Bepaling van de Zeta Potentiële via nanodeeltjes Translocation Snelheden door een Tunable Nanopore: Met behulp van DNA-gemodificeerde deeltjes als een voorbeeld
26 oktober 2016
Hier gebruiken we een polyurethaan afstembare nanopore geïntegreerd in een weerstandsbelasting puls detectie techniek nanodeeltjes oppervlaktechemie gekenmerkt via de meting van het translocatie snelheden, die kunnen worden gebruikt om het zeta potentieel van individuele nanodeeltjes bepalen.
Het algemene doel van deze procedure is om de oppervlaktechemie van nanodeeltjes te karakteriseren met behulp van instelbare weerstandspost-sensing, of TRPS, en het zetapotentieel van het materiaal te bepalen. Dit wordt gedemonstreerd door DNA-gemodificeerde nanodeeltjes te karakteriseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de karakterisering van nanomaterialen en de ontwikkeling van bioassay.
Het grote voordeel van deze techniek is dat je deeltjes voor deeltjes kunt analyseren. Elk DNA-deeltje signaal wordt vertaald naar een zetapotentiaal meting, wat een compleet beeld geeft van het monster dat wordt geanalyseerd. De oudste methode kan inzicht geven in de karakterisering van materialen.
Het kan ook worden toegepast op andere toepassingen, zoals de ontwikkeling van bioassay voor de detectie van cellen, virussen, DNA en eiwitten. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het niet eenvoudig is om het monster in te spuiten en vervolgens op het antwoord te wachten. Er is enige inbreng van de wetenschapper nodig.
Om deze procedure te beginnen, vortex streptavidine gecoate deeltjes gedurende 30 seconden voordat je ze twee minuten soniceert bij 80 watt om monodispersiteit te garanderen. Verdun de streptavidine gecoate deeltjes een op honderd in PBST buffer om een resulterende concentratie van een maal tien tot de negende deeltjes per milliliter te bereiken. Vervolgens vortex de deeltjes gedurende 30 seconden.
Gebaseerd op een bindingscapaciteit van 4.352 picomolen per milligram bij de juiste concentratie DNA naar de deeltjes voor resulterende concentraties van 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 en 210 nanomolair. Nadat je de monsters 10 seconden hebt gevortext, plaats ze op een roterend wiel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om het DNA toe te laten binden aan de deeltjesoppervlakken via een streptavidine-biotine interactie. Zodra het gevangen DNA is toegevoegd en geïncubeerd met de deeltjes, verwijder je het overtollige DNA en de oplossing via magnetische scheiding door de monsters 30 minuten op een magnetisch rek te plaatsen.
Vervolgens verwijder je het supernatant, zorg ervoor dat je de nieuw gevormde cluster deeltjes, het dichtst bij de magneet, niet verstoort. Vervolgens vervang je het supernatant door hetzelfde volume verse PBST-buffer. Voeg nu de vereiste hoeveelheid doel-DNA toe aan elk monster om ervoor te zorgen dat de maximaal mogelijke doelbinding is bereikt.
Vortex de monsters gedurende 10 seconden. Plaats ze vervolgens 30 minuten op het roterende wiel bij kamertemperatuur. Zodra de hybridisatie voltooid is, verwijder je het overtollige doel-DNA via magnetische scheiding door de monsters 30 minuten op het magnetische rek te plaatsen.
Vervolgens verwijder je het supernatant, zorg ervoor dat je de nieuw gevormde cluster deeltjes, het dichtst bij de magneet, niet verstoort. Vervolgens vervang je het supernatant door hetzelfde volume verse PBST-buffer. Nadat je de vorige stappen hebt herhaald voor dubbele monsters, plaats je de monsters op het roterende wiel bij kamertemperatuur gedurende 16 uur om DNA-hybridisatietijden te onderzoeken.
Op dit punt sluit je een TRPS-instrument aan op een computersysteem met software die op zijn plaats is. Meet met behulp van schuifmaten de afstand tussen de buitenkant van twee parallelle kaken. Typ de afstand in het rekveld in het instrumentinstellingen tabblad en klik op rekken kalibreren onder het tabblad.
Vervolgens past u een polyurethaan nanopore membraan van geschikte grootte voor analyse horizontaal aan de kaken met het nanopore ID-nummer omhoog. Rek vervolgens de kaken uit tot het rekken dat nodig is voor analyse met behulp van de rekhendelserp aan de zijkant van het instrument. Plaats 80 microliter PBST-buffer in de onderste vloeistofcel onder de nanopore, zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn die de meting kunnen beïnvloeden.
Klik nu de bovenste vloeistofcel op zijn plaats en voeg 40 microliter buffer toe, zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Plaats vervolgens een faradaykooi over het systeem en breng een externe druk toe zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat je 40 microliter van de kalibratiedeeltjes in de bovenste vloeistofcel hebt geplaatst, voltooi je een TRPS-meting bij drie aangewend voltages.
Verander het voltage door op de plus- en minknoppen op de voltageschaal in het instrumentinstellingen tabblad in de software te klikken. Controleer of de drie voltages de juiste achtergrondstromen retourneren. En zorg ervoor dat bij het medium voltage de kalibratiedeeltjes een gemiddelde blokkadegrootte produceren van minimaal 0,3 nanoampère.
Zodra de in het tekstprotocol beschreven omstandigheden zijn bereikt, start je de run door in de software in het dataverwervingstabblad op start te klikken. Om de meting te voltooien, klik je op stop in het dataverwervingstabblad en sla je het databestand op. Was het systeem door de kalibratiedeeltjes te vervangen door 40 microliter PBST-buffer in de bovenste vloeistofcellen meerdere keren.
En pas verschillende drukken toe totdat er geen blokkadegebeurtenissen meer aanwezig zijn, zorg ervoor dat er geen restdeeltjes en geen kruisbesmetting aanwezig zijn. Nadat de juiste basislijnstroom is bereikt, vervang je het elektrolyt in de bovenste vloeistofcel door 40 microliter monster. Start de monsterrun door in het dataverwervingstabblad op start te klikken.
Neem minimaal 500 deeltjes op en zorg ervoor dat de runtijd minimaal 30 seconden is. Om de meting te voltooien, klik je op stop in het dataverwervingstabblad en sla je het databestand op. Een voorbeeld van grootte en zetapotentiaalanalyse van streptavidine gecoate deeltjes zonder modificaties en streptavidine gecoate deeltjes verzadigd met enkelstrengs DNA op het oppervlak wordt hier getoond.
Hoewel beide monsters van vergelijkbare grootte waren, was het zetapotentieel significant anders en veel groter wanneer DNA op het deeltjesoppervlak was gefunctionaliseerd. De grootte en zetapotentiaalgegevens die worden weergegeven voor monsters met de laagste en hoo
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert het gebruik van tunable resistive pulse sensing (TRPS) om de oppervlaktechemie van nanodeeltjes te karakteriseren, met een specifieke focus op DNA-gemodificeerde nanodeeltjes. Door de translocatiesnelheden van deeltjes te meten, kan het zetapotentieel van individuele nanodeeltjes worden bepaald, wat inzicht geeft in hun eigenschappen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Nanotechnologie
- Biofysica
- Materiaalkunde
Achtergrond
- Tunable resistive pulse sensing (TRPS) is een techniek voor het analyseren van nanodeeltjes.
- Het karakteriseren van de oppervlaktechemie is essentieel voor het begrijpen van het gedrag van nanodeeltjes.
- Zetapotentiaal is een belangrijke parameter voor colloïdale stabiliteit.
- DNA-modificatie van nanodeeltjes kan hun functionaliteit in bioassays verbeteren.
Doel van de studie
- Om de oppervlaktechemie van nanodeeltjes te karakteriseren met behulp van TRPS.
- Om het zetapotentieel van DNA-gemodificeerde nanodeeltjes te bepalen.
- Om een methode te bieden voor de analyse van nanomaterialen op individueel deeltjesniveau.
Gebruikte methoden
- Integratie van een afstelbare nanoporie van polyurethaan met resistieve pulssensing.
- Meting van de translocatiesnelheden van deeltjes.
- Analyse van DNA-gemodificeerde nanodeeltjes om de oppervlaktechemie te beoordelen.
- Berekening van het zetapotentiaal op basis van translocatiedata.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle karakterisering van DNA-gemodificeerde nanodeeltjes.
- Nauwkeurige bepaling van het zettapotentieel voor individuele nanodeeltjes.
- Demonstratie van de voordelen van TRPS voor de analyse van nanomaterialen.
- Inzichten in de oppervlaktechemie van nanodeeltjes zijn verkregen.
Conclusies
- TRPS is een effectieve methode voor het karakteriseren van de oppervlaktechemie van nanodeeltjes.
- De techniek maakt een gedetailleerde analyse van individuele nanodeeltjes mogelijk.
- De bevindingen dragen bij aan de ontwikkeling van verbeterde bioassays en nanomaterialen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het karakteriseren van de oppervlaktechemie van nanodeeltjes is cruciaal voor het voorspellen van bio-interacties, stabiliteit en functionele prestaties in therapeutische en diagnostische toepassingen. Tunable resistive pulse sensing (TRPS) maakt de meting van het zetapotentieel per individueel deeltje mogelijk, waardoor resoluutiedoeleinden worden behaald die mechanische risicoreductie bij het ontwerp van nanomaterialen ondersteunen. Deze mogelijkheid verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de vroegtijdige screening van drug-delivery-systemen, biosensoren en nanotherapeutica voor milieu-toepassingen door oppervlaktemodificaties te koppelen aan functionele resultaten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidering
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar de effecten van oppervlaktefunctionalisering op het gedrag van nanodeeltjes, wat doelwitvalidatie ondersteunt via fysisch-chemische profilering.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve, op deeltjesniveau opgeloste gegevens die structuur-eigenschaprelaties in nanomateriaalbibliotheken verduidelijken.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert distributionele zetapotentiaalgegevens van individuele deeltjes, waardoor subpopulaties in heterogene monsters kunnen worden gedetecteerd.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van assays door reproduceerbare, labelvrije metingen van de oppervlaktelading over verschillende batches te leveren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Meet hoe DNA-hybridisatie de oppervlaktelading verandert, wat inzicht geeft in stabiliteits- en bindingsvoorspellingen in biologische omgevingen.
- Operationele waarde: Levert vertaalbare metrieken voor het correleren van nanodeeltjeseigenschappen met de preklinische prestaties in gemultiplexte bio-assays.
Integratie van Pipeline & Workflow
TRPS past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege screening van nanomaterialen tot identificatie van lead-verbindingen, waarbij gegevens over de oppervlaktelading de go/no-go-beslissingen informeren voorafgaand aan preklinische investeringen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door de dichtheid van DNA-modificaties te koppelen aan meetbare verschuivingen in het zetapotentiaal, waardoor de resultaten van oppervlakte-engineering worden verduidelijkt.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve resultaten die vergelijking van nanodeeltjesformuleringen onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk maken.
- Analytics: Biedt uitlezingen van de translocatiesnelheid en de grootte van de blokkade, waardoor statistische vergelijking van oppervlaktemodificeerde populaties mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Verbindt oppervlaktekarakterisering aan functionele continuïteit bij de ontwikkeling van bioassays, zoals voor de detectie van virussen of eiwitten.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Fungeert als een herbruikbaar platform voor het karakteriseren van diverse nanomaterialen in verschillende projecten, waardoor redundante methodeontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende zekerheid over de stabiliteit en interactiepotentie van nanodeeltjes door middel van directe meting van de oppervlaktelading.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via analyse op basis van individuele deeltjes, waardoor batchvariabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Geïnformeerde go/no-go-beslissingen door ambiguïteit in het gedrag van nanomaterialen te verminderen, wat het risico op falen in een laat stadium verlaagt.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van nanocarrier-kandidaten op basis van gevalideerde oppervlakteprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in de preparatie van nanodeeltjes, oppervlaktefunctionalisering en elektrokinetische principes.
- Toegang tot TRPS-instrumentatie met druk- en spanningsregeling, vloeistofbehandeling en nanoporiekalibratie.
- Gestandaardiseerde protocollen voor monsterverdunning, wassen en het voorkomen van contaminatie tussen verschillende runs.
- Overwegingen voor aanpassing aan variërende deeltjesgrootte, oppervlaktechemie en buffercondities.
- Praktische beperkingen omvatten de gevoeligheid voor verstopping van de poriën en de noodzaak van nauwkeurige reiniging tussen monsters om de dataintegriteit te waarborgen.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Preparing Streptavidin Coated Particles and Addition of Capture Probe DNA
2:45
Hybridizing Complementary DNA to the Capture Probe-particles
3:46
TRPS Setup
4:58
Calibrating the Nanopore for Zeta Analysis and Running a Sample
6:43
Results: Size and Zeta Potential of Streptavidin Coated Nanoparticles by TRPS
7:47
Conclusion
