Bepaling van de Zeta Potentiële via nanodeeltjes Translocation Snelheden door een Tunable Nanopore: Met behulp van DNA-gemodificeerde deeltjes als een voorbeeld

Het algemene doel van deze procedure is om de oppervlaktechemie van nanodeeltjes te karakteriseren met behulp van tunable resistent post sensing, of TRPS, en de zetapotentiaal van het materiaal te bepalen. Dit wordt gedemonstreerd door het karakteriseren van DNA-gemodificeerde nanodeeltjes. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen bij de karakterisering van nanomaterialen en de ontwikkeling van bioassays.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat u een analyse per individueel deeltje kunt uitvoeren. Elk signaal van een DNA-deeltje wordt vertaald naar een meting van het zetapotentieel, waardoor een volledig beeld wordt verkregen van het geanalyseerde monster. De oudste methode kon inzicht bieden in de karakterisering van materialen.

Het kan ook worden toegepast op andere toepassingen, zoals de ontwikkeling van bioassays voor de detectie van cellen, virussen, DNA en eiwitten. Over het algemeen zullen personen die nog niet bekend zijn met deze methode moeite hebben, omdat het niet simpelweg een kwestie is van het monster injecteren en vervolgens op het antwoord wachten. Er is een zekere mate van input van de wetenschapper vereist.

Om deze procedure te starten, vortex de met streptavidine gecoate deeltjes gedurende 30 seconden en Sonicate deze vervolgens twee minuten bij 80 watt om monodispersiteit te waarborgen. Verdun de met streptavidine gecoate deeltjes één op honderd in PBST-buffer om een uiteindelijke concentratie van 1 × 10⁹ deeltjes per milliliter te verkrijgen. Vortex de deeltjes daarna gedurende 30 seconden.

Op basis van een bindingscapaciteit van 4.352 picomols per milligram bij de juiste concentratie DNA ten opzichte van de particles voor resulterende concentraties van 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 en 210 nanomolar. Nadat de monsters 10 seconden zijn gevortext, worden deze gedurende 30 minuten op een rotatiewiel bij kamertemperatuur geplaatst om het DNA via een streptavidine-biotine-interactie aan de oppervlakken van de particles te laten binden. Zodra het gevangen DNA is toegevoegd en is geïncubeerd met de particles, wordt het overtollige DNA en de oplossing verwijderd via magnetische scheiding door de monsters gedurende 30 minuten op een magneetrek te plaatsen.

Verwijder vervolgens het supernatant, waarbij u voorzichtig bent om de nieuw gevormde cluster van partikels, die zich het dichtst bij de magneet bevindt, niet te verstoren. Vervang het supernatant daarna door hetzelfde volume verse PBST-buffer. Voeg nu de benodigde hoeveelheid target-DNA aan elk monster toe om ervoor te zorgen dat de maximaal mogelijke binding van het target is bereikt.

Vortex de monsters gedurende 10 seconden. Plaats ze vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur op het rotatiewiel. Zodra de hybridisatie is voltooid, wordt het overtollige target-DNA verwijderd via magnetische scheiding door de monsters 30 minuten op het magnetische rek te plaatsen.

Verwijder vervolgens het supernatant, waarbij u er op let dat u de nieuw gevormde cluster van deeltjes, die zich het dichtst bij de magneet bevindt, niet verstoort. Vervang daarna het supernatant door hetzelfde volume verse PBST-buffer. Nadat de voorgaande stappen voor dubbele monsters zijn herhaald, worden de monsters gedurende 16 uur op een rotatiewiel bij kamertemperatuur geplaatst om de hybridisatietijden van DNA te onderzoeken.

Sluit op dit punt een TRPS-instrument aan op een computersysteem met de geïnstalleerde software. Meet met een schuifmaatschroef de afstand tussen de buitenkant van twee parallelle kaken. Typ de afstand in het veld 'stretch' in het tabblad instrumentinstellingen en klik onder het tabblad op 'calibrate stretch'.

Plaats vervolgens zijdelings een polyurethaan nanoporemembraan van de juiste maat voor analyse in de klemmen, met het nanopore-ID-nummer naar boven gericht. Rek vervolgens de klemmen uit tot de voor de analyse vereiste rekmeting met behulp van de rekinstelhendel aan de zijkast van het instrument. Plaats 80 µL PBST-buffer in de onderste vloeistofcel onder de nanopore en zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn die de meting kunnen beïnvloeden.

Klik nu de bovenste vloeistofcel op zijn plaats en voeg 40 µL buffer toe, waarbij u er zeker van bent dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Plaats vervolgens een kooi van Faraday over het systeem en breng een externe druk aan zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat er 40 µL van de kalibratiepartikels in de bovenste vloeistofcel zijn geplaatst, voert u een TRPS-meting uit bij drie toegepaste voltages.

Pas de spanning aan door op de plus- en minknoppen op de spanningsschaal in het tabblad instrumentinstellingen van de software te klikken. Controleer of de drie spanningen de juiste achtergrondstromen opleveren. Controleer daarnaast of de kalibratiepartikels bij de gemiddelde spanning een gemiddelde blokkadergrootte van ten minste 0,3 nanoamperes produceren.

Zodra de in het tekstprotocol beschreven condities zijn bereikt, start u de run door op start te klikken in het tabblad voor gegevensverwerving van de software. Klik om de meting te voltooien op stop in het tabblad voor gegevensverwerving en sla het gegevensbestand op. Spoel het systeem door de kalibratiepartikels meerdere keren te vervangen door 40 µL PBST-buffer in de bovenste vloeistofcellen.

Pas vervolgens verschillende drukken toe totdat er geen blokkadegebeurtenissen meer voorkomen, om er zeker van te zijn dat er geen resterende deeltjes en geen kruiscontaminatie aanwezig zijn. Zodra de juiste basisstroom is bereikt, vervangt u het elektrolyt in de bovenste vloeistofcel door 40 µL monster. Start de monsteranalyse door op start te klikken in het tabblad voor gegevensverwerving.

Registreer minimaal 500 deeltjes en zorg dat de looptijd minimaal 30 seconden bedraagt. Klik om de meting te voltooien op stop in het tabblad voor gegevensacquisitie en sla het gegevensbestand op. Hier wordt een voorbeeld getoond van de analyse van de grootte en het zeta-potentieel van streptavidine-gecoate deeltjes zonder modificaties en streptavidine-gecoate deeltjes waarvan het oppervlak is verzadigd met enkelstrengs DNA.

Hoewel beide monsters een vergelijkbare grootte hadden, was het zetapotentieel significant verschillend en veel groter wanneer DNA op het partikeloppervlak was gefunctionaliseerd. De grootte- en zetapotentieelgegevens voor monsters met de laagste en hoogste concentraties DNA die gehybridiseerd waren aan de streptavidine-gecoate partikels worden hier weergegeven. Er is een grotere waarde voor het zetapotentieel geregistreerd voor partikels die gehybridiseerd waren met een hogere DNA-concentratie.

Hier wordt de verandering in zetapotentieel weergegeven die is gemeten voor alleen de capture probe DNA, een volledig complementair DNA-doelwit, een DNA-doelwit met binding in het midden, een DNA-doelwit met binding aan het uiteinde en een DNA-doelwit met een overhang. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in 20 minuten worden uitgevoerd, mits dit correct gebeurt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken een nanopore grondig te wassen tussen elke kalibratie en elk monster om kruiscontaminatie tussen monsters te voorkomen en verstopping van de nanopore te vermijden.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van biosensoren om eiwit-eiwit- en eiwit-DNA-interacties in multiplex-assays te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het zetapotentieel kunt bepalen met behulp van TRPS en hoe u DNA-gemodificeerde deeltjes voor bioassays kunt prepareren.