sla de opgenomen video als niet-gecomprimeerde 8-bits grijsschaal AVI formaat om de beeldkwaliteit te behouden. NOTITIE:<html> Een minimale Opnamesnelheid van 3000 frames / sec wordt aanbevolen dat de CFL meting ten minste eenmaal per RBC onder fysiologische stroomomstandigheden arteriolaire kan worden uitgevoerd. </li><li> Gebruik een blauw filter met grootste doorlating bij een golflengte van 394 nm en spectrale band- bij 310-510 nm het contrast tussen RBC en plasma verbeteren. OPMERKING: Zorg dat het lichtspectrum dat door het blauwe filter uit de microscopische lichtbron (100 W halogeen lamp) is van lage lichtintensiteit om mogelijke weefselschade te voorkomen. </li><li> Na afloop van het experiment inslapen de dieren met een overdosis natriumpentobarbital. </li></ol></li></ol> 2. Image Analysis <ol><li> Preprocessing voor de CFL breedte meting <ol><li> Open MATLAB en de &#39;CFL_pre.m&#39; bestand uit te voeren. (Deze en andere MATLAB bestanden zijn te vinden in deip &quot;&gt; Aanvullende MATLAB Archief.) </li><li> Klik op &#39;Open bestand&#39; om de video bestand te selecteren om te analyseren. </li><li> Stel de &#39;Rotation&#39; slider aan de vaatwanden verticaal uit te lijnen. LET OP: Gebruikers kunnen de meewerkende rasterlijnen voor het schip uitlijning weergeven door de &#39;Grid On&#39; radio-knop en past u het zoomniveau van het beeld door het schuiven van de schuifknop &#39;Zoom&#39;. </li><li> Klik op &#39;Bevestig bewerken&#39; knop om het schip uitlijning bevestigen. </li><li> Klik op de &#39;Set ROI te gewas&#39; om de regio van belang (ROI) te definiëren. De uitgelijnde beeld wordt weergegeven in een pop-up venster. Pas de rechthoekige doel op de afbeelding, en dubbelklik op om de ROI te bevestigen. Sla deze stap over als de uitsnede van het beeld is niet vereist. OPMERKING: Neem alleen een schip in het ROI op de breedte CFL uit het vat te analyseren. Klik op de &#39;Reset Image&#39; knop om het beeld te herstellen in zijn oorspronkelijke vorm, indien nodig. </li><li> Klik op de9; Extract &#39;knop om alle bewerkte video frames uit te pakken in opeenvolgende bit map afbeeldingen (8-bit grijswaarden&#39; Images bmp &quot;formaat). De onttrokken beelden zijn te vinden in de map met dezelfde naam als het geselecteerde videobestand. </li></ol></li><li> Meting van CFL breedte <ol><li> Open MATLAB en de &#39;CFL_measure.m&#39; bestand uit te voeren. </li><li> Klik op &#39;Map selecteren&#39; naar de map met de uitgepakte beelden te selecteren. </li><li> Klik op de map met de beelden en klik op &#39;Select Folder&#39;. De eerste beeldframe in de map zullen worden geladen en getoond in de &#39;grijswaardenafbeelding&#39; panel, samen met zijn grijze intensiteit histogram in panel de &#39;Image Histogram&#39;. </li><li> Selecteer de gewenste afbeelding frame uit de keuzelijst om de analyse, anders wordt de eerste beeldframe wordt geselecteerd uit te voeren. </li><li> Klik &#39;vaatwanden om de binnenste vaatwand identificeren in het beeld, die wordt bepaald op de plaats waar delichtintensiteit profiel piek doorvoer van donker naar licht over twee pixels. </li><li> Vink &#39;Median Filter&#39; om een ​​mediaan filter toepassen op de afbeelding om de &#39;peper en zout&#39; ruis te verminderen. </li><li> Controleer &#39;Auto Contrast&#39; om het beeld intensiteiten digitaal aan te passen aan het beeldcontrast te verbeteren. </li><li> Selecteer een drempelwaarde-algoritme in de keuzelijst die bepaalt automatisch een drempelwaarde waarde (τ), die de grijswaarden verdeelt in twee klassen - witte pixels met grijze niveaus boven τ (CFL), en zwarte pixels met grijze niveaus onder τ (RBC kern). LET OP: Als een alternatieve methode, gebruik dan de handmatige drempelwaarden als geen van geautomatiseerde-drempelwaarde-algoritme zorgt voor een passende afbeelding drempelwaarden. Klik op de &#39;Manual&#39; radio-knop en stel de schuifknop om de handleiding een drempel waarde te definiëren. </li><li> Om de ruimtelijke variatie van de CFL breedtes te meten, voert u de pixel resolutie in het vak &#39;Pixel Resolution&#39; (de resolutiemet deze experimentele opzet was 0,42 um / pixel). </li><li> Klik op &#39;Berekenen&#39; om de ruimtelijke variatie van de CFL breedtes te verkrijgen. Klik op &#39;Export CSV&#39; om de CFL breedte gegevens exporteren in een tabel formaat. </li><li> Om de temporele variatie van de CFL breedten bij een specifieke analyse lijn langs het schip te meten, klik op de &#39;Temporal Variation&#39; radio button en vul de frame rate informatie (het frame rate gebruikt in deze experimentele opstelling was 3000 frames / sec). </li><li> Voer het eerste frame en het laatste frame van de foto&#39;s voor de analyse in het &#39;Start Frame&#39; en &#39;Last Frame&#39; dozen, respectievelijk. </li><li> Selecteer de positie van de analyse lijn langs het schip door het schuiven van de &#39;Analyse Line&#39; schuifbalk. Controleer de positie van de analyse lijn, die wordt afgebeeld op zowel de &#39;grijswaarden imago&#39; en &#39;Binary imago&#39;. </li><li> Klik op &#39;Berekenen&#39; om de temporele variatie van de CFL breedtes te verkrijgen. Click &#39;Export CSV&#39; om de CFL breedte gegevens exporteren in een tabel formaat. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+variations+of+cell-free+layer+width+in+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).</li>
<li>Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+erythrocyte+aggregation+and+flow+rate+on+cell-free+layer+formation+in+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of erythrocyte aggregation and flow rate on cell-free layer formation in arterioles.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H1870-H1878 (2010).</li>
<li>Namgung, B., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+uneven+red+cell+influx+on+formation+of+cell-free+layer+in+small+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of uneven red cell influx on formation of cell-free layer in small venules.</a> Microvasc Res. 92, 19-24 (2014).</li>
<li>Goldsmith, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Microcirculatory+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Eugene+M.+Landis+Award+Lecture.+The+Microrheology+of+Human-Blood.+Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">The Microcirculatory Society.</a> Eugene M. Landis Award Lecture. The Microrheology of Human-Blood. Microvasc Res. 31 (2), 121-142 (1986).</li>
<li>Buerk, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+We+Model+Nitric+Oxide+Biotransport%3F+A+Survey+of+Mathematical+Models+for+a+Simple+Diatomic+Molecule+with+Surprisingly+Complex+Biological+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Can We Model Nitric Oxide Biotransport? A Survey of Mathematical Models for a Simple Diatomic Molecule with Surprisingly Complex Biological Activities.</a> Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 109-143 (2001).</li>
<li>Tateishi, N., Suzuki, Y., Soutani, M., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dynamics+of+erythrocytes+in+microvessels+of+isolated+rabbit+mesentery%3A+cell-free+layer+and+flow+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Flow dynamics of erythrocytes in microvessels of isolated rabbit mesentery: cell-free layer and flow resistance.</a> J Biomech. 27 (9), 1119-1125 (1994).</li>
<li>Ong, P. K., Cho, S., Namgung, B., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cell-free+layer+formation+on+NO%2FO2+bioavailability+in+small+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of cell-free layer formation on NO/O2 bioavailability in small arterioles.</a> Microvasc Res. 83 (2), 168-177 (2012).</li>
<li>Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+NO+bioavailability+by+temporal+variation+of+the+cell-free+layer+width+in+small+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Modulation of NO bioavailability by temporal variation of the cell-free layer width in small arterioles.</a> Ann Biomed Eng. 39 (3), 1012-1023 (2011).</li>
<li>Park, S. W., Intaglietta, M., Tartakovsky, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+stochastic+fluctuations+in+the+cell+free+layer+on+nitric+oxide+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Comput+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impact of stochastic fluctuations in the cell free layer on nitric oxide bioavailability.</a> Front Comput Neurosci. 9, 131(2015).</li>
<li>Ng, Y. C., Namgung, B., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+transient+model+for+prediction+of+arteriolar+NO%2FO2+modulation+by+spatiotemporal+variations+in+cell-free+layer+width%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional transient model for prediction of arteriolar NO/O2 modulation by spatiotemporal variations in cell-free layer width.</a> Microvasc Res. 97, 88-97 (2015).</li>
<li>Sriram, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+small+changes+in+hematocrit+on+nitric+oxide+transport+in+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Sign%22%5BJournal%5D)">The effect of small changes in hematocrit on nitric oxide transport in arterioles.</a> Antioxid Redox Sign. 14 (2), 175-185 (2011).</li>
<li>Hightower, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cardiovascular+regulation+by+the+blood%2Fendothelium+cell-free+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Integration of cardiovascular regulation by the blood/endothelium cell-free layer.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 458-470 (2011).</li>
<li>Ng, Y. C., Namgung, B., Leo, H. L., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+aggregation+may+promote+uneven+spatial+distribution+of+NO%2FO+in+the+downstream+vessel+of+arteriolar+bifurcations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte aggregation may promote uneven spatial distribution of NO/O in the downstream vessel of arteriolar bifurcations.</a> J Biomech. , (2015).</li>
<li>Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variations+of+the+cell-free+layer+width+may+enhance+NO+bioavailability+in+small+arterioles%3A+Effects+of+erythrocyte+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Temporal variations of the cell-free layer width may enhance NO bioavailability in small arterioles: Effects of erythrocyte aggregation.</a> Microvasc Res. 81 (3), 303-312 (2011).</li>
<li>Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+rheology+in+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte rheology in microcirculation.</a> Jpn J Physiol. 46 (1), Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8743714">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8743714</a> 1-14 (1996).</li>
<li>Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Evaluation+of+Flow+Dynamics+of+Erythrocytes+in+Microvessels+-+Influence+of+Erythrocyte+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels - Influence of Erythrocyte Aggregation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), Available from:
 <a target="_blank" href="http://ajpheart.physiology.org/content/268/5/H1959">http://ajpheart.physiology.org/content/268/5/H1959</a> H1959-H1965 (1995).</li>
<li>Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-based+method+for+determination+of+the+cell-free+layer+width+in+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">A computer-based method for determination of the cell-free layer width in microcirculation.</a> Microcirculation. 13 (3), 199-207 (2006).</li>
<li>Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Evaluation+of+Flow+Dynamics+of+Erythrocytes+in+Microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Influence+of+Erythrocyte+Aggregation.+Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels.</a> Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), H1959-H1965 (1995).</li>
<li>Namgung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+histogram-based+thresholding+methods+for+the+determination+of+cell-free+layer+width+in+small+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Meas%22%5BJournal%5D)">A comparative study of histogram-based thresholding methods for the determination of cell-free layer width in small blood vessels.</a> Physiol Meas. 31 (9), N61-N70 (2010).</li>
<li>Ong, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+method+for+cell-free+layer+width+determination+in+small+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Meas%22%5BJournal%5D)">An automated method for cell-free layer width determination in small arterioles.</a> Physiol Meas. 32 (3), N1-N12 (2011).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Syst.%2C+Man%2C+Cybern%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
<li>Prewitt, J. M., Mendelsohn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+cell+images%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The analysis of cell images.</a> Ann N Y Acad Sci. 128 (3), 1035-1053 (1966).</li>
<li>Ridler, T. W., Calvard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picture+Thresholding+Using+an+Iterative+Selection+Method%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Syst.%2C+Man%2C+Cybern%22%5BJournal%5D)">Picture Thresholding Using an Iterative Selection Method.</a> IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 8 (8), 630-632 (1978).</li>
<li>Shanbhag, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+Information+Measure+as+a+Means+of+Image+Thresholding%5BTitle%5D)+AND+%22Cvgip-Graph+Model+Im%22%5BJournal%5D)">Utilization of Information Measure as a Means of Image Thresholding.</a> Cvgip-Graph Model Im. 56 (5), 414-419 (1994).</li>
<li>Bishop, J. J., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+erythrocyte+aggregation+and+venous+network+geometry+on+red+blood+cell+axial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of erythrocyte aggregation and venous network geometry on red blood cell axial migration.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (2), H939-H950 (2001).</li>
<li>Yamaguchi, S., Yamakawa, T., Niimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+plasma+layer+in+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Cell-free plasma layer in cerebral microvessels.</a> Biorheology. 29 (2-3), 251-260 (1992).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

De meting van CFL breedte is essentieel voor een beter begrip van de hemodynamica in de microcirculatie. In het bijzonder is het meten van CFL breedten uitgevoerd in mesenteriale 6, spinotrapezius 24 en cerebrale 25 microcirculations. Conventionele meting van in vivo CFL breedte werd beperkt schattingen van handmatige inspectie van de opgenomen videoframes. De handmatige metingen nodig zijn de middeling van meerdere opeenvolgende video frames voor visueel identificeren van de gr...

In vivo dierstudies zijn instrumenteel voor de fundamentele wetenschap om de menselijke fysiologie en pathologie te begrijpen. In het bijzonder kunnen in vivo microhemodynamisch onderzoek de mogelijke beperking van microcirculatoire functies, gewijzigd door abnormale reologische omstandigheden van bloed, verduidelijken. Een aantal eerdere microhemodynamische studies1 hebben het cremaster spiermodel van de rat gebruikt om microvasculaire bloedstroom te visualiseren. De cremaster spier is een dunne laag van gestreept spierweefsel rond de testikels. Zo kan de bloedstroom in de spier worden gevisualiseerd met een trans-verlichtingsmicroscoop door middel van chirurgische blootstelling. Dit stelt ons in staat om de in vivo bloedstroombeelden te verkrijgen zonder het gebruik van enige fluorescentie of contrastmiddelen. Bovendien kan de volledige bloedperfusie van het spiernetwerk worden gecontroleerd door de stroomopwaartse bloedstroom te verminderen met occlusie van de abdominale aorta2. Dankzij deze voordelen is het cremaster spiermodel veel gebruikt om de vorming van de celvrije laag (CFL) in microvaten te onderzoeken1,3. 
De breedte van de CFL is een prominente hemodynamische parameter in de microcirculatie, die van groot belang is vanwege de belangrijke rollen bij het reguleren van microcirculatoire functies. De CFL wordt gevormd door de schuif-geïnduceerde transversale binnenwaartse migratie van rode bloedcellen (RBC's) naar het stromingscentrum4. Gevolglijk leidt deze migratie tot de uitputting van RBC's nabij de vaatwanden, wat uiteindelijk resulteert in een celvrije plasmalaag. Bijgevolg wordt de pariëtale CFL van nature een diffusiebarrier voor zuurstof (O2) levering vanuit de RBC-kern naar de weefsels, en voor het opruimen van stikstofmonoxide (NO) door de RBC's5,6. Bovendien kan de productie van NO ook worden gemoduleerd door de dynamische variaties van de CFL-breedte7,8. Daarom moeten de rollen van de CFL in zowel gastransport als de regulatie van homeostase in de microcirculatie volledig worden vastgesteld om de bloedstroom in de microcirculatie beter te begrijpen. Recente studies hebben zich gericht op het overbruggen van de hemodynamische en gastransportfuncties van de CFL in de microcirculatie9-12. Verder heeft een aparte reeks studies ook onderzocht hoe de pathologische verhoging in RBC-aggregatie de vorming van de CFL moduleert en het effect ervan op O2 en NO-beschikbaarheid in weefsels13,14. 
De rollen van de CFL worden belangrijker in de microcirculatie waar de relatieve grootte van de CFL-breedte tot de vaatdiameter prominent is. Dit vereist een effectieve aanpak voor het kwantificeren van de CFL in in vivo bloedstroom. Met name beeldverwerving en beeldanalyse zijn de twee belangrijkste componenten die de nauwkeurigheid van de CFL-breedtemeting bepalen. Succesvolle visualisatie van weefselbloedstroom moet worden voorafgegaan door een geschikte chirurgische voorbereiding van het diermodel. Bovendien is een goede beeldanalysetechniek nodig om de beperkingen van conventionele handmatige metingen, die meestal worden veroorzaakt door menselijke fouten, te overwinnen15,16. Met de vooruitgang in optische instrumentatie en rekenkracht voor digitale beeldverwerking, is het nu mogelijk om een nauwkeurigere en consistentere meting van de CFL-breedte te bereiken17-19. Niettemin, is de nauwkeurigheid van deze metingen, omdat ze op beeld gebaseerd zijn, uiteindelijk nog steeds afhankelijk van de kwaliteit van de beelden.
Daarom onderzoekt deze studie de factoren die de meting van de in vivo CFL-breedte beïnvloeden. We concentreerden ons met name op het demonstreren van de chirurgische voorbereiding en digitale beeldanalyse voor metingen van de CFL-breedte in arteriolen van de cremaster spier van de rat.

<table><tbody><tr><td>Intravital microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>High speed camera</td><td>Photron</td><td>1024PCI</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Blue filter</td><td>HOYA</td><td>B390</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Pressure sensor &amp; biopac system</td><td>Biopac system</td><td>TSD104A, MP100</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>Shimaden</td><td>SR 1</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Plasma Lyte A</td><td>Baxter</td><td>NDC:0338-0221</td><td>Warm in 37 &deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Saline 0.9%</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin (5,000 IU/ml)</td><td>LEO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE-10 polyethylene tube</td><td>Becton Dickinson</td><td>427400</td><td>.024" OD x.011" ID&nbsp;</td></tr><tr><td>PE-50 polyethene tube</td><td>Becton Dickinson</td><td>427411</td><td>.038" OD x.023" ID</td></tr><tr><td>PE-205 polyethene tube</td><td>Becton Dickinson</td><td>427446</td><td>.082" OD x.062" ID</td></tr><tr><td>2-0 non-absorbable silk suture</td><td>Deknatel</td><td>113-S</td><td></td></tr><tr><td>5-0 non-absorbable silk suture</td><td>Deknatel</td><td>106-S</td><td></td></tr><tr><td>Water circulating heating pad</td><td>Gaymar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp 205</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Sterile Cotton Gauze&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-468</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-tipped applicators</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14188</td><td>Surgical instrument</td></tr><tr><td>Micro Dissecting forceps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td>Surgical instrument</td></tr><tr><td>Iris forceps 1 x 2 teeth</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15917</td><td>Surgical instrument</td></tr><tr><td>Vessel cannulation forceps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500377</td><td>Surgical instrument</td></tr><tr><td>Micro scissor</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14177</td><td>Surgical instrument</td></tr><tr><td>Iris scissor</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14225</td><td>Surgical instrument</td></tr><tr><td>Vessel clip</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14120</td><td>Surgical instrument</td></tr><tr><td>Gemini cautery system</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>Surgical instrument</td></tr></tbody></table>

visualisatie en kwantificering van de cell-vrij laag in van de rat cremasterspier

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

De celvrije laag wordt gedefinieerd als de pariëtale plasmalaag in de microvasculaire stroom, die vrij is van rode bloedcellen. De meting van de in vivo breedte van de celvrije laag en zijn ruimtelijk-tijdelijke variaties kan een uitgebreid begrip van de hemodynamiek in de microcirculatie bieden. In deze studie gebruikten we een intravitale microscopisch systeem gekoppeld aan een high-speed videocamera om de breedtes van de celvrije laag in arteriolen in vivo te kwantificeren. De cremaster spier van Sprague-Dawley ratten werd chirurgisch geëxterioriseerd om de bloedstroom te visualiseren. Er werd ook een op maat gemaakt beeldverwerkingsscript ontwikkeld om de beeldverwerking en analyse van de breedte van de celvrije laag te automatiseren. Deze benadering maakt de kwantificering van ruimtelijk-tijdelijke variaties consistenter mogelijk dan eerdere handmatige metingen. De nauwkeurigheid van de meting is echter gedeeltelijk afhankelijk van het gebruik van een blauwe filter en de selectie van een geschikte drempelalgoritme. Specifiek hebben we het contrast en de kwaliteit van beelden geëvalueerd die zijn verkregen met en zonder het gebruik van een blauwe filter. Daarnaast vergeleken we vijf verschillende op histogrammen gebaseerde drempelalgoritmen (Otsu, minimum, intermode, iteratieve selectie en fuzzy entropische drempelbepaling) en illustreerden we de verschillen in hun bepaling van de breedte van de celvrije laag.

De visualisatie van de CFL in vivo is grotendeels afhankelijk van de chirurgische voorbereiding van het dier. Overmatig bloedverlies of uitgebreide operatie duur kan het dier te onderwerpen aan schokken en de doorbloeding aberraties. Onderhoud van weefseltemperatuur een verwarmingselement gebruikt als een maat platform tijdens de operatie en experiment is ook cruciaal voor het handhaven van de fysiologische omstandigheden van de rat. Door een 100 W halogeenlamp in het microscoopsysteem, werd geen waarneembare w...

Deze studie toont de chirurgische voorbereiding van de rat cremaster spier voor de visualisatie van de in vivo cel-vrije laag. Aanzienlijke factoren die de nauwkeurigheid van de meting van de breedte van de cel-vrije laag beïnvloeden, worden in deze studie besproken.

Visualisatie en kwantificering van de Cell-vrij laag in van de rat cremasterspier

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Het algemene doel van deze procedure is om de spatiotemporele variaties in de breedte van de in vivo celvrije laag te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van micro-hemodynamiek, om de rol van celfilie in de microcirculatie beter te begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat de breedte van de in vivo celfilie consistenter en gemakkelijker kan worden gekwantificeerd dan met eerdere handmatige meettechnieken, die zeer tijdrovend waren.Voordat u begint met het meten van de breedte van de celvrije laag, voert u het pre-MatLab-scriptbestand voor de celvrije laag uit. Klik vervolgens op 'open file' om het videobestand voor analyse te selecteren en pas de rotatieschuifregelaar aan om de wanden van het enkele vat verticaal uit te lijnen, waarbij u de zoomschuifregelaar gebruikt om indien nodig het zoomniveau aan te passen. Wanneer het vat in de juiste positie staat, klikt u op 'confirm editing' en vervolgens op 'set ROI to crop' om het interessegebied te definiëren.De uitgelijnde afbeelding wordt in een pop-upvenster weergegeven. Pas het rechthoekige doelgebied op de afbeelding naar behoefte aan en dubbelklik op het doelgebied om het regio van interesse te bevestigen. Klik vervolgens op Extract Images om alle bewerkte videoframes te extraheren naar opeenvolgende bitmap-afbeeldingen, die worden opgeslagen in de map met dezelfde naam als het geselecteerde videobestand.Om de breedte van de celvrije laag te meten, klikt u op Select Folder en selecteert u de map met afbeeldingen. Het eerste afbeeldingsframe verschijnt in het grijswaardenpaneel, samen met het bijbehorende grijswaarde-intensiteitshistogram in het histogrampaneel. Selecteer het gewenste afbeeldingsframe uit de lijst om de analyse uit te voeren en klik op Find Vessel Walls om de binnenwand van het vat in de afbeelding te identificeren, bepaald als de locatie waar de piek van het lichtintensiteitsprofiel over twee pixels overgaat van donker naar licht.Vink mediaanfilter aan om een mediaanfilter op de afbeelding toe te passen om zout-en-peperruis te verminderen. Vink automatisch contrast aan voor een digitale aanpassing van de beeldintensiteiten om het beeldcontrast te verbeteren. Selecteer vervolgens een drempelwaarde-algoritme in het keuzemenu om automatisch de drempelwaarde te bepalen die de grijswaarden verdeelt in twee klassen: witte pixels met grijswaarden boven de drempelwaarde en zwarte pixels met grijswaarden onder de drempelwaarde.Om de ruimtelijke variatie van de breedtes van de celvrije laag te meten, voert u de pixelresolutie in het vak voor pixelresolutie in. Klik vervolgens op Bereken om de ruimtelijke variatie van de breedtes van de celvrije laag te verkrijgen en klik op Export.csv om de gegevens van de breedte van de celvrije laag in een getabelleerd formaat te exporteren.Om de temporele variatie van de breedtes van de celvrije laag langs een specifieke analyselijn in het vat te meten, klikt u op Temporal Variation en voert u de informatie over de framerate in. Voer het eerste en het laatste frame van de beelden voor de analyse respectievelijk in de vakken start frame en last frame in. Gebruik de schuifregelaar van de analyselijn om de positie van de analyselijn langs het vat te selecteren en bevestig de positie van de analyselijn zoals geïllustreerd op zowel de grijswaarden- als de binaire beelden.Klik vervolgens op Calculate om de temporele variatie van de breedtes van de celvrije laag te verkrijgen en klik op Export.csv om de gegevens van de breedte van de celvrije laag in een getabelleerd formaat te exporteren. Hier wordt een typische stroom van rode bloedcellen door een onvertakte arterie in de m. cremaster van de rat getoond, waarbij de celvrije laag waargenomen kan worden tussen de RBC-kern en de binnenwand van het vat.Een goed contrast tussen deze componenten is essentieel om de nauwkeurigheid van de metingen van de breedte van de celvrije laag te waarborgen. De eerste fase van de beeldanalyse omvatte de detectie van de binnenwand van het vat. Door het lichtintensiteitsprofiel langs de analyselijn loodrecht op het vat vast te leggen, wordt de locatie benaderd op de piek die over twee pixels overgaat van donker naar licht.Vervolgens worden de grenzen van de RBC-kern gedetecteerd met behulp van het beelddrempelwaarde-algoritme, waarna de CFL-breedtes kunnen worden berekend. Omdat rode bloedcellen in de celvrije laag verschillende lichttransmissies hebben, kan het verschil in grijswaarden worden onderverdeeld in twee klassen. De identificatie van een nauwkeurige drempelwaarde tussen de twee pieken in het beeldhistogram kan echter worden beperkt door een matige beeldkwaliteit en contrast.Om het contrast tussen de rode bloedcellen en de celvrije laag te verbeteren, kan een blauw filter worden gebruikt. Dit is nog duidelijker in deze afbeeldingen, waar de grenzen van de kernen van de rode bloedcellen nauwkeuriger werden geïdentificeerd met een blauw filter. Het thresholding-algoritme kan de meting van de breedte van de celvrije laag eveneens beïnvloeden, zoals blijkt uit deze afbeeldingen waarin de verschillende thresholding-algoritmen leidden tot de identificatie van verschillende grenzen van de rode bloedcelkernen en daarmee tot verschillende breedtes van de celvrije laag.De meting van de breedte van de cellenvrije laag in vivo is zeer gevoelig voor de beeldkwaliteit. Voer de chirurgische ingreep daarom zorgvuldig uit en maak gebruik van een geschikte optische assistent om beelden van goede kwaliteit te verkrijgen. Bovendien is het essentieel om het juiste algoritme voor drempelwaarde-bepaling van beelden te selecteren om een nauwkeurige en consistente meting van de breedte van de cellenvrije laag te waarborgen.

visualization-quantification-cell-free-layer-arterioles-rat-cremaster

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een weefsel voorbereiding is beschreven voor visualisatie en experimentele manipulatie van de levende microcirculatie. In verdoofde mannelijke muizen, is de dunne, zeer goed doorbloede cremaster spier voorbereid intravitale microscopie tot microvasculaire netwerken, inclusief arteriolen, capillairen en venulen studie. Dit preparaat wordt gemakkelijk aangepast voor ratten en hamsters.

De muis Cremaster Muscle Voorbereiding voor intravitale Imaging van de microcirculatie

Het doel van dit artikel is om een ​​methode aan te tonen immunofluorescentie detectie van oestrogeen receptor-α (ERα) in ratten pial arteriële plakken met behulp van een digitale immunofluorescentie microscoop te optimaliseren.

Beeldvorming van Oestrogeen Receptor-α in Rat Pial arteriolen met behulp van een Digital Microscope Immunofluorescente

Digitale intravitale epifluorescentie microscopie van postcapillaire venulen in de cremasteric microcirculatie is een handige methode om inzicht te krijgen in leukocyten-endotheliale...

Real-time Digital Imaging van leukocyt-endotheliale Interactie in ischemie-reperfusie schade (IRI) van de Rat cremasterspier

We demonstreren a novel arteriële ligatie model in muizen spinotrapezius spier, inclusief een stap-voor-stap procedure en beschrijving van de vereiste instrumenten. We beschrijven de operatie en relevante uitkomstmaten met betrekking tot vasculaire netwerk remodeling en functionele vasodilatatie met intravitale en confocale microscopie.

Murine Spinotrapezius model om de invloed van arteriolaire Ligatie beoordelen op microvasculaire functie en Remodeling

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

Intravitale microscopie van de muis M. cremaster microcirculatie biedt een unieke en goed gestandaardiseerd in vivo model voor de analyse van perifere beenmerg stamcellen migratie.

Intravitale Microscopie van de microcirculatie in de Muis cremasterspier voor de Analyse van de perifere stamcelmigratie

Dit manuscript wordt beschreven in vitro videomicroscopie protocollen voor de beoordeling van de vasculaire functie in rat weerstand van de cerebrale bloedvaten. Het manuscript wordt ook beschreven technieken voor het evalueren van microvessel dichtheid met fluorescently geëtiketteerde lectine en weefsel perfusie met behulp van Laser Doppler flowmetrie.

Evaluatie van vasculaire controlemechanismen met behulp van videomicroscopie van geïsoleerde resistentie slagaders van ratten

Dit manuscript wordt een eenvoudig protocol voor de isolatie van de arteriolen uit het netvlies rat die kunnen worden gebruikt in elektrofysiologische, calcium beeldvorming en druk myography studies beschreven.

Isolatie van retinale arteriolen voor Ex Vivo cel fysiologie Studies

Hier laten we zien hoe je intravitale microscopie uitvoert op postcapillaire venules van de muiscremaster spier. Vaak toegepast op verschillende modellen van ontsteking en sepsis, met name die veroorzaakt door chemokines en cytokines, benadrukken we de relevantie ervan in de studie van muscolopathies waarbij overdreven gespierde leukocyten infiltratie.

Leukocyten infiltratie van Cremaster Spier in muizen beoordeeld door Intravital Microscopie

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de coronaire microcirculatie in levend murinehartweefsel te bestuderen door ex vivo monitoring van de arteriële perfusiedruk en -stroom die de druk handhaaft, evenals vasculaire boomcomponenten, waaronder de capillaire bedden en pericyten, omdat de septale slagader wordt ingeblikt en onder druk staat.

Dynamische meting en beeldvorming van haarvaten, slagaders en pericyten in muishart

Intensieve voorbereiding van intacte cerebrale endotheelbuizen van muizen uit cerebrale parenchymale arteriolen wordt geïllustreerd voor het bestuderen van cerebrale bloedstroomregulatie. Verder demonstreren we de experimentele sterke punten van dit endotheelstudiemodel voor fluorescentiebeeldvorming en elektrofysiologische meting van belangrijke cellulaire signaalroutes, inclusief veranderingen in intracellulaire [Ca2 +] en membraanpotentiaal.

Isolatie en functionele analyse van arteriolar endotheel van muishersenparenchym

Leer de chirurgische voorbereiding van de rattencremasterspier voor visualisatie en kwantificering van de celvrije laag in vivo. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van microhemodynamisch onderzoek.

Visualisatie en kwantificering van de Cell-vrij laag in van de rat cremasterspier

Meer video's verkennen