Methoden voor de isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van de sinusknoop Myocytes van volwassen muizen
23 oktober 2016
Methoden worden gedemonstreerd voor de isolatie van de sinusknoop myocyten (SAM) van volwassen muizen voor patch clamp elektrofysiologie of imaging studies. Geïsoleerde cellen kunnen direct worden gebruikt of kunnen in kweek worden gehandhaafd expressie van eiwitten van belang, zoals genetisch gecodeerde reporters mogelijk.
Het algemene doel van deze procedure is om spontaan actieve sinoatriale knoopmyocyten van muizen te isoleren voor elektrofysiologische of beeldvormingsexperimenten op korte of middellange termijn. Geïsoleerde sinoatriale knoopmyocyten zijn belangrijk voor de studie van hartritmemechanismen, in het bijzonder de studie van specifieke ionenstromen of timing van intracellulaire calciumafgifte. Maar relatief weinig laboratoria gebruiken geïsoleerde sinoatriale myocyten van muizen, deels omdat het erg moeilijk is om de procedure alleen van geschreven methoden te leren.
Nadat alle benodigde oplossingen voor de isolatie zijn voorbereid, verwijdert u de vacht van de borst van het dier met een schaar. Snijd vervolgens het ribbenkastje door om de borstholte bloot te leggen met behulp van externe weefseltangen en dissectiescharen. Spoel de borstholte met twee milliliter verwarmde volledige Tyrode's met heparine.
Onder een dissectief microscoop, verwijder zorgvuldig de longen en thymus met behulp van interne schaar en dissectietang. Terwijl u voorzichtig het apex van het hart vasthoudt, snijd voorzichtig de inferieure vena cava en de aorta om het hart uit de borstholte te verwijderen. Breng vervolgens het hart over naar een van de siliconen dissectiekommen en spoel het af met twee tot vier milliliter verwarmde heparine volledige Tyrode's.
Orienteer het hart zodanig dat de achterste vaten zichtbaar zijn en omhoog kijken. Vervolgens immobiliseer het hart door het door het apex in de siliconen dissectieschaal te spelden. Lokaliseer daarna de groef tussen de ventrikels en de atria.
Gebruik de interne dissectiescharen om een incisie te maken bij de groef terwijl u deze dicht bij de ventrikels houdt. Spoel de groef en de incisie met aanvullende verwarmde heparine volledige Tyrode's om een duidelijk zicht op de atria en de kleppen mogelijk te maken. Vervolgens gaat u verder met snijden langs de groef om de atria te scheiden van de ventrikels.
Vervolgens brengt u het atriaal weefsel over naar de tweede siliconen dissectieschaal en spoelt u het af met drie milliliter verwarmde heparine volledige Tyrode's. Terwijl u de preparatie voorzichtig strekt, speldt u het weefsel door de inferieure vena cava. Draai vervolgens het weefsel om zodat het rechter atrium van het dier nu aan de linkerkant van de experimentator ligt en het linker atrium aan de rechterkant van de experimentator.
Het is erg belangrijk om oriëntatie te verkrijgen en te herkennen om het juiste weefsel te isoleren. Bevestig het weefsel vervolgens door het superieure vena cava, vervolgens de rechter en linker atriale aanhangsels. Verwijder eventueel resterend vet of ander weefsel om een duidelijk zicht op de voorbereiding mogelijk te maken.
Vervolgens opent u de voorste wand van de atria door de venae cavae door te snijden. Draai de schaal indien nodig om zowel de superieure als inferieure venae cavae te disseceren. Verplaats de spelden indien nodig om het interatriale septum te visualiseren.
Snijd vervolgens langs het interatriale septum om het linker atrium te verwijderen. Bevestig de voorbereiding opnieuw, strek het voorzichtig uit en verwijder het vet achter de sinoatriale knoop. Verwijder vervolgens het rechter atriale aanhangsel en bevrijd de sinoatriale knoop door te snijden langs de crista terminalis, die verschijnt als een donker oranje streep die het atriale aanhangsel begrenst.
Bevestig of ontspoel het nodale weefsel en snijd het lateraal om drie even grote stroken te produceren. Gebruik in deze procedure de smalle vuurgeslepen pipet om drie stroken sinoatriale knoopweefsel over te brengen naar de eerste van de drie kleine ronde bodembuizen met 2,5 milliliter lage calciummagnesium Tyrode's en incubeer gedurende vijf minuten. Na vijf minuten brengt u de weefselstroken over naar de tweede kleine ronde bodembuis met 2,5 milliliter lage calciummagnesium Tyrode's.
Was de weefselstroken door voorzichtig te schudden in de buis of door voorzichtig te pipetteren met de smalle pipet. Draai de buis niet om. Breng vervolgens de weefselstroken over naar de derde kleine ronde bodembuis met 2,5 milliliter lage calciummagnesium Tyrode's en herhaal de wasstap.
Breng vervolgens de stroken over naar de grote ronde bodembuis met 2,5 milliliter lage calciummagnesium Tyrode's met enzymen. Meng elke vijf minuten door voorzichtig te schudden in de buis. Na enzymatische vertering, gebruik een smalle vuurgeslepen pipet om de weefselstroken voorzichtig over te brengen naar de eerste van de drie kleine ronde bodembuizen met aangepaste KB-oplossing.
Breng vervolgens de stroken door de tweede en derde kleine ronde bodembuizen om het weefsel te wassen voordat het wordt overgebracht naar de grote ronde bodembuis met KB-oplossing. Gebruik de grotere vuurgeslepen pipet om de cellen in de grote ronde bodembuis te dissociëren door constant tritureren, waarbij u ervoor zorgt dat de dissociatiebuis ondergedompeld blijft in het 35 graden Celsius waterbad en dat u geen luchtbellen in de oplossing introduceert. We hebben gevonden dat een krachtige uitdrijving van de oplossing met een frequentie van ongeveer één per seconde of één Hertz het beste werkt.
Voeg nu 75 microliter natriumchloride calciumchloride aanpassingsoplossing toe aan de weefsels. Schud voorzichtig om te mengen en incubeer ze gedurende vijf minuten. Blijf calcium toevoegen in incrementen zoals beschreven in het geschreven protocol.
Na calcium heraanpassing, verzamel de sinoatriale myocyten door ze ongeveer 10 minuten te laten bezinken of door centrifugatie bij 2.000 keer g gedurende drie minuten. Voor acuut geïsoleerde cellen, verwijder en gooi voorzichtig ongeveer vijf milliliter van het supernatant weg met behulp van een transferpipet. Bewaar vervolgens de cellen bij kamertemperatuur tot maximaal acht uur voor patch clamp experimenten.
Vervolgens kunnen functionele beoordelingen van de geïsoleerde sinoatriale myocyten worden gedaan met behulp van patch clamp opnames voor spontane actiepotentialen en membraanstromen. Spontaan actieve sinoatriale myocyten kunnen maximaal zes dagen in cultuur worden gehouden. De gekweekte cellen behouden een algehele morfologie die erg lijkt op die van de acuut geïsoleerde sino
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert methoden voor het isoleren van sinoatriale knoopmyocyten (SAMs) uit volwassen muizen, die essentieel zijn voor elektrofysiologische en imagingstudies. De geïsoleerde cellen kunnen direct worden gebruikt of worden gekweekt om eiwitten van belang tot expressie te brengen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Cardiale fysiologie
- Elektrofysiologie
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Myocyten van de sinoatriale knoop zijn essentieel voor het bestuderen van cardiale pacemakermechanismen.
- Inzicht in ionenstromen en de timing van de intracellulaire calciumvrijgave is cruciaal.
- Isolatietechnieken zijn vaak lastig aan te leren op basis van enkel geschreven methoden.
- Een succesvolle isolatie maakt geavanceerde experimentele studies mogelijk.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het isoleren van SAMs uit volwassen muizen.
- Om onderzoek naar cardiale pacemakereigenschappen en ionstroomdynamiek te faciliteren.
- Om de toegankelijkheid van deze technieken voor onderzoekers te vergroten.
Gebruikte methoden
- Bereiding van de oplossingen voor isolatie.
- Verwijderen van de vacht van de borst van het dier.
- Doorsnijden van de ribbenkast om toegang te krijgen tot de borstholte.
- Spoelen van de borstholte met verwarmde complete Tyrode-oplossing.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van spontaan actieve sinusknoopmyocyten.
- Geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor experimenten op korte of middellange termijn.
- Verbeterd begrip van de mechanismen van de cardiale pacemakervorming.
- Potentieel voor verdere studies naar ionstromen en calciumdynamiek.
Conclusies
- De beschreven methoden maken een effectieve isolatie van SAMs mogelijk.
- Deze technieken kunnen de reikwijdte van cardiaal onderzoek verbreden.
- Een verbeterde toegankelijkheid tot deze methoden kan het gebruik ervan in laboratoria vergroten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Betrouwbare isolatie en cultuur van sinoatriale knoopmyocyten (SAMs) van volwassen muizen maakt directe analyse van cardiale pacemakermechanismen op cellulair niveau mogelijk. Deze mogelijkheid ondersteunt mechanische risicoreductie en doelwitvalidatie voor ionkanaalmodulatoren en therapeutica voor het hartritme. De methode verhoogt het voorspellend vermogen in vroege ontdekkingsfasen en preklinische onderzoekslijnen voor cardiale studies.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt functionele validatie van targets voor de hartpacemaker mogelijk via directe elektrofysiologische beoordeling.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de effecten van specifieke ionstromen en calciumcycli te isoleren.
- Faciliteert hypothese-gestuurde studies naar de moleculaire basis van hartritmestoornissen.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerd primair cellsysteem voor kwantitatieve patchclamp- en imaging-assays.
- Maakt reproduceerbare meting van spontane actiepotentialen en membraanstromen mogelijk.
- Ondersteunt assay-standaardisatie voor compound-screening gericht op cardiale pacemaking.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Maakt ziekterelateerde modellering van de functie van de hartpacemaker in vitro mogelijk.
- Maakt continuïteit mogelijk van moleculaire ontdekking naar preklinische validatie van cardiale targets.
- Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers door directe meting van elektrofysiologische output.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode positioneert de isolatie en kweek van SAM als een fundamentele stap die de brug slaat tussen vroege ontdekking, doelwitvalidatie en preklinisch cardiaal onderzoek.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests over pacemakermechanismen en ionkanaalfuncties.
- Screening: Levert assay-klare primaire cellen voor reproduceerbare elektrofysiologische en imaging-metingen.
- Analytics: Maakt kwantitatieve vergelijking van actiepotentiaalparameters en stroomamplitudes over verschillende experimentele condities mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Biedt een platform voor het evalueren van genmanipulatie en eiwitexpressie die relevant zijn voor hartritmestoornissen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare workflow voor de isolatie van hartcellen die toepasbaar is op meerdere onderzoeksprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de validatie van cardiale targets en mechanistische studies.
- Operationele waarde: Standaardiseert isolatie- en kweekprotocollen voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming voor portfolio's voor de ontdekking van cardiale geneesmiddelen.
- Impact op portfolio: Maakt een risico-gecorrigeerde prioritering van therapeutische kandidaten voor het hartritme mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in cardiale microdissectie en enzymatische weefseldissociatie.
- Vereist toegang tot elektrofysiologische en beeldvormende instrumentatie voor functionele karakterisering.
- Noodzaakt een strikte standaardisatie van isolatie- en kweekcondities tussen teams.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende muizenstammen of cardiale ziekte-modellen.
- De opbrengst en celviabiliteit zijn gevoelig voor procedurele optimalisatie en weefseloriëntatie.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Sinoatrial Node Isolation
4:25
Sinoatrial Node Digestion and Sinoatrial Node Myocyte Dissociation
6:29
Sinoatrial Node Calcium Re-adaptation
7:36
Results: Electrophysiological Characterization of Cultured Sinoatrial Myocytes
8:27
Conclusion
