Adenofection: Een methode voor het bestuderen van de rol van de Molecular Begeleiders in Cellular Morfodynamica door uitputting-Rescue Experimenten

Het algemene doel van deze methode is om uitputtingsreddingsexperimenten mogelijk te maken onder omstandigheden die de cellulaire integriteit en eiwithomeostase behouden. Voor functionele analyses van biologische processen op het niveau van één cel. Deze methode kan helpen om sleutelvraagstukken te beantwoorden over eiwitfuncties en structuurvereisten in celdynamica zoals mitose en celdifferentiatie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om een eiwit van belang te depeteren en tegelijkertijd een variant van dit eiwit op een nieuw fysiologisch niveau te herintroduceren in een meetbaarheid van een celpopulatie. Begin met het coaten van glazen bodemschalen met fibronectine. Om dit te doen, verdun een stockoplossing van één milligram per milliliter fibronectine een op honderd met steriel PBS.

Voeg één milliliter toe aan elke 35 milliliter schaal om het hele oppervlak te bedekken. Incubeer gedurende één uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Tijdens de incubatie, verwarm alfa MEM aanvullend met 10% FBS en een aliquot van 0,05% trypsine EDTA voor tot 37 graden Celsius.

Na 45 minuten incubatie, begin met het voorbereiden van de celoplossing. Aspiseer het medium van een 10 centimeter plaat van HeLa RFP H2B cellen. En spoel voorzichtig twee keer met 1,5 milliliter 0,05% trypsine EDTA.

Laat 0,5 milliliter trypsine EDTA op de plaat achter na de laatste aspiratie. En incubeer de cellen gedurende twee tot drie minuten bij 37 graden Celsius. En 5% koolstofdioxide.

Tik zachtjes op de plaat. En observeer de cel laag onder de microscoop om te verifiëren dat alle cellen zijn losgemaakt. Voeg vervolgens 10 milliliter medium toe en pipetteer voorzichtig meerdere keren om de cellen te scheiden en breng de celsuspensie in een 15 milliliter buisje over.

Tel een 10 microliter monster van de celsuspensie met behulp van een hemocytometer. Aspiseer vervolgens de fibronectineoplossing van de glazen bodemschalen. Laat de fibronectine niet drogen voordat de cellen worden geplaatst.

Bereid een celsuspensieoplossing voor om 1,5 keer tien tot de vijfde cellen per 35 millimeter schaal in twee milliliter medium te plaatsen. Plaats één 35 millimeter plaat extra bij het aantal condities om het aantal cellen te tellen voorafgaand aan virustransductie. Incubeer gedurende 30 tot 45 minuten.

Na het verstrijken van de incubatietijd, controleer de cellen onder de microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen goed gescheiden zijn. Zoals hier te zien is. Breng de platen terug in de incubator en laat de cellen groeien tot de volgende dag.

Op de dag na het plaatsen, zorg ervoor dat de cellen de dichtheid van minimaal 50% hebben bereikt. Een celdichtheid lager dan 50% resulteert in verminderde virustransductie-efficiëntie. Verhoogde variatie van eiwitexpressie per cel en verhoogde celtoxiciteit. Verzamel vervolgens de cellen van de extra geplaatste schaal zoals eerder.

En tel het aantal cellen. Bereken het volume virussen dat nodig is voor efficiënte transductie van de cellen. Label een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje voor elke conditie.

En voeg 400 microliter warm alfa MEM min toe. Na langzaam ontdooien van aliquots van de virussen op ijs, voeg het vereiste volume van elk virus toe aan de buisjes en meng voorzichtig door te pipetteren. Vervolgens, na het aspiseer het medium van de cellen, voeg de virusmix druppelsgewijs voorzichtig toe.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Om de 15 minuten gedurende een periode van een uur, schud de platen voorzichtig onder de steriele kap om de cellen met virus te bedekken. Het gebruik van een kleine hoeveelheid medium vergemakkelijkt het contact van het virus met de cellen.

Na de incubatie, pipetteer voorzichtig 1,6 milliliter alfa MEM min naar elke plaat om een totaal volume van twee milliliter te verkrijgen. Begin vervolgens met celsynchronisatie door twee millimolar thymidine toe te voegen voordat de cellen gedurende twee uur verder worden geïncubeerd. Bereid ondertussen het siRNA-transfectiemengsel voor door in een microbuisje 139 microliter steriel water, 50 microliter één molair calciumchloride en 11 microliter 20 micromolar siRNA toe te voegen.

Als er geen siRNA nodig is, vervang de hoeveelheid siRNA door steriel water om een lege transfectie uit te voeren. Voeg HBSS2X-oplossing druppelsgewijs langzaam toe aan het calciumchloride-siRNA-mengsel. Meng voorzichtig twee keer door luchtinjectie met behulp van een 200 microliter pipette.

Aangezien kleinere precipitaatjes resulteren in betere transfectie-efficiëntie. Bewaar het mengsel vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na de incubatie langzaam 200 microliter druppelsgewijs toe aan elke plaat en schud om te mengen.

Incubeer de platen bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide gedurende 16 uur. Verwijder de volgende dag de schalen uit de incubator en transporteer ze naar een weefselkweekkap. Na het spoelen van de cellen twee keer met twee milliliter warme hipis, voeg twee milliliter alfa MEM min toe voordat ze worden teruggeplaatst in de incubator.

Zeven uur later, voeg twee millimolar thymidine toe aan de platen voordat ze worden teruggeplaatst in de incubator. Werk met niet meer dan vier celplaten tegelijk omdat temperatuurvariaties de lengte van de celcyclus beïnvloeden. De volgende dag, 48 uur na siRNA-transfectie en virusinfectie, spoel de cellen twee keer met twee milliliter warme PBS en voeg vervolgens twee milliliter alfa MEM zonder fenolrood toe voor levende celbeeldvorming.

Incubeer gedurende zeven uur. Voer kortetermijnexperimenten voor levende celbeeldvorming uit op mitotische cellen met een omgekeerde microscoop uitgerust met een bevochtigde 5% koolstofdioxide thermogeregelde kamer. Controleer voorafgaand aan de acquisitie of de kamer de juiste temperatuur van 37 graden Celsius heeft bereikt.

Plaats de gekweekte sch