Name: Bereiding van CD4 + T cellen voor analyse van GD3 ganglioside GD2 en Membraanexpressie door Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Leer hoe u CD4+ T-cellen prepareert voor microscopische analyse van GD3- en GD2-gangliosiden op het membraan. Deze methode optimaliseert het gebruik van kleine celhoeveelheden voor immunologisch onderzoek naar T-celleukemie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar aan Dr. José Luis Daniotti voor de opmerkingen. We danken de assistentie aan Dr. J. Arturo Pimentel en het Laboratorio Nacional de Microscopía Avanzada-UNAM voor de verwerving van confocale beelden. I.M.-D. en T.M.V.C. werden ondersteund door subsidies 157634 en 253596 van het Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiología, A.C. T.M.V.-C. is ontvanger van een beurs (245192) van CONACYT. We danken ook de steun van het Red Temática Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

Perifere bloed van gezonde mannelijke donoren werd verkregen met informed consent en goedkeuring van de bio-ethiek Comité van de Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autònoma del Estado de Morelos. 1. Isolatie en activering van menselijke naïeve CD4 + T-cellen <ol><li> Verzamel 2 ml perifeer bloed verkregen van gezonde humane donoren een geïnformeerde instemming en verdun met 2 ml steriele PBS-EDTA (1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Voeg het verdunde bloed langzaam bovenop 3 ml sucrose-oplossing met 1,077 dichtheid zoals eerder beschreven 8. Opmerking: Differentiële migratie gedurende centrifugatie veroorzaakt door verschillen in dichtheid veroorzaakt erytrocyten volledig sedimenteren en een laag van lagere dichtheid mononucleaire cellen bovenstaande vormen. 2 ml perifeer bloed ongeveer 0,5 x 10 6 naïeve CD4 + T-cellen maken na purificatiop stappen. </li><li> Centrifugeer 30 minuten bij 250 xg bij 21 ° C (gebruik rotor rondbodem buizen met vaste hoek van 30 mm) zonder onderbreking op het verloop van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC&#39;s) te genereren. Na centrifugeren kan de PBMC duidelijk waargenomen als een witte ring. Verzamel de PBMC&#39;s met een pipet overgebracht naar steriele buizen voor het wassen. </li><li> Na drie wassingen met PBS-EDTA oplossing bij 250 xg gedurende 10 min over tot de zuivering van naïeve CD4 + T-cellen. Sorteer- en verschillende soorten zuivering kits beschikbaar voor dit doel. Gebruik bij voorkeur&gt; 1 x 10 7 PBMC voor zuivering. <ol><li> Zuiver naïeve CD4 + T-cellen door negatieve selectie met magnetische kralen. Voer negatieve selectie met anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, en CD235a (glycoforine A) antilichamen. Beoordelen van het percentage van de zuiverheid door het bepalen van CD4 + CD45RA + cellen door flage cytometrie. Opmerking: Eventueel overgaan tot incubatie van PBMCs nacht bij 37 ° C en 5% CO2 met een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml in 10 ml gesupplementeerd medium monocyt aanhechting bevorderen en verder met naïeve CD4 + T-cel zuivering. De efficiënte terugwinning van naïeve CD4 + T-cellen uit perifeer bloed hangt grotendeels af van de zuiveringsinstallatie. </li></ol></li><li> Bereid 24-well celkweekplaten door toevoeging van 250 ul per putje van PBS met 5 ug / ml anti-CD3 monoklonaal antilichaam en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij 37 ° C. Opmerking: Platen met 96 putjes kan worden gebruikt wanneer een kleiner aantal van naïeve CD4 + T-cellen worden gebruikt (bijvoorbeeld, 2 x 10 x 4 -1 10 5). </li><li> Verwijder de anti CD3 antilichaam verdunning van de 24 put of platen met 96 putjes en spoel de platen tweemaal met steriele 1x PBS. </li><li> Verdun de naïeve CD4 + T-cellen met&gt; 95% zuiverheid (CD4 +CD45RA +) tot een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml in advanced RPMI 1640 medium aangevuld met 3% foetaal runderserum (of RPMI gesupplementeerd met 10% serum), 2 mM glutamine en antibiotica (1 U / ml penicilline, 1 gg / ml streptomycine). Opmerking: Als ganglioside localisatie is vereist PBMC volgt hetzelfde protocol verdunning en stimulatie zoals hieronder beschreven. </li><li> Voeg 500 ul van de cel verdunning tot anti CD3 beklede putjes en niet-beklede putjes (controlecellen) in 24 wells plaat. Alternatief, voeg 100 ul van de cellen in de putjes van de plaat met 96 putjes. </li><li> Voltooi de stimuleringscondities van naïeve CD4 + T-cellen in anti CD3 gecoate wells door toevoeging van 1 ug / ml anti-CD28 antilichaam. </li><li> Houd de rustende CD4 + T-cellen als controle in de niet-beklede putjes zonder toevoeging van anti- CD28 antilichamen. Incubeer de rustende en geactiveerde CD4 + T-cellen gedurende 0 tot 72 uur onder normale omstandigheden van 37 °C en 5% CO2. </li><li> Om een adequate activatie verifiëren evalueren flowcytometrie de expressie van het CD69 vroege activatie marker (16 uur na activering) of CD25 late activatie marker (48 uur na activering) in rustende en geactiveerde naïeve CD4 + T-cellen geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO 2 in afwezigheid of aanwezigheid van anti CD3 / CD28-antilichamen 9,10. </li></ol> 2. Hechting van Rusten en Geactiveerde Naïve CD4 + T-cellen <ol><li> Steriliseren 12 mm rond dekglaasjes in een autoclaaf en belichting UV-licht gedurende ten minste 15 min. </li><li> Plaats dekglaasjes in steriele 24-well celkweek platen. Opmerking: Bij culturen met minder dan 1 x 10 5 cellen wordt bij voorkeur slide kamers gebruiken met aangepaste kleine putten dispersie van cellen in het dekglaasje te voorkomen. </li><li> Coat dekglaasjes (of schijfjeskamer) met 200 pl poly-L-lysine (MW 150-300 kDa) 0,1% (w / v) oplossing en incubeer gedurende 5 minuten bij room temperatuur (RT), te verwijderen en drogen gedurende ten minste 1 uur bij KT. </li><li> Meng zorgvuldig en het verzamelen van de rustende en geactiveerde naïeve CD4 + T-cellen van de 24-well platen. Tel de cellen en stel eventueel met vers medium gesupplementeerd met 1 x 10 5 cellen overbrengen naar de poly-L-lysine beklede dekglaasjes. Incubeer de cellen gedurende ten minste 6 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li></ol> 3. Het verzamelen en Fixatie van Rusten en Geactiveerde Naïve CD4 + T-cellen <ol><li> Verwijder voorzichtig het medium uit gekweekte rustende en geactiveerde naïeve CD4 + T-cellen. </li><li> Voeg 500 ul van RT steriel PBS langzaam. Opmerking: zorgvuldige toevoeging en verwijdering van oplossingen uit putten voorkomt het losmaken van cellen uit het dekglaasje. </li><li> Gooi de PBS en voeg nog eens 500 ul PBS om grondig te verwijderen voedingsbodems. </li><li> Fixeer de cellen door toevoeging van 500 pi gefilterde 4% paraformaldehyde (filtrantsoen verwijdert microdeeltjes die kunnen interfereren met microscopie analyse) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (bij voorkeur) of overnacht bij 4 ° C. Let op: Paraformaldehyde is een giftige en vluchtige verbinding. Het is bekend om een ​​menselijk carcinogeen. Gebruik voorzichtig met een geschikte veiligheidskabel protocol. </li><li> Verwijder het fixeermiddel en was ten minste tweemaal met PBS bij kamertemperatuur. </li><li> Naar de volgende stap of onderhoud van de putjes met 500 pl PBS bij 4 ° C gedurende enkele dagen tot kleuring. Opmerking: steriliteit tijdens dit proces helpt te voorkomen dat micro-organismen groei. </li></ol> 4. kleuring, Montage en Visualisatie door confocale microscopie <ol><li> Verwijder de PBS uit de putjes. Voeg 500 ul koude blokkerende buffer (1x PBS, 0,5% standaardkwaliteit runderserumalbumine, 1% foetaal bovien serum pH 7,4). Incubeer gedurende 20 min op ijs. </li><li> Verwijder de blokkering buffer voorzichtig en voeg de primaire antilichamen (anti gangliosiden GD3 kloon R24, GD2 kloon 14G2a),PE-geconjugeerd anti-CD25 en APC-geconjugeerd anti TCR en isotypen controles verdund in het blokkeren van buffer tot 2,5 ug / ml. </li><li> Incubeer 2 uur op ijs of overnacht bij 4 ° C. Opmerking: Slow orbitale agitatie de voorkeur. </li><li> Verwijder het antilichaam zorgvuldig en voeg langzaam 500 pl PBS. Herhaal dit twee keer. </li><li> Voeg de secundaire antilichamen (FITC geconjugeerd anti IgG3 voor R24 ​​anti GD3, Alexa Fluor 488-geconjugeerd of Alexa Fluor 647-geconjugeerd anti IgG2a voor 14G2a anti GD2) verdund in het blokkeren van buffer tot 0,1 ug / ml. </li><li> Incubeer gedurende 1 uur op ijs in het donker zonder schudden. </li><li> Was drie keer in PBS zoals beschreven in 4.4). Houd de putjes met PBS voldoende om de dehydratatie van monsters te voorkomen. </li><li> Voeg Hoechst vlek 333.258 verdund in PBS met 0,1 ug / ml. </li><li> Incubeer 15 min bij RT en verwijderen. Was drie keer in PBS. </li><li> Plaats de objectglaasjes op keukenpapier en voeg 20 ul bevestigingsoplossing (50% glycerol in PBS) of commerciële bevestigingsoplossings om te voorkomen dat vervagen en afschrikken uit monsters. </li><li> pick voorzichtig op het dekglaasje met fijne pincet en plaats het op de montage oplossing. Zorgen dat de zijde van het dekglaasje waarin cellen verbonden in contact met de oplossing. Sluit de dekglaasjes met nagellak en te analyseren met behulp van fluorescentie of confocale microscopie. </li></ol> 5. Isolatie van RNA <ol><li> Bereid anti CD3 antilichaam (5 ug / ml) beklede platen met 96 putjes. Incubeer 4 x 10 4 naïeve CD4 + T-cellen / putje in 100 gl aangevuld kweekmedium met anti CD28 antilichaam (1 ug / ml) op de stimulus te voltooien. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 0-72 uur. </li><li> Na verschillende post-activering keer plaats de cellen in een microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 500 pl PBS en centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de supernatant en voeg 1 ml TRIzol reagens. </li><li> Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en houdt het monster -8076; C gedurende ten minste 24 uur. Ga verder met de RNA-isolatie wanneer nodig. Opmerking: Het verlaten van het monster bij -80 ° C gedurende ten minste 24 uur verbetert RNA opbrengst. Ook het gebruik van handschoenen is essentieel om RNA afbraak door RNasen voorkomen. </li><li> Ontdooien monster door incubatie bij 37 ° C gedurende 2 min in een waterbad. </li><li> Voeg 200 ul chloroform en schud krachtig met de hand gedurende 30 seconden (tegen agressieve mengen van RNA te vermijden door vortexen). Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeer 15 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Herstel de waterige fase naar een nieuwe microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 500 ul isopropanol en draai de buis drie keer. </li><li> Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant door inversie. </li><li> Voeg 1 ml ijskoude 75% ethanol en centrifugeer 10 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Volledig gooi het supernatant en droog de RNA pellet door het verlaten van de dop van de buis geopend. Niete: Op dit punt de pellet niet duidelijk zichtbaar. Ga toch door. </li><li> Resuspendeer de pellet in 20 gl moleculair kwaliteit water. Bereken de concentratie en zuiverheid van de nucleïnezuren door het meten van 260 nm en 280 nm absorptie via NanoDrop. </li><li> Gaat zorgvuldig synthese van cDNA met behulp van elke conventionele reverse transcriptase kit en na het merk gebruikt protocol. Opmerking: Ongeveer 0,5-2 pg RNA wordt verkregen uit 4 x 10 4 naïeve CD4 + T-cellen. cDNA kan worden gesynthetiseerd vanuit 100 ng RNA en dat in real-time PCR reacties zonder de noodzaak van lage RNA ingang kits. </li></ol>

<ol><li>Mazzon, C., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+tango+to+quadrilla%3A+current+views+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse.</a> Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).</li>
<li>Hamann, D., Pa Baars,, Hooibrink, B., van Lier, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+human+CD4%2B+T-cell+population%3A+two+distinct+CD4%2B+T-cell+subsets+characterized+by+coexpression+of+CD45RA+and+CD45RO+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms.</a> Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).</li>
<li>Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSOM+%2F+QD-Based+Visualization+of+GM1+Serving+as+Platforms+for+TCR+%2F+CD3+Mediated+T-Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation.</a> Biomed Res Int. , 276498(2013).</li>
<li>Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNAS+Plus%3A+CD4+and+CD8+T+cells+require+different+membrane+gangliosides+for+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Procs+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation.</a> Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).</li>
<li>Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acids+in+the+brain%3A+gangliosides+and+polysialic+acid+in+nervous+system+development%2C+stability%2C+disease%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration.</a> Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).</li>
<li>Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+na%C3%AFve+Th+cells+increases+surface+expression+of+GD3+and+induces+neoexpression+of+GD2+that+colocalize+with+TCR+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters.</a> Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).</li>
<li>Müthing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLC+in+structure+and+recognition+studies+of+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids.</a> Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).</li>
<li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li>
<li>O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+of+surface+and+intracellular+protein+expression+by+T+cells+after+stimulation+in+the+presence+of+monensin+or+brefeldin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).</li>
<li>Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation%2C+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).</li>
<li>Marconi, S., Acler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2-like+IgM+autoreactivity+in+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients.</a> Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).</li>
<li>Park, J. E., Wu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+specificity+of+natural+killer+T+cells+against+GD3+ganglioside+and+identification+of+GM3+as+an+inhibitory+natural+killer+T-cell+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand.</a> Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).</li>
<li>Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disialoganglioside+GD3+is+released+by+microglia+and+induces+oligodendrocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis.</a> Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).</li>
<li>Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poliovirus+infection+blocks+ERGIC-to-Golgi+trafficking+and+induces+microtubule-dependent+disruption+of+the+Golgi+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex.</a> J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).</li>
<li>Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+apparatus+immunolocalization+of+endomannosidase+suggests+post-endoplasmic+reticulum+glucose+trimming%3A+implications+for+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control.</a> Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).</li>
<li>Yamashiro, S., Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%28GD3+synthase%29+gene+in+human+cancer+cell+lines%3A+high+level+expression+in+melanomas+and+up-regulation+in+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes.</a> Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).</li>
<li>Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+regulated+expression+of+9-O-acetyl+GD3+%28CD60b%29+and+7-O-acetyl-GD3+%28CD60c%29+during+differentiation+and+maturation+of+human+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes.</a> Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).</li>
<li>Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GD3%2C+a+prominent+ganglioside+of+human+melanoma.+Detection+and+characterisation+by+mouse+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De beschreven protocol kan worden gebruikt om gangliosiden of eiwitten te lokaliseren in celsuspensies van CD4 + T-cellen of andere immune cellen (bijvoorbeeld PMBCs, figuur 5) uitgaande van een klein aantal cellen. Door de geringe omvang van T-cellen en niet-hechtende eigenschappen, de verwerving van fluorescentie microscopische afbeeldingen leidt tot een slechte informatie of lage kwaliteit als de cellen niet correct nageleefd. Dit protocol gecombineerd...

De CD4 + T-cellen orkestreren de immuunrespons door hun effectorfuncties na activering door antigen presenterende cellen 1. De studie van de cellulaire mechanismen die gemoduleerd bij activering zorgt inzicht in een basisproces van immuunfunctie. Echter, de studie van naïeve CD4 + T-cellen worden gecompliceerd omdat zij een zeer kleine populatie van bloedcellen periferie 2. Door fluorescentiemicroscopie verscheidene rapporten de lokalisatie van verschillende moleculen die betrokken zijn bij CD4 + T-cel activatie, voornamelijk geassocieerde eiwitten naar de plasmamembraan 3 bestudeerd. De gangliosiden siaalzuur bevattende glycosfingolipiden en hoewel ze zijn uitgebreid bestudeerd in zenuwcellen wanneer zij overvloedig, andere cellen zoals immuuncellen ook aangeven gangliosiden met biologisch relevante functies 4,5. We eerder gemeld that tijdens activatie van naïeve CD4 + T-cellen er een opregulatie van de α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 synthase) en de GM2 / GD2 synthase induceren dat het aanzienlijke oppervlak van neoexpression GD2 en GD3 ganglioside opregulatie van 6. Nader onderzoek van GD3, GD2 en andere gangliosiden immuuncellen dient een eiwit gebaseerde gedeeltelijke weergave van immuunfunctie vullen. Gewoonlijk is de studie van ganglioside expressie gebaseerd op technieken zoals dunnelaagchromatografie (TLC) 7, maar deze techniek niet de ruimtelijke lokalisatie van gangliosiden toe op het plasmamembraan of in subcellulaire compartimenten beperken biologische analyse. In dit werk beschrijven we een protocol voor de antilichaam gemedieerde identificatie en lokalisatie van GD3 en GD2 gangliosiden in naïeve humane CD4 + T-cellen en PBMC&#39;s na anti-CD3 / anti-CD28 activatie. Met dit protocol is iook mogelijk om het gen en moleculaire expressie van gangliosiden analyseren een gering aantal cellen in suspensie met beeldopname hoogwaardige 6, gezien de beperkte omvang van lymfocyten (9 um).

<table><tbody><tr><td>Advanced RPMI 1640&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>Aangevuld met 3% FBS</td></tr><tr><td>mouse anti human CD3 antibody</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human CD28 antibody</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human GD3&nbsp; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human GD2 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53831</td><td>14G2a clone</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl;tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl;tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 333258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sorting&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek chamber slide system</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Upright BX61WI and IX81&nbsp;</td></tr><tr><td>Forward sequence primer GD3 synthase</td><td>5&acute;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse sequence primer GD3 synthase</td><td>5&acute;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Forward sequence primer GM2/GD2 synthase</td><td>5&acute;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase</td><td>5&acute;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr></tbody></table>

bereiding van cd4<sup&gt; +</sup&gt; t cellen voor analyse van gd3 ganglioside gd2 en membraanexpressie door microscopie

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

De hierin beschreven voor activering van naïeve CD4 + T-cellen methoden in suspensie en de hechting in dekglaasjes confocale microscopie analyse kan de ruimtelijke lokalisatie en visualisatie van gangliosiden die deze CD4 + T-cel activatie, die complement expressieprofielen experimenten zoals flowcytometrie, Western blotting of real-time PCR. De kwantificering van ganglioside expressie door middel van flowcytometrie en hun cellulaire lokalisatie door middel van microscopie kan worden verkregen door het gebruik van anti-ganglioside antilichamen met hoge affiniteit en specificiteit. Desalniettemin, een goede behandeling van cellen in suspensie omvat de behandeling van kweekplaten de nodige hechting vereist voor fluorescentie of confocale microscopie verwerving promoten. In dit werk beschrijven we een protocol voor het bepalen en GD3 ganglioside GD2 expressie en colokalisatie met de TCR in naïeve CD4 + T-cel activatie. Ook real-time PCR experimenten met &lt;40.000 cellen beschreven voor het bepalen van de GD3 en GM2 / GD2 synthase genen, waaruit blijkt dat gen analyse experimenten kunnen worden uitgevoerd met een gering aantal cellen en zonder dat extra lage input RNA kits.

De in dit manuscript beschreven protocol maakt een goede kwaliteit van gekweekte en gehecht rustende en geactiveerde humane naïeve CD4 + T-cellen (Figuur 1). De geactiveerde CD4 + T-cellen tonen de karakteristieke proliferatieve profiel (Figuur 1B) ten opzichte van de rusttoestand (figuur 1A). De late activatie CD25 marker is nuttig voor de efficiënte activering bij 72 uur waargenomen door confocale microscopie <str...

We beschrijven een standaard protocol antilichaam kleuring voor microscopie aan het membraan expressie en localisatie van gangliosiden in rustende en geactiveerde humane naïeve CD4 + T-cellen te bepalen. Ook beschreven zijn real-time PCR experimenten met &lt;40.000 cellen die geen extra lage input RNA kits vereisen.

Bereiding van CD4<sup&gt; +</sup&gt; T cellen voor analyse van GD3 ganglioside GD2 en Membraanexpressie door Microscopie

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Het algemene doel van dit protocol is het demonstreren van de bereiding van een CD4+T-cel-suspensie voor kleuring om de lokalisatie van GD3- en GD2-gangliosiden op het celoppervlak te visualiseren met een gering aantal cellen. Deze methode maakt de visualisatie van membraanglycolipiden in een klein aantal kleine suspensiecellen mogelijk, zoals in het geval van mononucleaire cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de expressie en lokalisatie van gangliosiden in kleine hoeveelheden CD4+T-cellen kan worden geëvalueerd door het monstergebruik te optimaliseren.De implicaties van deze techniek kunnen worden uitgebreid naar onderzoek en diagnostiek van sommige typen T-celleukemie. Zoals wij hebben vastgesteld, reguleren sommige leukemiecellijnen de expressie van GD3- en GD2-gangliosiden opwaarts. Begin met het verdunnen van twee milliliter perifeer bloed van gezonde menselijke donoren met twee milliliter steriele PBS EDTA.Breng het verdunde bloed langzaam aan op drie milliliter sucrose-oplossing met een dichtheid van 1,077. Centrifugeer vervolgens gedurende 30 minuten bij 250 ×g bij 21 °C zonder remvertraging om de gradiënt van perifere bloedmononucleaire cellen te genereren. Na centrifugatie kunnen de PBMC's duidelijk worden waargenomen als een witte ring.Verzamel de PBMC's met een pipet en breng deze over naar een steriele buis voor het wassen. Nadat de cellen zijn gewassen met PBS EDTA, worden naïeve CD4+ T-cellen gezuiverd via negatieve selectie met magnetische kralen met behulp van een commercieel verkrijgbare kit. Zodra een populatie CD4+ T-cellen met een zuiverheid van meer dan 95% is verkregen, worden 24-wells celkweekplaten voorbereid door 250 µL van 5 µg/mL anti-CD3 monoklonaal antilichaam in PBS aan elke well toe te voegen.Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende ten minste twee uur. Verwijder na de incubatie de anti-CD3 antilichaamverdunning van de platen en was deze twee keer met steriele 1x PBS. Verdun vervolgens de naïeve CD4+T-cellen met aangevuld advanced RPMI 1640 medium tot een dichtheid van 1 × 10⁶ cellen per milliliter.Voeg vervolgens 500 µL verdunde cellen toe aan de met anti-CD3 gecoate putjes van de 24-wells plaat. Voltooi daarna de stimulatie van naïeve CD4+T-cellen in de met anti-CD3 gecoate putjes door 1 µg/mL anti-CD28-antilichaam toe te voegen. Incubeer de rustende en geactiveerde CD4+T-cellen gedurende 0 tot 72 uur bij 37 °C en 5% CO2.Nadat de vastgestelde incubatietijd is verstreken, worden de rustende en geactiveerde naïeve CD4+T-cellen uit de 24-wells platen verzameld. Voer een celtelling uit en verdun, indien nodig, de cellen met vers aangevuld medium tot een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter. Breng 500 µL van de verdunde cellen aan in de wells van een 24-wells plaat met poly-L-lysine gecoate dekglasjes of in een objectglaskamer en incubeer deze gedurende minimaal zes uur bij 37 °C en 5% CO2.Na de incubatie zullen de CD4+T-cellen aan de dekglasjes zijn gehecht. Verwijder voorzichtig het medium uit de wells en voeg vervolgens langzaam 500 microliters steriele PBS toe. De toevoeging van PBS tijdens het wassen moet zeer voorzichtig gebeuren, vooral bij het prepareren van slide chambers met minder dan 50 000 cellen per well.Zuig de PBS af en voeg nog eens 500 microliters PBS toe aan de wells om het cultuurmedium grondig te verwijderen. Nadat alle PBS is verwijderd, voegt u 500 microliters gefiltreerd 4%paraformaldehyde toe en incubeert u dit 30 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te fixeren. Verwijder na fixatie het fixatief en was minstens twee keer met PBS.Indien gewenst kan de plaat gedurende enkele dagen bij vier graden Celsius worden bewaard met 500 µL PBS in elke well. Verwijder eerst de PBS van de gefixeerde cellen en voeg 500 µL koude blokkeringsbuffer toe. Incubeer gedurende 20 minuten op ijs.Tijdens de incubatie is het cruciaal om de plaat niet krachtig te schudden, aangezien schudden de cellen zal doen loslaten. Aspireer voorzichtig de blokkeringsbuffer en voeg blokkeringsbuffer toe met 2,5 µg/mL van een van de primaire antilichamen of PE-geconjugeerde anti-CD25, APC-geconjugeerde anti-TCR, of een isotypecontrole. Incubeer gedurende twee uur op ijs en bescherm tegen licht, of overnacht bij 4 °C.Verwijder na de incubatie voorzichtig de antilichaamoplossing en voeg langzaam 500 µL PBS toe. Voeg vervolgens de juiste secundaire antilichamen toe, verdund in blokkeringsbuffer tot 0,1 µg/mL. Bescherm tegen licht en incubeer gedurende één uur op ijs, waarbij u er zorg voor draagt dat er niet wordt geschud.Na drie keer wassen in PBS zoals voorheen, voegt u Hoecht-kleuring toe, verdund in PBS tot 0,1 micrograms per milliliter, en incubeert u dit gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Plaats de gewassen objectglaasjes vervolgens op een papieren handdoek en voeg 20 microliters monteermiddel of een commercieel monteermiddel toe om vervaging en quenching van de fluorescentie te voorkomen. Pak tot slot met een fijne pincet een dekglas op, draai dit om en plaats het bovenop het monteermiddel, zodat de zijde van het dekglas waar de cellen aan vastzitten in contact komt met de oplossing.Seal de dekglasjes af met nagellak en analyseer deze met fluorescentie- of confocale microscopie. Deze afbeelding toont brightfield-visualisatie van gefixeerde CD4+T-cellen 72 uur na activatie. Validatie van efficiënte activatie na kleuring wordt beoordeeld met behulp van anti-CD25-antilichaam, weergegeven in rood.Het GD3-ganglioside is intracellulair en op het celoppervlak van geactiveerde CD4+T-cellen gelokaliseerd, zoals vastgesteld door kleuring met anti-GD3-antilichaam, weergegeven in het groen. GD3, opnieuw weergegeven in het groen, colokaliseert niet met de TCR, wederom weergegeven in het rood, zoals vastgesteld met kleuring met anti-GD3- en anti-TCR-antilichamen. Het GD2-ganglioside colokaliseert echter wel met de TCR en CD4+T-cellen, zoals vastgesteld door kleuring met anti-GD2, weergegeven in het groen, en anti-TCR-antilichaamkleuring, weergegeven in het rood.De GD3-ganglioside-kleuring laat de intracellulaire en celoppervlak-lokalisatie zien in een subset van geactiveerde PBMC's. De GD2-ganglioside-kleuring laat daarentegen intracellulaire en celoppervlak-lokalisatie zien in alle geactiveerde PBMC's. Na deze procedure van adhesie en manipulatie van de CD4+T-cellen kunnen andere methoden, zoals intracellulaire compartimentkleuring, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de specifieke intracellulaire lokalisatie of verwerking van gangliosiden.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een klein aantal CD4+T-cellen moet hanteren en hechten om fluorescentiemicroscopiebeelden van hoge kwaliteit te verkrijgen voor het analyseren van de ganglioside-expressie.

preparation-cd4-t-cells-for-analysis-gd3-gd2-ganglioside-membrane

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze procedure toont de zuivering en in vitro expansie van antigeen specifieke CD4 + T-cellen uit heel het perifere bloed en de visualisatie met behulp van MHC klasse II tetrameren. Tetrameren toestaan ​​dat de directe visualisatie van T-cellen met een enkel antigen specificiteit en gedefinieerd MHC klasse II beperking.

Visualiseren van antigeen specifieke CD4 + T-cellen met behulp van MHC klasse II tetrameren

This video demonstrates the in vitro differentiation of granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor or GM-CSF-producing T helper cells (THGM). Isolated naïve T cells are stimulated for differentiation into THGM, which is confirmed by detecting high intracellular GM-CSF production and a low expression of other T helper cell-specific cytokines.

An In Vitro Technique to Differentiate GM-CSF Producing T Helper Cells from Na&iuml;ve T Cells

This video demonstrates the screening of immunomodulatory compounds via fluorescent-based assay. Transgenic mouse-derived T lymphocytes with green fluorescent protein expression cassettes are treated with these compounds. The enhanced and reduced GFP signals enable the identification of the compounds' stimulatory and inhibitory effects, respectively.

A Fluorescence-Based Assay Using Engineered Lymphocytes for Screening Immunomodulatory Compounds

This video demonstrates an assay to analyze antigen-specific CD8+ T cells in different cell cycle stages. Fluorescently-labeled viable cells are selected using flow cytometry, and the cells in the different cell cycle stages are identified by their DNA content using antibodies against cell proliferation-associated nuclear protein and a nucleic acid stain.

An Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8+ T Cells

Adenovirale genoverdracht in naïeve CD4 T-cellen met transgene expressie van de Coxsackie adenovirus receptor kan de moleculaire analyse van regulatoire T...

Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie

Macrofagen zijn plastic cellen van het hematopoietische systeem die een cruciale rol spelen in beschermende immuniteit en homeostase. In dit rapport beschrijven we geoptimaliseerde in vitro technieken voor het fenotypisch en functioneel karakteriseren van transplantatie-infiltrerende regulerende macrofagen die zich in het getransplanteerde orgaan verzamelen onder tolerogene omstandigheden.

Functionele karakterisering van regulerende macrofagen die de transplantaatreactieve immuniteit verhinderen

We beschrijven hier een isolatiemethode om humane endocervicale intra-epitheliale lymfocyten te verkrijgen voor de analyse van intra-epitheliale gamma delta T-cellen. Dit protocol kan worden uitgebreid voor de zuivering van endocervicale gamma delta T-cellen door middel van magnetische kralen of door celsortering.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Human Endocervicale Gamma Delta T-cellen

Dit protocol geeft een analyse van de macrofage subpopulaties in het centraal zenuwstelsel van het volwassen muis door middel van flowcytometrie en is nuttig voor het bestuderen van meerdere markers die door deze cellen worden uitgedrukt.

Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry

Gangliosiden zijn siaalzuurhoudende glycosfingolipiden die bijzonder overvloedig aanwezig zijn in de hersenen. Hun amfipathische aard vereist organische /waterige extractie- en zuiveringstechnieken om optimaal herstel en nauwkeurige analyses te garanderen. Dit artikel biedt een overzicht van analytische en preparatieve schaal ganglioside extractie, zuivering en dunne laag chromatografie analyse.

Ganglioside extractie, zuivering en profilering

Deze studie presenteert een protocol van live-3D-cel immunocytochemie toegepast op een pediatrische diffuse midline glioom cellijnlijn, nuttig om in real-time de expressie van eiwitten op het plasmamembraan te bestuderen tijdens dynamische processen zoals 3D-celinvasie en migratie.

Live-3D-cel immunocytochemie Assays van pediatrische diffuse middellijn glioom

Hier presenteren we het protocol voor de stapsgewijze reconstitutie van synthetische antigeen-presenterende cellen met behulp van Bead-Supported Lipid Bilayers en hun gebruik om de synaptische output van geactiveerde T-cellen te ondervragen.

Voorbereiding van door kralen ondersteunde lipide bilayers om de deeltjesoutput van T-cel immuunsynapsen te bestuderen

Leer hoe u CD4+ T-cellen prepareert voor microscopische analyse van GD3- en GD2-gangliosiden op het membraan. Deze methode optimaliseert het gebruik van kleine celhoeveelheden voor immunologisch onderzoek naar T-celleukemie.

Bereiding van CD4

Meer video's verkennen