Name: Adenofection: Een methode voor het bestuderen van de rol van de Molecular Begeleiders in Cellular Morfodynamica door uitputting-Rescue Experimenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Leer adenofectie voor uitputting-rescue-experimenten die cellulaire integriteit en proteïne-homeostase behouden. Deze methode analyseert proteïnefuncties op enkelcellig niveau in processen zoals mitose en myogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institutes of Health Research (subsidie nr. 7077), en door de Bellini Foundation en Roby Fondazione.

<ol><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+Right+Tool+for+the+Job%3A+RNAi%2C+TALEN%2C+or+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).</li>
<li>Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+IL-8+expression+following+adenovirus+infection+is+mediated+by+c-Src+activation+in+human+corneal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts.</a> J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).</li>
<li>Yousuf, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+associated+adenovirus+entry+into+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells.</a> PLoS One. 8 (10), e77462(2013).</li>
<li>Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+regulates+epithelial+cell+junction+stability+through+control+of+E-cadherin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking.</a> Sci Rep. 3, 2889(2013).</li>
<li>Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HspB8+chaperone+activity+toward+poly%28Q%29-containing+proteins+depends+on+its+association+with+Bag3%2C+a+stimulator+of+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy.</a> J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).</li>
<li>Fuchs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+key+structural+motifs+involved+in+HspB8%2FHspB6-Bag3+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction.</a> Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).</li>
<li>Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAG3%3A+a+multifaceted+protein+that+regulates+major+cell+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways.</a> Cell Death Dis. 2, e141(2011).</li>
<li>Guilbert, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuilbert%2C+SM+%22The+Big+Book+of+Small+Heat+Shock+Proteins%22">The Big Book of Small Heat Shock Proteins</a>. Tanguay, R. M., Hightower, L. E. , Springer International Publishing AG. 435-456 (2015).</li>
<li>Fasbender, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexes+of+adenovirus+with+polycationic+polymers+and+cationic+lipids+increase+the+efficiency+of+gene+transfer+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).</li>
<li>Toyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+polymer+and+lipids+enhance+adenovirus-mediated+gene+transfer+to+rabbit+carotid+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery.</a> Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).</li>
<li>Fasbender, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+adenovirus+in+calcium+phosphate+precipitates+enhances+gene+transfer+to+airway+epithelia+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo.</a> J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).</li>
<li>Fuchs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Role+for+the+Chaperone+Complex+BAG3-HSPB8+in+Actin+Dynamics%2C+Spindle+Orientation+and+Proper+Chromosome+Segregation+during+Mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis.</a> PLoS Genetics. 11 (10), e1005582(2015).</li>
<li>Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+adenovirus+type+2+early+region+4+ORF4+cytoplasmic+death+function+by+direct+binding+to+Src+kinase+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain.</a> J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Takahashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+Akt+signaling+regulates+blood+vessel+recruitment+during+myofiber+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth.</a> Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).</li>
<li>Murray, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-apoptotic+role+for+caspase-9+in+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).</li>
<li>Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Wnt+Signaling+with+BMP%2FSmad+Signaling+during+the+Transition+from+Cell+Proliferation+to+Myogenic+Differentiation+in+Mouse+Myoblast-Derived+Cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells).</a> Int J Cell Biol. 2013, 616294(2013).</li>
<li>Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+in+mammalian+myoblast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion.</a> Sci Signal. 6 (272), re2(2013).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een werkwijze waarmee depletie-rescue experimenten uit te voeren, die van toepassing zijn functionele analyses van celbiologische processen die bijzonder gevoelig zijn voor overexpressie van eiwitten die de stoichiometrie en dynamiek van eiwitcomplexen en macromoleculaire structuren is. Mitotische celdeling is een extreem voorbeeld van fijn afgestemde cel morfodynamiek de meest dramatische en samenhangende verandering in de totale structuur van een cel omvat. Adenofection gebruikt in combinatie met c...

Functionele inactivatie van genexpressie in zoogdiercellen is de gouden standaard eiwitfuncties ontleden. Nieuw ontwikkelde technologieën genoom bewerking gebaseerd op het gebruik van plaats-specifieke nucleasen zoals zinkvinger nucleasen en geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom repeats (CRISPR) / CAS9 nu toe het maken van cellijnen met gerichte gen-deletie en mutatie 1,2. Deze nieuwe aanpak moet een revolutie op de manier waarop we het bestuderen van de functies van eiwitten en ons begrip van de genetica van ziekten bij de mens. In sommige gevallen echter, langdurige of volledige gen knockout is niet wenselijk en kan secundaire cel compensatiemechanismen veroorzaken. Het genereren van genetisch gemodificeerde cellijnen kunnen ook beperkt bij de behandeling van primaire celculturen met beperkte vermeerderingsvermogen of wanneer screening van een groot aantal mutaties in verschillende celtypen wordt gevraagd. Dit is vaak nodig voor het bepalen van de afhankelijkheid van een cel biological proces op structurele vereisten van een eiwit. Daartoe reversibele knockdown door RNA interferentie die voorbijgaande depletie-rescue experimenten in verschillende cellulaire achtergronden maakt nog steeds een eenvoudige en krachtige aanpak uitvoeren structuur-functie analyse van een eiwit van belang 3. Echter, een belangrijk nadeel van deze aanpak is de moeilijkheid om efficiënt silencing bereiken en het eiwit van belang of varianten op bijna fysiologische niveaus opnieuw in een meerderheid van de celpopulatie. Dit is belangrijk om uitgebreide studies die proberen om functionele effecten waargenomen op het niveau van enkelvoudige cellen (hypomorfe fenotype) met die bij cel-populatie gebaseerde testen, bijvoorbeeld op eiwit-eiwitinteracties correleren schakelen. Transfectie met behulp van klassieke methoden, kan men nauwelijks bereiken homogeen en lage expressie van exogene eiwitten in een grote populatie van cellen. Transductie van cellen met recombinante virussenzoals adenovirussen maakt vaak meer genormaliseerde expressie van exogene eiwitten. Toch is adenovirus opname beperkt door de CAR receptor, dat afwezig is in niet-humane cellen of slechts zwak tot expressie gebracht in bepaalde humane cellen. Bovendien is de cellulaire binnenkomst van adenovirussen activeert signaalroutes dat regelen cel vorm en adhesie 4-6. Dit is uiteraard niet wenselijk bij het bestuderen van regulerende mechanismen van de cel morfodynamiek. We werden geconfronteerd met dit problematisch wanneer we functionele analyses van een chaperonne complex, bag3-HSPB8 ondernam, in celdeling en actine dynamiek. Pionierswerk had een rol voor deze chaperone complex in proteïne kwaliteitscontrole en autofagie beschreven tijdens stress 7,8. De meeste van deze studies echter gebruikt eiwitoverexpressie, aannemende dat de chaperones normaal opgereguleerd tijdens stress. Dit liet de vraag of bag3 hierbij in complex met HSPB8, kan bijdragen tot de normale werking van delende cellen tot expressie these chaperones zoals vele typen kankercellen 9. In het bijzonder de vraag of de chaperonne complex draagt ​​bij aan de herinrichting van actine gebaseerde structuren die mitotische progressie was van groot belang te controleren, gezien de opkomende verbindingen tussen hspB chaperones en cytoskelet dynamiek 10. Om dit probleem aan te pakken, waren we op zoek naar een efficiënte methode voor het depletie-rescue experimenten die niet zou verstoren mitotische progressie of cellulaire morfologie, en welk eiwit homeostase zou behouden secundaire verstoring van de dynamiek van macromoleculaire complexen te voorkomen dat het reguleren van de cel-vormveranderingen ontwikkelen . Dus idealiter depletie-add-back van het betreffende gen gelijktijdig worden uitgevoerd. Het gebruik van complexen van adenovirus met een kationisch polymeer of lipiden is beschreven genoverdracht in vitro en in vivo 11,12 bevorderen. Bijvoorbeeld, calciumfosfaat (CAPI) blijkt een precipitaat vormen metadenovirus dat virus binden-entry via een CAR-onafhankelijke route 13 te verbeteren. Inderdaad, vonden we dat het combineren van adenovirus-gebaseerde cel transductie en transfectie met kationische verbindingen van de efficiëntie van de uitputting-rescue experimenten zou kunnen vergroten. Dit liet ons toe om de hoeveelheid virus te verlagen 3- tot 20-voudige, afhankelijk van de cellijn en het gen van belang, en van de toevoeging venster om de expressie van exogene eiwitten verstellen nabij endogene niveaus in de meerderheid van een cel bevolking van belang met een minimale impact op cellulaire morfologie. Onder dergelijke omstandigheden, kunnen we ook bereiken een hoog rendement knockdown van endogene eiwit expressie (&gt; 75%). We beschrijven hierbij de werkwijze stapsgewijs en bewijzen dat eiwit homeostase niet significant verstoord gemeten met de onveranderde niveaus van stress geïnduceerde chaperones van de hitteshockproteïne familie, waardoor de werkwijze geschikt voor functionele analyse van de fysiologische role van moleculaire chaperones door time-lapse video microscopie. Het protocol vatbaar is voor cel synchronisatieprocedures en het gebruik van commercieel verkrijgbare baculovirus voor co-expressie van lage niveaus van fluorescente markers, met minimale invloed op de normale actine gebaseerde en spindel dynamiek tijdens mitotische progressie. We de veelzijdigheid van de werkwijze die toepasbaar is muis C2C12 cellen, &quot;moeilijk te transduceren&quot; zonder significante invloed op myoblast differentiatie tot myotubes in vitro tonen verder.

<table><tbody><tr><td>C2C12 Muis Myoblasten</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Adenoviraal aangepast ontwerp</td><td>Welgen</td><td>Aangepast ontwerp</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10582</td><td></td></tr><tr><td>CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10614</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's aangepast Eagle-medium (DMEM), Hoge glucose</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Schaaltjes met glazen bodem, 35 mm</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-20-C Case</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-RFP-H2B</td><td>Vriendelijk geschonken door Dr. Sabine Elowe, Québec, Canada</td><td></td><td>Klebig C et al. 2009</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Paardenserum, Nieuw-Zeeland</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine® RNAiMAX Transfectie Reagens</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Minimaal Essentieel Medium (MEM) Alpha</td><td>Wisent</td><td>310-101-CL</td><td></td></tr><tr><td>Minimaal Essentieel Medium (MEM) Alpha zonder Desoxyribonucleosiden/Ribonucleosiden</td><td>Thermo Fisher</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>Minimaal Essentieel Medium (MEM) Alpha zonder Fenol Rood</td><td>Thermo Fisher</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Biobasic</td><td>S0404</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>rAVCMV-LifeAct-TagGFP2</td><td>IBIDI</td><td>60121</td><td></td></tr><tr><td>siRNA duplexen</td><td>Dharmacon</td><td>Aangepast ontwerp</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine 2,5%</td><td>Thermo Fisher</td><td>15090-046</td><td></td></tr></tbody></table>

adenofection: een methode voor het bestuderen van de rol van de molecular begeleiders in cellular morfodynamica door uitputting-rescue experimenten

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Cellulaire processen zoals celdeling en celdifferentiatie worden beheerst door veranderingen in cel vorm die grotendeels afhankelijk zijn van een goede herinrichting van de cel cytoskelet structuren. Het betreft de montage-demontage van hogere orde macromoleculaire structuren op een gegeven tijdstip en locatie, een proces dat bijzonder gevoelig is voor storingen veroorzaakt door overexpressie van eiwitten. Methoden die eiwit homeostase te behouden en te handhaven die vlak bij normale celmorfologie zeer gewenst om de functionele bijdrage van een eiwit van belang in een breed scala van cellulaire processen bepalen. Voorbijgaande depletie-rescue experimenten gebaseerd op RNA interferentie zijn krachtige benaderingen van eiwit functies en structurele vereisten te analyseren. Echter, herinvoering van het doelwit eiwit met minimale afwijking van zijn fysiologische niveau is een echte uitdaging. Hier beschrijven we een werkwijze genoemd adenofection die werd ontwikkeld om de rol van moleculaire chaperonnes een studied partners bij het normale gebruik van delende cellen en de relatie met actine remodeling. HeLa cellen werden ontdaan van bag3 met siRNA duplexen gericht op de regio 3&#39;UTR. GFP-gelabeld eiwitten bag3 gelijktijdig opnieuw in&gt; 75% van de cellen onder toepassing van recombinante adenovirussen gekoppeld transfectie reagentia. Adenofection nodig om bag3-GFP eiwitten op nabij fysiologische niveaus in HeLa-cellen ontdaan van bag3 drukken, in afwezigheid van een stressrespons. Er werd geen effect waargenomen op de niveaus van endogene heat shock eiwitten chaperones, de belangrijkste stress induceerbare regulatoren van eiwit homeostase. Verder kan door toevoeging baculovirussen de expressie van fluorescente merkers bij de cel transductie transfectie konden ontleden mitotische celdynamiek door time-lapse microscopische analyses met minimale verstoring van de normale progressie van de mitose. Adenofection ook voor moeilijk te infecteren muizencellen, en geschikt voor functionele analyse van myoblasten diffdifferentiatie in myotubes. Aldus adenofection een veelzijdige werkwijze te voeren structuur-functie analyse van eiwitten betrokken bij gevoelige biologische processen die berusten op hogere orde cytoskelet dynamiek.

Transfectie van bag3-GFP plasmide DNA met kationische lipiden geassocieerd met heterogene expressie in HeLa-cellen, sommige cellen geeft nauwelijks detecteerbare niveaus van het eiwit en andere dragende hoge bag3 niveaus (Figuur 2A). In deze cellen, eiwitverlies homeostase werd bewezen door de accumulatie van bag3-GFP in perinucleaire aggregaten (Figuur 2A, pijlen). In tegenstelling cel transductie met adenovirussen met bag3-GFP vertoonden homogener lage...

We beschrijven een methode voor depletie-reddingsexperimenten die de cellulaire integriteit en eiwithomeostase behoudt. Adenofectie maakt functionele analyses van eiwitten mogelijk binnen biologische processen die afhankelijk zijn van fijn afgesteld actine-gebaseerde dynamica, zoals mitotische celdeling en myogenese, op het niveau van een enkele cel.

Adenofection: Een methode voor het bestuderen van de rol van de Molecular Begeleiders in Cellular Morfodynamica door uitputting-Rescue Experimenten

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

Het algemene doel van deze methode is om depletion rescue-experimenten mogelijk te maken onder omstandigheden die de cellulaire integriteit en proteïnehomeostase behouden voor functionele analyses van biologische processen op enkelcelniveau.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over eiwitfuncties en structurele vereisten in celdynamica, zoals mitose en celdifferentiatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een eiwit van belang kan worden afgebroken, terwijl gelijktijdig een variant van dit eiwit op een bijna fysiologisch niveau kan worden geïntroduceerd in een groot deel van een celpopulatie.Begin met het coaten van glazen bodemschaaltjes met fibronectine. Hiervoor dient een fibronectine-voorraadoplossing van 1 mg/mL 1:100 te worden verdund met steriele PBS.Voeg één milliliter toe aan elke schaal van 35 milliliter om het gehele oppervlak te bedekken. Incubeer gedurende één uur bij 37 °C en 5% CO2. Warm tijdens de incubatie alpha MEM aangevuld met 10% FBS en een aliquot van 0,05% trypsine EDTA voor tot 37 °C.Na 45 minuten incubatie begint u met het bereiden van de celoplossing. Aspireer het medium uit een plaat van 10 centimeter met HeLa-RFP-H2B-cellen. Spoel vervolgens voorzichtig twee keer met 1,5 milliliters 0,05% trypsine EDTA.Laat na de laatste aspiratie 0,5 milliliters trypsin EDTA op de plaat achter en incubeer de cellen gedurende twee tot drie minuten bij 37 °C en 5% carbon dioxide.Tik voorzichtig op de plaat en observeer de cellaag onder de microscoop om te verifiëren dat alle cellen zijn losgekomen. Voeg vervolgens 10 milliliters medium toe en pipetteer voorzichtig enkele keren om de cellen te scheiden en breng de celsuspensie over in een 15 milliliter buis.Tel een monster van 10 µL van de celstuspensie met behulp van een hemocytometer. Aspireer vervolgens de fibronectine-oplossing uit de schaaltjes met glazen bodem. Zorg dat de fibronectine niet opdroogt vóór het uitplaten van de cellen.Bereid een celsuspensie voor om 1,5 × 10⁵ cellen per 35 millimeter schaal uit te platen in twee milliliter medium. Plate één extra 35 millimeter schaal bovenop het aantal condities om het celgetal te tellen voorafgaand aan de virustransductie. Incubeer gedurende 30 tot 45 minuten. Controleer na afloop van de incubatietijd de cellen onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen goed gescheiden zijn, zoals hier te zien is. Plaats de schalen terug in de incubator en kweek de cellen tot de volgende dag.Controleer de dag na het uitplaten of de cellen een dichtheid van ten minste 50% hebben bereikt. Een celdichtheid lager dan 50% leidt tot een verminderde efficiëntie van de virustransductie, een grotere variatie in eiwitexpressie per cel en een verhoogde celtoxiciteit. Oogst vervolgens de cellen uit de aanvullend uitgeplaatte schaal zoals voorheen en tel het aantal cellen. Bereken het volume virussen dat nodig is voor een efficiënte transductie van de cellen. Label voor elke conditie een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg 400 microliters warme alpha MEM minus toe. Voeg na het langzaam ontdooien van de virusaliquots op ijs het benodigde volume van elk virus toe aan de buizen en meng dit voorzichtig door te pipetteren. Aspireer vervolgens het medium van de cellen en voeg het virusmengsel voorzichtig druppelsgewijs toe. Incubeer de cellen bij 37 degrees Celsius met 5%carbon dioxide. Schud de platen gedurende een uur elke 15 minuten voorzichtig in de steriele laminaire flowkast om de cellen met het virus te bedekken. Het gebruik van een kleine hoeveelheid medium vergemakkelijkt het contact tussen het virus en de cellen.Pipetteer na de incubatie voorzichtig 1,6 milliliters alpha MEM minus in elke plaat om een totaalvolume van twee milliliters te verkrijgen. Start vervolgens de cellsynchronisatie door twee millimolar thymidine toe te voegen voordat de cellen nog eens twee uur worden geïncubeerd.Bereid ondertussen het siRNA-transfectiemengsel voor door in een microbuisje 139 µL steriel water, 50 µL 1 M calciumchloride en 11 µL 20 µM siRNA toe te voegen. Indien geen siRNA nodig is, vervang dan de hoeveelheid siRNA door steriel water om een lege transfectie uit te voeren. Voeg druppelsgewijs langzaam HBSS-2X-oplossing toe aan het calciumchloride-siRNA-mengsel. Meng het geheel voorzichtig twee keer door luchtinjectie met een 200 µL pipette, aangezien kleinere precipitaten leiden tot een betere transfectie-efficiëntie. Incubeer het mengsel vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na de incubatie langzaam 200 µL druppelsgewijs toe aan elke plaat en schud om te mengen. Incubeer de platen 16 uur bij 37 °C en 5% CO2.Verwijder de volgende dag de schalen uit de incubator en transporteer deze naar een weefselkweekkast. Spoel de cellen twee keer af met twee milliliters warme HEPES en voeg vervolgens twee milliliters alpha MEM minus toe voordat u ze terugplaatst in de incubator.Voeg zeven uur later twee millimol thymidine toe aan de platen voordat u deze terugplaatst in de incubator. Werk met maximaal vier celplaten tegelijk, aangezien temperatuurvariaties de lengte van de celcyclus beïnvloeden. De volgende dag, 48 uur na de siRNA-transfectie en virusinfectie, spoelt u de cellen twee keer met twee milliliter warme PBS en voegt u vervolgens twee milliliter alpha MEM zonder fenolrood toe voor live-cell imaging. Incubeer gedurende zeven uur.Voer kortstondige live cell imaging-experimenten uit op mitotische cellen met een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een bevochtigde, thermo-gereguleerde kamer met 5% carbon dioxide. Controleer vóór de acquisitie of de kamer de juiste temperatuur van 37 °C heeft bereikt.Plaats de kweekschaaltjes één uur voor de acquisitie in de microscoopkamer om een juiste equilibratie van het medium mogelijk te maken en focusdrift door temperatuurveranderingen te voorkomen. Controleer de mitotische status van de cellen. Op dit punt zouden 10 tot 15% van de cellen zich in de vroege stadia van de mitose moeten bevinden.Stel tijdens de equilibratietijd de acquisitieparameters in zoals bepaald in eerdere experimenten. Het is belangrijk om een passende resolutie te bereiken zonder fotobleking, aangezien dit celbeschadiging veroorzaakt en de mitotische progressie verstoort. Kies per conditie meerdere velden met cellen die zich bij de mitotische entry bevinden, om een significant aantal cellen te verkrijgen voor analyse zonder het acquisie-interval te overschrijden. Zodra alle velden zijn gekozen, dient de focus opnieuw te worden ingesteld en de acquisitie zo snel mogelijk te worden gestart.Bij gebruik van een spinning disc confocale systeem zou een typische opstelling vier verschillende condities bevatten, zeven gezichtsvelden per plaat en twee kleurkanalen met een interval van 1,5 tot twee minuten over een periode van 75 minuten. Bepaal goed gedefinieerde criteria voor de analyse van mitotische fenotypen in cellen, wat afhankelijk zal zijn van de gebruikte fluorescente markers.In tegenstelling tot de transfectie van BAG3-GFP-plasmide-DNA, zoals links te zien is, maakt adenofectie met recombinante adenovirussen, hier rechts getoond, een meer homogene en efficiënte expressie van BAG3-GFP mogelijk in het grootste deel van de celpopulatie bij een lage multiplicity of infection. Deze representatieve western blot laat zien dat adenofectie met BAG3-specifieke siRNAs en recombinant adenovirus BAG3-GFP een efficiënte depletie van endogeen BAG3 en reïntroductie van het BAG3-GFP-eiwit op bijna endogene niveaus mogelijk maakt. Zoals hier getoond, kan adenofectie de eiwithomeostase behouden, aangezien er geen detecteerbare toename is in de niveaus van stress-geïnduceerde heat shock proteins in adenofecteerde HeLa-cellen, in tegenstelling tot HeLa-cellen behandeld met de proteotoxische stress-inducer MG132. Hier zien we dat de progressie van cellen door de mitose niet significant wordt verstoord door adenofectie, zoals blijkt uit deze confocale time-lapse beelden van HeLa-cellen die zijn adenofecteerd met controle siRNA en BacMam-GFP alpha Tubulin, en BacMam-RFP Actin.De grafiek geeft het aandeel cellen met abnormale mitose aan. Cellen die uitsluitend waren getransfecteerd met BAG3-specifiek siRNA vertoonden een ongeveer tweevoudige toename van het niveau van mitotische defecten, zoals weergegeven door de rode balk; dit werd hersteld tot bijna het niveau van de controlecellen door re-introductie van BAG3-GFP, weergegeven door de zwarte balk.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u depletion rescue-experimenten uitvoert met behulp van adenofectie. Deze methode biedt een snel en eenvoudig systeem om hypomorfe knock-downs te creëren voor structuur-functieanalyse in meerdere cellulaire achtergronden. Door deze methode te volgen kunnen de belangrijkste structurele vereisten van het eiwit van belang voor een bepaalde functie worden geïdentificeerd. Andere benaderingen van genoomredigering kunnen vervolgens worden gebruikt om de betrokken mechanismen verder te verdiepen.

adenofection-method-for-studying-role-molecular-chaperones-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit protocol een methode om intracellulair eiwit hervouwing te meten na de heat shock wordt beschreven. Deze methode kan gebruikt worden om foldases zoals moleculaire chaperonnes en hun co-factoren of verbindingen in staat om hun activiteiten van invloed te bestuderen. Vuurvlieg luciferase activiteit wordt gebruikt als reporter voor chaperonne hervouwing activiteit te meten.

Intracellulaire hervouwing Assay

Source: Dahl, J. et al. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates a fluorescence spectrophotometer-based assay to evaluate chaperone activity on a substrate protein under acid and heat stress. It outlines the steps for monitoring substrate unfolding and aggregation through light scattering, comparing conditions with and without the chaperone.

Assessing Bacterial Chaperone Activity via Thermal Unfolding of a Model Protein

Dit artikel beschrijft het gebruik van een vuurvlieg luciferase-GFP-fusie-eiwit te...

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Deze studie beschrijft biofysische, biochemische en moleculaire technieken om de chaperone activiteit van Escherichia coli HdeB karakteriseren onder zure pH-omstandigheden. Deze werkwijzen zijn met succes toegepast voor andere zuur-beschermende chaperones zoals HdeA en kan worden aangepast om te werken voor andere chaperones en stresscondities.

Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; en<em&gt; In Vivo</em

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Een van de meest uitdagende stress voorwaarden die organismen tijdens hun leven tegenkomen gaat de accumulatie van oxidanten. Tijdens oxidatieve stress afhankelijk cellen sterk zijn van moleculaire chaperones. Hier presenteren we methoden voor het onderzoeken van de redox-gereglementeerde anti-aggregatie activiteit, evenals het monitoren van de structurele veranderingen in het bestuur van de Chaperon-functie met behulp van HDX-MS.

Hsp33 de Redox-gereglementeerde Chaperone activiteit definiëren en in kaart brengen van de wijzigingen van de conformationele op Hsp33 met behulp van spectrometrie van de massa van de Exchange waterstof-deuterium

Cognate J-Domain eiwitten werken samen met de Hsp70 chaperonne om te helpen bij een groot aantal biologische processen, variërend van eiwit vouwen tot afbraak. Hier beschrijven we een in-situ proximity ligatie test, die het mogelijk maakt om deze transitieve gevormde chaperonne machinerie in bacteriële, gist en menselijke cellen te monitoren.

In situ monitoring van transitieve gevormde moleculaire Chaperone-assemblages in bacteriën, gist en menselijke cellen

Om chaperonne-chaperonne- en chaperonne-substraatinteracties te bestuderen, voeren we synthetische interactiescreenings uit in Caenorhabditis elegans met behulp van RNA-interferentie in combinatie met milde mutaties of overexpressie van chaperonnes en monitoren we weefselspecifieke eiwitdisfunctie op organismaal niveau.

Caenorhabditis elegans gebruiken om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties

Dit protocol presenteert een techniek voor het onderzoeken van eiwit-eiwitinteracties met behulp van glutathion-gekoppelde donorkralen met GST-gefuseerde TPR-motief co-chaperones en acceptor kralen in combinatie met een Hsp90-afgeleid peptide. We hebben deze techniek gebruikt om kleine moleculen te screenen om Hsp90-FKBP51- of Hsp90-FKBP52-interacties te verstoren en hebben krachtige en selectieve Hsp90-FKBP51-interactieremmers geïdentificeerd.

Studies van Chaperone-Cochaperone Interacties met behulp van Homogene Bead-Based Assay

Dit protocol beschrijft een reeks methoden die analytische grootte-uitsluitingschromatografie omvatten om histon chaperone oligomerisatie en stabiliteit te bestuderen, pull-down assay om histon chaperone-histon interacties te ontrafelen, AUC om de stoichiometrie van de eiwitcomplexen te analyseren, en histon chaperoning assay om functioneel een vermeende histon chaperone in vitro te karakteriseren.

In vitro Karakterisering van Histone Chaperones met behulp van Analytische, Pull-Down en Chaperoning Assays

DNA-gordijn, een high-throughput single-molecule beeldvormingstechniek, biedt een platform voor real-time visualisatie van diverse eiwit-DNA-interacties. Het huidige protocol maakt gebruik van de DNA-gordijntechniek om de biologische rol en het moleculaire mechanisme van Abo1 te onderzoeken, een Schizosaccharomyces pombe bromodomein-bevattend AAA+ ATPase.

Het ontcijferen van moleculair mechanisme van histonassemblage door DNA-gordijntechniek

Leer adenofectie voor uitputting-rescue-experimenten die cellulaire integriteit en proteïne-homeostase behouden. Deze methode analyseert proteïnefuncties op enkelcellig niveau in processen zoals mitose en myogenese.

Adenofection: Een methode voor het bestuderen van de rol van de Molecular Begeleiders in Cellular Morfodynamica door uitputting-Rescue Experimenten (Video) | JoVE Journal

Adenofection: Een methode voor het bestuderen van de rol van de Molecular Begeleiders in Cellular Morfodynamica door uitputting-Rescue Experimenten

Meer video's verkennen