Het gebruik van Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) voor het bestuderen van genen en Promoters Betrokken bij Wood Vorming en secundaire Stem Development

Het algemene doel van geïnduceerde somatische sectoranalyse is het bieden van een techniek met een medium tot hoge doorvoer voor de functionele karakterisering van gen- en promotorkonstructen in secundair stamweefsel van bomen binnen relatief korte tijdsbestekken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over waar en wanneer deze worden tot expressie gebracht, evenals hun rol in biologisch belangrijke processen zoals houtvorming en secundaire stamontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een efficiënte, eenvoudige en relatief snelle procedure is die toepasbaar is op een breed scala aan boomsoorten.

Begin met het voorbereiden van een schone schroefnaaldbuis van 50 milliliter met 19 milliliter vers LB-medium van 28 graden Celsius, aangevuld met de juiste antibiotica voor bacteriële selectie. Voeg één milliliter A.tumefaciens-cultuur toe en controleer de optische dichtheid, of OD, bij 600 nanometer. Als de OD boven 0,1 ligt, dient men verder te verdunnen met warm LB. Plaats de A.tumefaciens-cultuur in een schuddende incubator totdat de OD 600 tussen 0,4 en 0,6 ligt.

Zodra dit is bereikt, worden de cellen 15 minuten gecentrifugeerd bij vier graden Celsius en 1.000 x g. Schenk de vloeistof uit de buis af en resuspendeer de celpellet onmiddellijk in één milliliter gekoeld MS-medium. Breng de suspensie over naar een schone microbuis van twee milliliter en bewaar deze op ijs tot gebruik.

Start het experiment in het voorjaar of vroege zomer en selecteer planten met een actief en snelgroeiend cambium. Dit is bevestigd wanneer het floëem gemakkelijk van het xylem kan worden gepeld. Identificeer een recht stuk stengel nabij de basis van de plant en verwijder alle bladeren of takken.

Snijd met een scherp scalpel een cambiale opening van één vierkante centimeter door twee parallelle incisies van 20 millimeter door het floëem te maken met een tussenruimte van vijf millimeter, gevolgd door een enkele horizontale snede die de twee verticale sneden aan de basale zijde bissecteert. Pel de floëemstrip naar boven toe weg om het ontwikkelende xyleemweefsel bloot te leggen. Voeg vervolgens met een pipet voldoende inoculatium toe om het oppervlak van het blootgestelde xyleem volledig te bevochtigen.

Plaats de floeemstrip onmiddellijk terug in de stengel en bind deze stevig vast met parafilm. Herhaal deze inoculatiestappen voor alle genen of promotors van belang, waarbij nieuwe cambiale vensters worden gemaakt op minimaal één centimeter boven of onder bestaande vensters en met een offset van 90 graden. Inoculeer daarnaast vensters met de positieve en negatieve controlevectoren op dezelfde stengel of stengels, op dezelfde wijze als de experimentele inoculaten.

Controleer periodiek de groei van de stengel en oogst het weefsel voor een bètaglucuronidase- of GUS-assay zodra een radiale groei van ten minste vijf millimeter is waargenomen. Om het testmateriaal te oogsten, exciseert u eerst het cambiale venster uit de stengel, waarbij al het weefsel dat geen deel uitmaakt van de nieuwe groei wordt verwijderd. Voor studies naar de morfologie van rijpe xyleem- en floëemcellen of -weefsels pelt u het floëem van het xyleem.

Als alternatief, voor onderzoeken waarbij de cambiale zone intact moet blijven of waarbij promoter-expressiepatronen moeten worden beoordeeld, snijdt u het cambiale venster transversaal met een scheermesje om schijven van 0,5 tot een millimeter dikte te creëren. Plaats de geoogste weefsels van het cambiale venster in individuele ronde bodembuisjes van 14 milliliter en spoel deze twee keer gedurende vijf minuten per keer met 0,1 molair fosfaatbuffer bij pH 7, waarbij u ervoor zorgt dat het weefsel volledig is ondergedompeld. Verwijder aan het einde van de tweede spoelbeurt zorgvuldig alle overtollige oplossing.

Voeg vervolgens vijf milliliter GUS-reagens toe aan elke buis. Als dit het weefselmonster niet volledig bedekt, voeg dan extra reagens toe. Incubeer de buizen tien minuten bij 55 °C in het donker.

Incubeer de buisjes vervolgens nog 12 tot 16 uur op een schudapparaat bij 37 °C in het donker onder milde agitatie. Neem na het uitnemen uit de incubator een willekeurige deelset van de buisjes en controleer de pH van het GUS-reagens met lakmuspapier met een pH-bereik van nul tot zeven. Als een van deze buisjes een pH lager dan zes heeft, label deze dan en controleer de resterende buisjes.

Label en sluit alle buisjes uit met een pH lager dan zes. Giet het GUS-reagens uit de buisjes en vervang dit door voldoende 70 procent ethanol om het weefsel te bedekken. Bewaar de monsters bij vier graden Celsius tot ze nodig zijn.

Verwijder met een schoon pincet al het cambiale vensterris weefsel uit een monsterbuis en plaats dit op een klein dienblad of in een petrischaal voor microscopische visualisatie. Plaats het monster onder de lens van een dissectiemicroscoop bij een vergroting tussen 1X en 4X en identificeer en tel het aantal cellen of weefsels dat een helderblauwe kleuring vertoont. In gevallen waarin het floëem is verwijderd, telt u het aantal sectoren in het cambiale weefsel dat zich op het oppervlak van het ontwikkelende xyleem bevindt.

Tel voor monsters die in schijfjes zijn gesneden het aantal sectoren dat in de verschillende cel- of weefseltypen is gevonden. Zorg ervoor dat beide zijden van de schijf worden bekeken en dat sectoren die over twee schijfjes verdeeld zijn, met elkaar worden gematcht om te voorkomen dat aantallen worden overschat. Plaats alleen het weefsel dat sectoren bevat terug in de buis met 70 procent ethanol en bewaar dit tot het nodig is.

Herhaal de analyse voor alle overige geoogste cambiale vensters, inclusief de positieve en negatieve controles. Om een nauwkeurige identificatie en classificatie van sectoren te vergemakkelijken, raden wij aan u vertrouwd te maken met de anatomie en ontwikkeling van de secundaire stengel, inclusief de reacties van de stengel op verwonding. Deze figuur toont verschillende succesvolle transformaties, hier zichtbaar als blauwgekleurde regio's.

Een voorbeeld van een venster met een floëemschil toont meerdere getransformeerde sectoren en schijven geoogst van twee boomsoorten vertonen sectoren van transformatie en daaropvolgende radiale groei. Transformatie in een reeks weefseltypen kan ook worden waargenomen. Hier kunnen stamsectoren worden gezien in het periderm, het floëem, het wondparenchym en verschillende andere weefselregio's van de witte populier.

Deze afbeelding toont de resultaten van genpromotor-expressie in cambiale derivaten. In dit voorbeeld zien we het aandeel kleuring in elk weefseltype in een proef met een reeks CesA-promotoren van eucalyptus grandis, getransformeerd in stengels van eucalyptushybriden. Expressie in het floëem, het ontwikkelende en het ontwikkelde xyleem wordt weergegeven als een percentage.

Het gemiddelde aantal transformatiegebeurtenissen per centimeter geïnoculeerd cambium kan ook worden berekend voor elke promotor of elk gen van belang. Deze tabel toont de gegevens voor typische sectoren die zijn geïdentificeerd in eucalyptus- en populierenproefpersonen die zijn getransformeerd met een positieve controle of een promotor van belang, geanalyseerd met de disc harvesting-methode. Eenmaal beheerst, kan deze techniek een snelle, efficiënte en breed toepasbare methode bieden voor het ontleden van de complexe aard van cambiale differentiatie met vorming in de secundaire stamanatomie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u planten en bacteriën voorbereidt, hoe u transformeert, kweekt en oogst stammen, en hoe u transgene weefsels identificeert en classificeert voor fenotypische beoordeling.