Name: Phagosome Migratie en Velocity Gemeten Live primaire humane macrofagen geïnfecteerd met HIV-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Leer hoe u fagosoomsnelheid kwantificeert in HIV-1-geïnfecteerde humane macrofagen met behulp van handmatige tracking en spindelschijfconfocale microscopie. Deze methode biedt inzicht in fagosoomdynamica tijdens virale infectie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Jamil Jubrail voor het lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van CNRS, Inserm, Université Paris Descartes, Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 inclusief een doctoraatsbeurs voor GLB) en Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, inclusief een postdoctoraal fellowship voor CD) aan FN. A. Dumas werd ondersteund door doctoraatsbeurzen van Université Paris Descartes en Sidaction.

Het protocol heeft uitgevoerd in strikte overeenstemming met de nationale en internationale wetgeving en de plaatselijke voorschriften worden uitgevoerd. Bloed van gezonde donoren die hun toestemming om bloed te doneren voor onderzoeksdoeleinden gaf is verkregen van Bloedtransfusie Centers waarmee de instellingen overeenkomst hebben ondertekend. Speciale bescherming moeten worden genomen bij het gebruik van menselijk bloed. Experimenten met HIV-1 moet worden uitgevoerd in een bioveiligheid niveau 3 of 2 (BSL-3 of 2) laboratorium volgens de plaatselijke wetgeving. 1. Bereiding van Human monocyt-afgeleide macrofagen (hMDMs) door dichtheidsgradiëntcentrifugatie en selectie door Adhesie <ol><li> Begin met vers bloed van gezonde donoren (9 ml). Verdun het hele volume vers bloed met steriele 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + en Mg2 + om een eindvolume van 70 ml te verkrijgen en voorzichtig het verdunde bloed toe in twee 50 ml conische buizen (35 ml per buis) bovenop 15 ml van eeneutral, sterk vertakte, zwaardere hydrofiele polysaccharide in oplossing reeds in elke buis. </li><li> Centrifuge twee buisjes bloed bij 537 xg gedurende 20 min bij 20 ° C zonder rem. Laat dan het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) in de bewolkte cel ring aan de interface en overbrengen naar een nieuwe 50 ml buis met 15 ml 1x PBS zonder Ca2 + en Mg2 +. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 218 g gedurende 5 min bij 20 ° C en resuspendeer de pellet in 45 ml 1x PBS zonder Ca2 + en Mg2 +. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 218 g gedurende 5 min bij 20 ° C, resuspendeer de pellet in 10 ml 1x PBS zonder Ca2 + en Mg2 +, en tel de cellen door verdunnen tot een eindverdunning van 1/200 in trypan blauw. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 218 g gedurende 5 min bij 20 ° C en resuspendeer de pellet in RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium aangevuld met 2 mM L-glutamine en 100 ug / ml Penicillin-streptomycine tot 7 x 10 6 PBMC per putje hebben in 2 ml medium in elk putje van een 6 wells-plaat. </li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 2 uur. Na 2 uur wordt de monocyten gehecht zijn aan de kunststof. </li><li> Om vers geïsoleerde monocyten te differentiëren in hMDMs, zuig het medium en vervangen door 2 ml hMDM medium (RPMI 1640, 10% gedecomplementeerd foetaal kalfsserum (FCS), 2 mM L-glutamine en 1% penicilline-streptomycine), aangevuld met recombinant humaan macrofaag kolonie stimulerende factor (RHM-CSF) tot een eindconcentratie van 10 ng / ml. </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 11 dagen (Figuur 1). </li><li> Op dag 11 Verwijder het medium en was 2 keer met 2 ml koude hMDM medium per well. Was dan elk putje 2 maal met 1 ml koude 1x PBS. </li><li> Om volledig gedifferentieerde hMDMs los te maken, wassen elk putje 1 keer met 1 ml koud 1x PBS met 2 mM ethylenediaminetetraacetatic zuur (EDTA) en incubeer de cellen in 2 ml koude 1x PBS met 2 mM EDTA per putje gedurende 15-60 min bij 4 ° C. LET OP: Alternatieve methoden om los te maken van de cellen bestaan ​​(bijvoorbeeld trypsine of trypsine-achtige activiteiten) die goede resultaten 11 kunnen geven. </li><li> Na onthechting (ingevuld door pipetteren voorzichtig op en neer in de put), het verzamelen van de cellen en zet ze in een 50 ml buis op ijs met 10 ml koud hMDM medium. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 218 g gedurende 5 min bij 20 ° C, resuspendeer de pellet in 10 ml koude hMDM medium en tel de cellen door verdunning van 1/20 in Trypan Blue. </li><li> Zaad de cellen bij 1 x 10 6 hMDMs per 35 mm microscopie rangglas onderste schaal en incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 1 dag. </li></ol> 2. Productie en kwantificatie van HIV-1 virale voorraden LET OP: NLR4.3 HIV-1-Gag iGFP (Green Fluorescent Protein) het uitvoeren van een R5-troop envelop, gift van M. Schindler 10 wordt gebruikt om macrofagen te infecteren en de geïnfecteerde cellen in real time te zien. <ol><li> Produceren virale voorraden door transfectie van humane embryonale nier 293T-cellen (2 x 10 6 in 100 mm schaal) met 6 ug van het overeenkomstige provirale DNA onder toepassing van een commercieel transfectiereagens. </li><li> Kwantificeren van de infectiviteit van het virus voorraden met de indicatorcellen HeLa TZM-bl (voorzien van de ß-galactosidase-gen onder de controle van HIV-1-LTR) via seriële verdunningen van de virale voorraden gevolgd door een ß-galactosidase kleuring van de cellen en telling van blauwe cellen 12. </li></ol> 3. Infectie van hMDMs met HIV-1 <ol><li> Voeg het virus bij een multipliciteit van infectie (MOI) 0,02-0,03 in 1 ml medium hMDM tot hMDMs (cellen uitgeplaat in 1,13). Om controleputjes alleen toevoegen 1 ml hMDM medium en incubeer de schaaltjes 37 ° C met 5% CO2 gedurende 2 dagen (figuur 1). </li><li> Op dag 2 was de cellen met hMDM medIUM 3 keer en voeg 1 ml vers hMDM medium per gerecht. Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 6 dagen (figuur 1). </li></ol> 4. opsonisatie van rode bloedcellen van schapen <ol><li> Voor de bereiding van 7 x 10 6 SRBC&#39;s per schaal, twee maal wassen SRBC in 100 pl oplossing die 0,1% runderserumalbumine (BSA) in 1x PBS met centrifugeren bij 600 g gedurende 4 min. </li><li> Resuspendeer de gewassen SRBC in 500 pl 1x PBS / BSA 0,1% met konijn IgG anti-SRBC een sub agglutinerende concentratie per 5 pl SRBC en incubeer met rotatie bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Opmerking: Om de verder agglutinerende concentratie van anti-SRBC IgG bepalen bereiden seriële verdunningen van IgG (stock concentratie 13,1 mg / ml) van 1/50 tot 1 / 25.600 in 20 pi in een 96-wells plaat. Voeg 2 x 10 6 SRBC in 20 pl in elk putje gebracht en de plaat in een donkere kamer gedurende meerdere uren. De sub-agglutinerende concentratie deverdunning van de put net voor de put met agglutinatie (IgG + SRBC vormen een netwerk). </li><li> Na rotatie gecentrifugeerd IgG-opsonized-SRBC bij 600 g gedurende 4 minuten en wassen met 100 pl 1x PBS / BSA 0,1% van centrifugatie bij 600 g gedurende 4 min. </li><li> Resuspendeer de IgG-opsonized-SRBC in voorverwarmde fenolrood-vrij RPMI medium aangevuld met 2 mM L-glutamine en 1% penicilline-streptomycine (1 ml / schaal). </li></ol> 5. Live-Cell Video Microscopie Phagocytosis Assay <ol><li> Gebruik een confocale beeldvormingssysteem zoals een draaiende schijf systeem voorzien van een verwarmingskamer bij 37 ° C met CO 2 die door een fles met water voor bevochtiging. </li><li> Schakel de verhittingskamer voorafgaand aan het experiment om de microscoop podium bij 37 ° C voor het begin van de fagocytose assay. Zet de microscoop en de computer en laad de imaging software. </li><li> Optimaliseer de imaging-instellingen, zoals scansnelheid, magnification, resolutie, etc. ten minste één cel per veld en beeld één frame per minuut 60 tot 120 min. LET OP: Hier wordt het monster afgebeeld één frame per minuut gedurende 60 min met 63x lens. </li><li> Plaats de beeldvorming schotel op de microscoop podium. Pas de scherpstelling en de locatie tot één geheel HIV-1 geïnfecteerde macrofaag in het veld te vinden. Gebruik de juiste excitatie / emissie-instellingen op basis van de gebruikte imaging-systeem en sonde. Inclusief een heldere veld (BF) kanaal phagosomes observeren (Figuur 1ii). Optimaliseer het uiterlijk van de verschillende kanalen beelden door het aanpassen van het percentage doorgelaten licht en blootstellingstijd. LET OP: Hier, NLR4.3 HIV-1-Gag-iGFP was enthousiast met behulp van een 491 nm laser met 50 msec tijd blootstelling met 20% van de laser (figuur 1i). </li><li> Verwijder de imaging schaal en voeg 1 ml SRBC suspensie bij 7 x 10 6 SRBC / ml van de schaal (figuur 1). </li><li> Centrifugeer bij 500 xg gedurende2 min bij RT om fagocytose te synchroniseren, de tijd op te nemen aan het einde van het centrifugeren en de terugkeer van de schotel naar het podium. </li><li> Optimaliseren van de scherpstelling en opname GFP en BF beelden in Z-stacks (gehele dikte van de cel met een stap-afstand van 0,3 pm - meestal 20 vlakken) per minuut gedurende ten minste 1 uur. Sla de time-lapse video in de oorspronkelijke file-formaat van de gebruikte imaging-systeem. LET OP: Hier werden time-lapse filmpjes opgeslagen in het eigen formaat, * .stk bestanden. </li></ol> 6. Analyse van de Time-lapse filmpjes <ol><li> Voor videobewerking, klikt u op het drop down menu &#39;Apps&#39; en op de tab &quot;Review Multi Dimensional Data&quot; in de video-editing software. <ol><li> Om het bestand te openen, klikt u op &quot;Select Base File&quot; en vervolgens op &quot;Select Directory&quot;. In de &quot;Data sets&quot; selecteert u de overname (in .nd formaat) te analyseren en klik op &quot;View&quot;. De gegevens worden weergegeven in een tabel met de tijd in de kolom eend Z-plan de lijn. </li><li> Om de infectie in een Z-projectie (figuur 2, links panelen) vertegenwoordigen, selecteert u 491 nm golflengte in het vak &quot;Golflengten&quot; en klik op het tabblad &quot;Z projectie&quot; met &quot;alle vliegtuigen&quot;. </li><li> Om een tijdreeks, analyseren en BF golflengte in het vak &quot;Golflengten&quot; en kies de optimale vliegtuig op de Z-as naar externe SRBC&#39;s (figuur 2, rode pijlpunt), interne SRBC&#39;s (figuur 2, rode cirkel) en de nucleus te onderscheiden ( Figuur 2, blauwe cirkel). </li><li> Om de video montages te slaan, klik op &quot;Selectie [X]&quot; tab en vervolgens op &quot;Load Image (s)&quot;. Tot slot, sparen de geladen beelden in tif-formaat en open ze vervolgens op ImageJ software. </li></ol></li><li> Met de plugin &quot;Manual Tracking&quot; op de ImageJ software om de positie van de kern en de verschillende phagosomes waargenomen bij BF kanaal (figuur 3) te meten. <ol><li> Download de &quot;Manual Tracking&quot; plug-in op de ImageJ website. Op ImageJ, open de plugin en de afbeelding die moet worden geanalyseerd (figuur 3, stap 1 en 2). </li><li> Voer de instellingen zoals &quot;Time Interval&quot; die hoeveelheid tussen naburige frames vertegenwoordigt, en de &quot;x / y calibration&quot; waarbij de afstand per pixel vertegenwoordigt (figuur 3, stap 3). LET OP: Hier slaat u de afbeelding sequentie met een tijdsinterval van 1 min tussen elk frame en x / y ijking van 0,205 micrometer, omdat de 63x zoom en een camera met een pixelgrootte van 6,45 x 6,45 micrometer 2 worden gebruikt. </li><li> Om de tracking te starten, klikt u op &quot;track Voeg&quot; (figuur 3, stap 4) en klik op de SRBC center bij de eerste keer wanneer het wordt geïnternaliseerd. Het volgende frame verschijnt automatisch. </li><li> Ga verder te klikken op de SRBC center in alle frames op verschillende posities in de loop van de tijd (figuur 3, stap 6 in rode doos) hebben. <ol><li> Start om de kern te volgen om haar positie in alle frames hebben door te klikken op het midden. Volgende volgen de phagosomes (door te klikken op het midden) één voor één op het moment (frame) van hun internalisatie, verschillend in functie van SRBC&#39;s. Voor het gemak om SRBC bekijk op BF kanaal, gebruikt u het venster &quot;Helderheid en contrast&quot; tijdens het volgen (figuur 3, stap 5). </li></ol></li><li> Tussen elke SRBC volgen, klik op &quot;track Voeg&quot; (figuur 3, stap 4) om een nieuwe baan te hebben. Het aantal van het volgen zal worden gewijzigd in de tweede kolom, &quot;Order nr&quot; van de resultatentabel (figuur 3, stap 6). </li><li> Sla de gegevens in een spreadsheet om door te gaan naar de volgende stap van de analyse. </li></ol></li><li> Gebruik spreadsheetsoftware van de afgelegde afstand phagosomes met SRBC&#39;s naar de kern en de snelheid van de phagosomes gedurende de eerste 5 minuten na internalisatie van SRBC berekenen (Figuur 4). <ol><li> Open de spreadsheet tafel en een nieuwe spreadsheet-bestand. Transfer naar het nieuwe bestand de volgende parameters enige tijd, de x- en y-coördinaat van de kern en alle SRBC&#39;s (Figuur 4A). </li><li> Om de afstand tussen de kern en SRBC berekenen alleen hun coördinaten, beschouwen de kern en een SRBC in een XY-coördinatenvlak (figuur 4B). OPMERKING: De afstand tussen twee punten is de lengte van het pad te verbinden. In het vliegtuig, is de afstand tussen SRBC en de nucleus gegeven door de stelling van Pythagoras. <ol><li> Als c (de afstand tussen de kern en de SRBC) staat voor de lengte van de hypotenusa en a en b duiden de lengten van de beide andere zijden, drukken stelling van Pythagoras als Pythagoras vergelijking: <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq1.jpg" /> OPMERKING: Tegelijkertijd op orthonormale, de horizontale afstanda (x nucleus -x SRBC) en de verticale afstand b (y kern -y SRBC). </li><li> Aldus berekent de afstand tussen de kern en de SRBC (Figuur 4A, paarse doos) van: <img alt="vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq2.jpg" /> OPMERKING: Vermenigvuldig de verkregen afstandswaarde (in pixels) van x / y kalibratie de afstand urn. Hier, de x / y kalibratie is 0,205 micrometer. </li><li> Op elk tijdstip, trek de afstand tussen de kern en de SRBC de beginafstand (Figuur 4C). </li><li> Zet de meting tegen de tijd voor de eerste 5 minuten. Breng een lineaire trendlijn (figuur 5A) om het diagram en bepaal de helling van de lineaire trend-lijn die de phagosome snelheid naar de nucleus gedurende de eerste 5 minuten na SRBC internalisatie vertegenwoordigt. </li><li> Verzamelen van de gegevens voor de gemiddelde en de statistische fout van berekenende snelheid waarden en plot ze in een passende vorm met behulp van de juiste software (Figuur 5B). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiedergang%2C+F+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).</li>
<li>Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+microtubule+dynamics+in+phagosome+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for microtubule dynamics in phagosome movement.</a> J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).</li>
<li>Blocker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+requirements+for+bi-directional+movement+of+phagosomes+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules.</a> J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).</li>
<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
<li>Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+non-typhoidal+salmonella+disease%3A+an+emerging+and+neglected+tropical+disease+in+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa.</a> Lancet. 379, 2489-2499 (2012).</li>
<li>Mazzolini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+phagocytosis+in+HIV-1-infected+macrophages+relies+on+Nef-dependent+alteration+of+focal+delivery+of+recycling+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments.</a> Blood. 115, 4226-4236 (2010).</li>
<li>Dumas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+protein+Vpr+impairs+phagosome+maturation+by+controlling+microtubule-dependent+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking.</a> J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).</li>
<li>Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+technique+to+distinguish+attached+from+ingested+erythrocytes+and+zymosan+particles+in+phagocytosing+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages.</a> J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).</li>
<li>Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+internal+HIV-1+is+protected+from+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies.</a> J Virol. 86, 2826-2836 (2012).</li>
<li>Gartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+and+HIV%3A+basic+concepts+and+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies.</a> Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).</li>
<li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+patients+receiving+fusion+inhibitor+%28T-20%29+monotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+fuse+with+late+endosomes+and%2For+lysosomes+by+extension+of+membrane+protrusions+along+microtubules%3A+role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP.</a> Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Toyohara, A., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze techniek heeft een aantal kritische stappen. Ten eerste de bereiding van hMDMs en de infectie door HIV-1 is essentieel omdat het percentage infectie donor afhankelijk. Van de nota, hebben we besloten om macrofagen die niet in vitro worden gepolariseerd voorafgaand aan de infectie te gebruiken, omdat de status van macrofagen mogelijk ondervonden door het virus in vivo is nog niet goed tot nu toe gekenmerkt. We controleerden de expressie van verschillende oppervlakte markers, wat aangeeft dat de mac...

Macrofagen spelen een belangrijke rol in het aangeboren immuunsysteem en in de homeostase. Ze zijn professionele fagocyten die pathogenen en puinhopen internaliseren en elimineren door een proces dat fagocytose wordt genoemd 1,2. Het fagosoom, het gesloten compartiment dat zich vormt na de opname van stoffelijke materialen, ondergaat een reeks fusie- en splijtingsgebeurtenissen met endocytische compartimenten, wat leidt tot een afbreekcompartiment dat het fagosoom wordt genoemd. Dit compartiment heeft een zure pH, vanwege de verwerving van proton-pompen v-ATPases, bevat hydrolytische enzymen en is verrijkt met lysosomale-geassocieerde membraaneiwitten (LAMP's). De rijping van fagosome gaat gepaard met hun migratie op microtubuli 3,4 naar het centrum van de cel om een perinucleaire locatie te bereiken waar lysosomen worden geaccumuleerd.
Van veel pathogenen is gemeld dat ze de rijping van fagosome kapen, inclusief bacteriën met intracellulaire levensstijlen die het vacuolaire milieu waarin ze zich bevinden, aanpassen 5. Het humaan immunodeficiëntievirus (HIV)-1 richt zich naast T-cellen ook op macrofagen. Omdat macrofagen resistent zijn tegen de cytopathische effecten van het virus, in tegenstelling tot T-cellen, kunnen ze worden beschouwd als een reservoir voor het virus. Bovendien vertonen macrofagen geïnfecteerd met HIV-1 defecte fagocytische functies en dragen ze bij aan het ontstaan van opportunistische ziekten. Met name ernstige invasieve niet-tyfoïdale Salmonella-ziekte veroorzaakt door Salmonella Typhimurium ST313 is de afgelopen drie decennia prevalent geweest bij kinderen of volwassenen in Sub-Sahara Afrika die zijn geïnfecteerd met HIV 6. Er is geschat dat het risico op het ontwikkelen van tuberculose meer dan 20 keer groter is bij mensen die met HIV leven dan bij degenen zonder HIV-infectie.
Om al deze redenen is het belangrijk om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de fagocytische defecten in door HIV geïnfecteerde macrofagen beter te definiëren. We hebben aangetoond dat de opname van stoffelijke materialen, geopsoneerde deeltjes, bacteriën of schimmels, werd geïnhibeerd in door HIV geïnfecteerde macrofagen 7. Aangezien deze remming gedeeltelijk is, zijn we vervolgens begonnen met het analyseren van het lot van de geïnternaliseerde fagosome in door HIV geïnfecteerde menselijke macrofagen 8. Omdat de rijping van fagosome nauw verbonden is met migratie naar het celcentrum en versmelting met lysosomen, kan een defect in fagosomale rijping het gevolg zijn van aanpassingen van de verkeersmodaliteiten in de geïnfecteerde cel. De hier beschreven methode gebruikt IgG-geopsoneerde rode bloedcellen van schapen (IgG-SRBC's) als model om receptorgemedieerde fagocytose te targeten en in het bijzonder receptoren voor het Fc-gedeelte van immunoglobulinen (FcR). Deze deeltjes zijn gemakkelijker te beeldvormen in helder veld (BF) dan latexkralen omdat extracellulaire en intracellulaire SRBC's verschillende brekingseigenschappen vertonen 9. Om de snelheid van fagosome die zich naar de kern bewegen in door HIV geïnfecteerde macrofagen te meten, hebben we een fluorescerend virus 10 gebruikt en een eenvoudige handmatige volgmethode ingesteld die hier wordt beschreven. De methode vereist geen geavanceerde programmering en gebruikt eenvoudigweg ImageJ. Het is toepasbaar op aderente cellen en elk type deeltje of pathogeen dat kan worden gevisualiseerd met helder veldmicroscopie of met fluorescente beeldvorming.

<table><tbody><tr><td>Falcon 100 mm TC-behandelde celkweekschaal</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Voor virale productie</td></tr><tr><td>Glazen bodemschalen 35 mm ongecoat 1.5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Case</td><td>Voor acquisitie</td></tr><tr><td>Falcon weefselkweekplaten 6-well</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Corning. Inc. 353934</td><td>Voor humane monocyte-afgeleide macrofagen</td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque PLUS</td><td>Dominique Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>een neutraal, sterk vertakt, hoog molecuulgewicht, hydrofiel polysacharide in oplossing voor dichtheidscentrifugatie</td></tr><tr><td>DPBS, geen calcium, geen magnesium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>RT</td></tr><tr><td>Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) 1x, vloeibaar (Hoge Glucose)</td><td>GIBCO, Molecular probes</td><td>31966-021</td><td>Bewaard bij 4 &deg;C; voor HEK celkweek</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium GLUTAMAX&nbsp; Supplement</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td>Bewaard bij 4 &deg;C; voor hMDMs kweek</td></tr><tr><td>Foetale Kalfs Serum (FCS)&nbsp;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td>Bewaard bij -20 &deg;C; decomplemented</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td>Bewaard bij -20 &deg;C; voor hMDMs kweek</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium, geen fenol rood (10x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik; voor fagocytose assay</td></tr><tr><td>FuGENE6 Transfectie Reagens</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Bewaard bij 4 &deg;C; voor virale productie</td></tr><tr><td>Schapen rode bloedcellen (SRBC's)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>Bewaard in Alsever buffer bij 4 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>Anti-schapen rode bloedcellen IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>Bewaard bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine heat shock fractie, pH 7, &ge;98%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Inverteer microscoop DMI600</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Spinning Disk Unit&nbsp; CSU-X1M1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>491 nm 50 mW laser</td><td>COBOLT CALYPSO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL APO CS Objectief</td><td>Leica</td><td></td><td>Objectieflens; Vergroting 100X; Numerische apertuur 1.40; Immersieolie</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera</td><td>Photometrics</td><td></td><td>Pixelgrootte 6,45 &micro;m x 6,45 &micro;m; Definitie 1.392 x 1.040; Codering van het beeld in 14 Bit</td></tr><tr><td>Metamorph 7.7.5 software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Voor de controle van de microscoop</td></tr><tr><td>GraphPad Prism software</td><td></td><td></td><td>Voor de statistische analyse</td></tr></tbody></table>

phagosome migratie en velocity gemeten live primaire humane macrofagen geïnfecteerd met hiv-1

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrofagen zijn fagocytische cellen die een belangrijke rol spelen op het kruispunt tussen aangeboren en specifieke immuniteit. Ze kunnen worden geïnfecteerd door het humaan immunodeficiëntievirus (HIV)-1 en vanwege hun weerstand tegen de cytopathische effecten ervan kunnen ze worden beschouwd als aanhoudende virale reservoirs. Bovendien vertonen HIV-geïnfecteerde macrofagen defecte functies die bijdragen aan de ontwikkeling van opportunistische ziekten.
Het exacte mechanisme waardoor HIV-1 de fagocytische respons van macrofagen beïnvloedt, was onbekend. We hadden eerder aangetoond dat de opname van verschillende deeltjesmateriaal door macrofagen werd geremd wanneer ze besmet waren met HIV-1. Deze remming was slechts gedeeltelijk en fagosomen werden wel gevormd in HIV-geïnfecteerde macrofagen. Daarom concentreerden we ons op het analyseren van het lot van deze fagosomen. De rijping van fagosomen gaat gepaard met migratie van deze compartimenten naar het centrum van de cel, waar ze fuseren met lysosomen en fagosomen genereren, die verantwoordelijk zijn voor de afbraak van het ingenomen materiaal. We gebruikten IgG-opsoniseerde rode schapenbloedcellen als doelwit voor fagocytose. Om de snelheid van de centripetale beweging van fagosomen in individuele HIV-geïnfecteerde macrofagen te meten, gebruikten we een combinatie van lichtveld- en fluorescentie confocale microscopie. We ontwikkelden een methode om de afstand van fagosomen naar de kern te berekenen, en vervolgens de snelheid van de fagosomen te berekenen. HIV-geïnfecteerde cellen werden geïdentificeerd dankzij een GFP-expresserend virus, maar de methode is toepasbaar op niet-geïnfecteerde cellen of elk type infectie of behandeling.

FcR bemiddelde fagocytose door HIV-1-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde hMDMs wordt beschreven gebruikt IgG-opsonized SRBC als model targets (figuur 1). De kritische stappen van dit protocol zijn de voorbereiding van hMDMs en de infectie met HIV-1. Inderdaad, de opbrengst en kwaliteit van gedifferentieerde macrofagen varieert tussen donoren en de infectie met rendementen in het traject van 10-40%. Bovendien is de bereiding van IgG-opsonized-SRBC is ook belangrijk om bes...

We beschrijven een methode om de snelheid van fagosomen te meten die zich in levende cellen, geïnfecteerd met of zonder het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) type 1, naar het centrum van de cel bewegen, met behulp van spinning disk confocale fluorescentiemicroscopie om gefluorescerende geïnfecteerde cellen te identificeren en helder veld microscopie om fagosomen te detecteren.

Phagosome Migratie en Velocity Gemeten Live primaire humane macrofagen geïnfecteerd met HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Het algemene doel van deze analyse is om de snelheid van fagosomen in HIV-1-geïnfecteerde macrofagen te kwantificeren met behulp van een eenvoudige handmatige trackmethode. Het voordeel van dit protocol is dat het een gemakkelijke methode biedt om de relatieve bewegingen te berekenen van groepen objecten binnen een cel die kunnen bewegen of vervormd kunnen raken. Deze methode biedt inzicht in de beweging van fagosomen in GFP-positieve geïnfecteerde macrofagen, maar kan ook worden gebruikt voor andere intercellulaire compartimenten in fluorescentie-gelabelde cellen.Nadat menselijke monocyt-afgeleide macrofagen zijn geïnfecteerd en bloedcellen van schapen zijn geopsoniseerd, volgens het tekstprotocol, wordt een fagocytose-assay opgezet met behulp van een confocaal beeldvormingssysteem, zoals een spinning disc-microscoop, uitgerust met een verwarmingskamer op 37 °C, met koolstofdioxide. Schakel vóór het experiment de verwarmingskamer in om de microscooptafel op 37 °C te verwarmen. Zet vervolgens de microscoop en computer aan en start de software voor beeldvorming op.Optimaliseer de beeldinstellingen, zoals scansnelheid, vergroting, resolutie, enzovoort, zodanig dat er ten minste één cel per beeldveld aanwezig is en er elke minuut één frame wordt vastgelegd gedurende 60 tot 120 minuten. Plaats de beeldschotel op de microscooptafel. Pas de focus en de positie aan om slechts één volledige HIV-1-geïnfecteerde macrofaag in het beeldveld te vinden.Gebruik passende excitatie- en emissie-instellingen op basis van het gebruikte beeldvormingssysteem en de probe. Voeg een brightfield-kanaal toe. Optimaliseer het uiterlijk hiervan door de belichtingstijd aan te passen.Verwijder vervolgens de imaging-schaal en voeg één milliliter schaapenbloedcellen, of SRBC-suspensie, met zeven keer een tiende van de zesde SRBCs per milliliter, toe aan de schaal. Centrifugeer de schaal bij 500 ×g gedurende twee minuten op kamertemperatuur om fagocytose te synchroniseren, noteer vervolgens de tijd aan het einde van de centrifugatie en plaats de schaal terug op de objecttafel. Optimaliseer de focus en stel de boven- en onderkant van de stack in met een stapafstand van 0,3 µm.Start de acquisitie van de Z-stacks van GFP- en BF-beelden over de gehele dikte van de cel en sla de time-lapse video op in het eigen bestandsformaat van het beeldsysteem. Om de video te bewerken, klikt u in de videobewerkingssoftware op het vervolgkeuzemenu Apps en op het tabblad Review Multidimensional Data. Klik op Select Base File en vervolgens op Select Directory om het bestand te openen.Selecteer in het vak Data Sets de acquisitie die u wilt analyseren en klik op View. Om de infectie in een Z-projectie weer te geven, selecteert u in het vak Wavelengths de golflengte van 491 nanometer en klikt u op het tabblad Z projection met alle vlakken. Selecteer vervolgens, om een tijdreeks te analyseren, de BF-golflengte in het vak Wavelengths en kies het optimale vlak op de Z-as om externe SRBC's, interne SRBC's en de nucleus te onderscheiden.Sla de videomontages op door op het tabblad Selection Xs te klikken en vervolgens op Load Images. Sla de geladen afbeeldingen tot slot op in tif-formaat. Open na het downloaden van de Image J manual tracking-plug-in de plug-in in Image J en open vervolgens de afbeeldingssequentie die moet worden geanalyseerd.Voer de instellingen in, zoals het tijdsinterval, dat de tijd tussen opeenvolgende frames vertegenwoordigt, en de XY-kalibratie, die de afstand per pixel vertegenwoordigt. Klik op Add Track om het volgen te starten en klik op het centrum van een SRBC op het eerste moment dat deze geïnternaliseerd is. Het volgende frame verschijnt automatisch.Gebruik voor het gemak het venster voor helderheid en contrast tijdens het tracken om de SRBC's op het BF-kanaal te kunnen zien. Klik in alle frames doorlopend op het centrum van de SRBC om de verschillende posities in de tijd vast te leggen. Klik tussen elke SRBC-tracking op End Track en vervolgens op Add Track om een nieuwe track te starten.Het trackingnummer zal veranderen in de tweede kolom van de resultatentabel. Begin met het tracken van de nucleus om de positie in alle frames te verkrijgen door op het centrum te klikken, zoals eerder is gedaan. Sla de gegevens op in een spreadsheet, open deze vervolgens in spreadsheetsoftware en maak een nieuw spreadsheetbestand aan.Zet de tijd en de X- en Y-coördinaten van de SRBC en de kern over naar dit nieuwe bestand. Gebruik ten slotte de spreadsheetsoftware om de afgelegde afstand van fagosomen die SRBC's bevatten richting de kern te berekenen, en de snelheid van de fagosomen tijdens de eerste vijf minuten na internalisatie van de SRBC's volgens het tekstprotocol. De analyse van de beweging van fagosomen in levende HIV-geïnfecteerde macrofagen in real-time met behulp van spinning disc confocale microscopie wordt hier getoond.De instellingen voor het bright-field kanaal zijn cruciaal om de nucleus te kunnen zien en om onderscheid te maken tussen externe en geïnternaliseerde SRBC's. Deze grafiek zet de afgelegde afstand van een fagosoom in niet-geïnfecteerde HMDM's in de eerste vijf minuten na internalisatie van een SRBC uit tegen de tijd. De snelheid van het fagosoom is de helling van de hier getoonde lineaire regressiecurve.Ten slotte werd in deze studie waargenomen dat de snelheid van het fagosoom gedurende de eerste vijf minuten na internalisatie in HIV-geïnfecteerde HMDM's lager is in vergelijking met niet-geïnfecteerde HMDM's. Deze methoden toonden aan dat de beweging van het fagosoom naar het centrum van de cel, en daarmee de rijping van fagosomen tot fagolysosomen, belemmerd was in HIV-geïnfecteerde macrofagen. Na acquisitie kan een cel verder worden verwerkt voor correlatieve elektronenmicroscopie, of kan de gehele celpopulatie worden gefixeerd voor klassieke immunofluorescentiemicroscopie en statistische analyse.Fagocytose is zeer gevoelig voor temperatuur; daarom moeten de temperatuur in de verwarmingskamer en het medium in de kweekschaal gedurende de gehele procedure constant op 37 degrees Celsius worden gehouden. Vergeet niet dat het werken met pathogenen risicovol kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het werken in een biologische veiligheidsruimte en het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, moeten worden genomen in overeenstemming met de lokale wetgeving.

phagosome-migration-velocity-measured-live-primary-human-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit gevisualiseerd experiment is een gids voor het gebruik van een fluorescerende moleculaire kloon van HIV voor live confocale imaging experimenten.

Visualiseren Cel-cel Overdracht van hiv met behulp van TL-Klonen van HIV en Live confocale microscopie

De phagokinetic motiliteit spoor assay is een methode om de beweging van cellen te beoordelen. Met name de test meet chemokinesis (random celmotiliteit) in de tijd op een kwantitatieve wijze. De assay maakt gebruik van het vermogen van cellen om een ​​meetbare spoor van de beweging van colloïdaal goud gecoate dekglaasjes maken.

Een kwantitatieve evaluatie van celmigratie door de Phagokinetic Track Motiliteit Assay

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

This video demonstrates an assay to quantify the intracellular growth of parasites in bone marrow-derived macrophages (BMMs). The macrophage cells are infected with the motile and non-motile invasive stages of Leishmania, metacyclic promastigotes and amastigotes, respectively. The parasites invade the macrophages, getting internalized into a parasitophorous vacuole and multiplying inside. The intracellular parasite growth is quantified using a microscope upon fluorescently staining the...

An In Vitro Assay to Quantify the Intracellular Growth of Parasite in Macrophages

We beschrijven werkwijzen voor levende cellen videomicroscopie...

Live-cel Video Microscopie van pathogene schimmel Fagocytose

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen

Hier presenteren we een protocol om fagocytose van fluorescerende deeltjes door een adherante macrofaag-cellijn te kwantificeren met behulp van een fluorometrische methode. Deze methode maakt een hoge doorvoerkwantificering van deeltjesinternalisatie mogelijk, evenals de resulterende actinepolymerisatie.

High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie

Alle pathogene Leishmania soorten zich bevinden en repliceren in macrofagen van hun gewervelde gastheren. Hier presenteren we een protocol om te infecteren lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen in cultuur met Leishmania, gevolgd door precieze kwantificering van intracellulaire groei kinetiek. Deze methode is handig voor het bestuderen van de afzonderlijke factoren beïnvloeden host-pathogen interactions en Leishmania virulentie.

Kwantificering van intracellulaire groei binnen macrofagen is een snel en betrouwbare methode voor de beoordeling van de virulentie van Leishmania parasieten

Hier beschrijven we methoden draaiende schijf confocale microscopie afbeelding één fagocytische gebeurtenissen via muis resident peritoneale macrofagen. De protocollen kunnen worden uitgebreid tot andere fagocytische cellen.

Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

Het mechanisme geassocieerd met fagocytose bij Leishmania-infectie blijft slecht begrepen. Hier beschrijven we methoden om de vroege gebeurtenissen te evalueren die plaatsvinden tijdens leishmania-interactie met de gastheercellen.

Onderzoek naar de fagocytose van Leishmania met behulp van confocale microscopie

Leer hoe u fagosoomsnelheid kwantificeert in HIV-1-geïnfecteerde humane macrofagen met behulp van handmatige tracking en spindelschijfconfocale microscopie. Deze methode biedt inzicht in fagosoomdynamica tijdens virale infectie.

Phagosome Migratie en Velocity Gemeten Live primaire humane macrofagen geïnfecteerd met HIV-1

Meer video's verkennen