In Vitro Registratie van Mesenteriale afferente zenuw activiteit in het Muis jejunale en Colonic Segmenten

Het algemene doel van deze techniek is om in vitro de activiteit van splanchnische afferente zenuwen te registreren vanuit een enkel jejunale of colone zenuwbundel in reactie op ramp-distensies en de applicatie van verbindingen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neurowetenschappen, zoals of afferente zenuwen die het gastro-intestinale tractus voorzien, hypersensibiliseerd of desensibiliseerd zijn tijdens verschillende ziektestadia. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het de registratie van zenuwontladingen in vitro mogelijk maakt en dat het toelaat de zenuwactiviteit te kwantificeren zonder modulatie of input van het centrale zenuwstelsel.

De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de therapie of diagnose van verschillende pijnsyndromen, zoals het prikkelbare darmensyndroom, aangezien zenuwsensitisatie een belangrijke rol speelt in de pathogenese. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de dissectie van zenuwbundels en de single unit-analyse van het geregistreerde signaal een aanzienlijke hoeveelheid training vereisen. Om deze procedure te starten, wordt de geofferde muis in rugligging geplaatst.

Voer een abdominale middenlijnincisie door de huid en de abdominale spierlaag uit met een scalpel, reikend van het xiphoïdproces tot het schaambeen. Spoel vervolgens de buikholte met koude Krebs-oplossing om te voorkomen dat de intra-abdominale weefsels uitdrogen. Exciteer daarna snel het gehele jejunum met een schaar door ongeveer 20 centimeter van de dunne darm te verwijderen, beginnend direct vanaf de duodeno-jejunale flexuur.

Zorg ervoor dat de omliggende structuren niet beschadigd raken en houd het mesenterium van de darm, waarin de jejunale bloedvaten en afferente zenuwen zich bevinden, intact. Plaats het weggesneden jejunum vervolgens in koude Krebs-oplossing op ijs, terwijl het continu wordt geoxygeneerd met Carbigen. Snijd het jejunum daarna in lussen van ongeveer drie centimeter lang.

Lokaliseer het mesenteriale bundel met de vaten en de splanchnicuszenuw nabij het midden van de betreffende lus om de montage van de lus in de registratiekamer te vergemakkelijken. Spoel vervolgens elk segment met Krebs-oplossing met behulp van een stompe katheter om de luminale inhoud en het chymus te verwijderen, aangezien deze spijsverteringsenzymen bevatten die de verslechtering van het weefselmonster in vitro zullen versnellen. Selecteer daarna een segment voor het meten van de afferente zenuwactiviteit en plaats dit in de registratiekamer die is voorzien van een siliconen elastomeerlaag.

Houd de temperatuur van de Krebs-oplossing in de meetkamer op 34 °C. Monteer vervolgens het jejunumsegment in het organenbad, zodanig dat het orale uiteinde is verbonden met de spuitdriver die de luminale flow levert en het aborale uiteinde is verbonden met de uitstroom. Rek het segment lichtjes uit, maar zorg ervoor dat er geen overmatige spanning wordt uitgeoefend.

Bevestig beide uiteinden stevig met zijden ligaturen aan de in- en uitlaatpoorten. Bevestig vervolgens de spuitpomp aan het orale uiteinde en perfundeer het jejunale segment intraluminaal met Krebs-oplossing met een snelheid van 10 milliliters per uur. Zet het mesenterium van het gemonteerde darmsegment plat vast tegen de onderste laag van het siliconen elastomeer.

Rek vervolgens het mesenterium uit om de visualisatie van het mesenteriale bundel te optimaliseren. Voer daarna een test uit op ramp-distensie door de uitlaatpoort te sluiten totdat de intraluminale druk van het darmsegment 60 millimeters kwik bereikt, om te verifiëren dat er geen intraluminale Krebs-oplossing lekt uit het gemonteerde segment. Observeer een gelijkmatige stijging van de intraluminale druk zonder onderbrekingen.

Verwacht kleine contracties van het segment tijdens de initiële distensiefase. Indien nodig kan de peristaltische activiteit worden geblokkeerd door één micromol van de L-type calciumkanaalblokker nifedipine aan de Krebs-oplossing toe te voegen. Begin onder een stereomicroscoop voorzichtig met het verwijderen van het vetweefsel uit het mesenterium door dit zachtjes weg te trekken met twee kleine pincetten, waarbij u er goed op let dat de vaten en de afferente zenuw die in het vetweefsel zijn ingebed niet beschadigd raken.

Begin met het afpellen van het vetweefsel op enige afstand van het jejunum om beide bloedvaten in het mesenteriale pakket bloot te leggen. Identificeer de afferente jejunale zenuw tussen beide vaten als een dunne witte draad ingekapseld in het adipose weefsel. Dissekeer deze vervolgens meer proximaal richting het jejunum door het vetweefsel voorzichtig met een pincet weg te pellen.

Dissekeer vervolgens de jejunale mesenterische zenuw van het segment door het aan de zenuw klevende vetweefsel te verwijderen. Transecteer de zenuw met een scherpe weefselschaar. Indien nodig kan het resterende vet en bindweefsel, alsovel als de epineurale schede, voorzichtig worden weggetrokken.

Laat bij deze procedure de punt van de zuigelektrode met behulp van een micromanipulator in het organenbad zakken. Aspireer vervolgens voorzichtig wat Krebs-oplossing uit het organenbad, zodat de punt van de elektrode ondergedompeld is in de Krebs-oplossing. Zorg ervoor dat de Krebs-oplossing de draadelektrode binnenin de zuigelektrode bedekt.

Plaats vervolgens de punt van de zuigelektrode direct naast het doorgesneden afferente zenuwbundel en zuig de doorgesneden zenuwbundel over de gehele lengte in de capillaire. Beweeg de punt van de elektrode naar het vetweefsel en aspireer dit met de zuiger in de glazen capillaire, waardoor de zenuw mechanisch in de capillaire wordt afgesloten van de inhoud van het organenbad. Het adequaat afsluiten van de glazen capillaire van de registratiekamer door een deel van het omringende vetweefsel in de capillaire te aspireren, is cruciaal om de overbodige achtergrondruis te minimaliseren die uiteindelijk de definitieve analyse zou belemmeren.

Om de registratie van afferente zenuwactiviteit te verifiëren, wordt een toename in afferente vuring geïnduceerd via ramp-distensie door de uitlaatpoort te sluiten, wat leidt tot een geleidelijke stijging van de druk in het darmsegment. Voer het gewenste experimentele protocol alleen uit wanneer drie opeenvolgende ramp-distensies een reproduceerbare multi-unit ontlading opleveren. Stabiliseer na de zenuwisolatie de preparatie gedurende 15 minuten om een gestage spontane afferente zenuwactiviteit te verkrijgen voordat de feitelijke experimenten worden uitgevoerd.

Hier wordt een schematische weergave getoond van verschillende afferente vezeleenheden op basis van hun mechanosensitieve profiel. Vezels met een lage drempelwaarde vertonen voornamelijk een verhoogde zenuwactiviteit bij lage distensiedrukken, wat resulteert in een LT-percentage van meer dan 55%. Eenheden met een hoge drempelwaarde vertonen daarentegen alleen een toename in de vuursnelheid bij nociceptieve drukken. Vezels met een breed dynamisch bereik vertonen een geleidelijke toename van de zenuwactiviteit gedurende de gehele distensie, terwijl mechanisch ongevoelige vezels niet reageren op toenemende distensiedrukken.

Deze figuur toont de ontlading van de mesenteriale afferente zenuw bij wilde-type muizen tijdens een hellende distensie. Let op dat bij het bifasische distensieprofiel de initiële stijging van de zenuwontlading wordt veroorzaakt door vezels met een lage drempelwaarde en een breed dynamisch bereik, terwijl vezels met een hoge drempelwaarde en een breed dynamisch bereik bijdragen aan de tweede toename van de ontlading. Zodra de techniek onder de knie is, kunnen de isolatie van de jejunale zenuw en de initiële baseline-registratie in minder dan een uur worden voltooid indien correct uitgevoerd.

Er is meer tijd nodig bij het bestuderen van het effect van verbindingen die in het organenbad worden toegediend. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een goed gestandaardiseerde aanpak te hanteren, zoals het consistent identificeren van hetzelfde segment voor alle experimenten. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals de isolatie van dorsale wortelganglia met daaropvolgende calciumimaging, worden uitgevoerd om vast te stellen welke relaisstations in het gastro-intestinale zenuwstelsel betrokken zijn bij de pathogenese van verschillende ziekten.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek onderzoekers in het vakgebied van de neurowetenschappen de weg vrijgemaakt om de pathogenese van verschillende pijnsyndromen in gastro-intestinaal onderzoek te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u jejunale afferente zenuwen uit het gastro-intestinale tract van de muis isoleert en hoe u de activiteit hiervan registreert tijdens ramp-distensies.