Meting van In Vitro Integratie activiteit van HIV-1 Preintegration Complexen

Het algemene doel van deze procedure is om de in vitro integratie-activiteit van pre-integratiecomplexen, of PIC's, geïsoleerd uit HIV-1 geïnfecteerde SupT1 cellen te meten. Deze methode zal enkele van de belangrijkste vragen in de HIV-biologie beantwoorden, specifiek hoe bepaalde gastheerfactoren en virale factoren, bijvoorbeeld het virale capside, een rol spelen in de HIV-1 DNA-integratie, en dit zal ons helpen bij het ontwerpen of identificeren van nieuwe doelen voor antiretrovirale therapie. Het grote voordeel van deze methode is dat het relatief kleine hoeveelheden van het pre-integratiecomplex, of PIC, vereist voor het meten van de integratie-activiteit in vitro.

De implicaties van deze techniek kunnen zich uitstrekken tot de diagnose en therapie van HIV-1 AIDS, en dit komt omdat de eerdere versies van deze techniek cruciaal zijn geweest in de ontdekking van HIV-1 integraseremmers, die een van de belangrijkste anti-HIV-geneesmiddelen in klinisch gebruik vandaag zijn, dus deze methode kan niet alleen worden gebruikt om HIV-1-integratie te begrijpen, maar kan ook worden toegepast om andere retrovirussen te bestuderen, zoals RSV en MLV. Het demonstreren van dit protocol zal Dr. Muthukumar Balasubramaniam zijn, die een post-doctorate fellow in het laboratorium is. Om SupT1 met HIV-1 te infecteren, houdt u in een BSL-2 lab SupT1 cellen tussen één en twee keer 10 tot de zesde cellen per milliliter in Roswell Park Memorial Institute of RPMI medium gesupplementeerd met 10%FBS en Pen-Strep.

Na het genereren van hoge titers van infectieus HIV-1 volgens het tekstprotocol, pool de SupT1 cellen uit de kweekflenzen, meng goed door pipetteren, en gebruik trypanblauw exclusiekleuring in een hemocytometer om het aantal levensvatbare cellen te bepalen. Doe acht keer 106 cellen per virusinfectie in 50 milliliter kegelvormige centrifugeerbuizen, centrifugeer vervolgens de cellen in een schommelende emmerrotor bij 500 keer g en 25 graden Celsius gedurende vijf minuten. Zonder het cellenkwetsingsmedium te verwijderen, breng de buizen met gepelletiseerde cellen over naar het BSL-3 lab voor verdere verwerking, en aspireer vervolgens voorzichtig het medium uit de buis zonder het pellet te verstoren.

Voeg vervolgens 30 milliliter DNase I behandeld virus-inoculum toe aan de cellen en meng door voorzichtig pipetteren, verdeel vervolgens het mengsel gelijkmatig tussen twee zes-wels weefselkweekplaten. Voor spinoculatie plaatst u de kweekplaten in platendragers en centrifugeert u in een schommelende emmerrotor bij 480 keer g en 25 graden Celsius gedurende twee uur, en vervolgens incubeert u de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende vijf uur. Om de geïnfecteerde cellen te oogsten en te lyse, poolt u de cellen die overeenkomen met elke infectie in een 50 milliliter kegelvormige centrifugeerbuis.

Centrifugeer de cellen bij 300 keer g en 25 graden Celsius gedurende 10 minuten, en aspireer vervolgens voorzichtig of pipetteer de supernatant. Om eventuele resterende virusdeeltjes te verwijderen, was elk pellet door twee milliliter buffer K min min toe te voegen en het monster opnieuw te centrifugeren, en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant door aspiratie of met een pipetteer voordat u de wassing nog een keer herhaalt. Na het voorzichtig verwijderen van eventuele resterende buffer met een micropipet, gebruik ijskoud lysisbuffer K plus plus om elk pellet voorzichtig te hersuspenderen en over te brengen naar een microcentrifugebuis van twee milliliter.

Om cytoplasmatische pre-integratiecomplexen, of PIC's, voor te bereiden, schudt u het monster op kamertemperatuur gedurende 10 minuten, plaats vervolgens de buizen in een rotor voorgekoeld tot vier graden Celsius, en centrifugeert u bij 1.500 keer g en vier graden Celsius gedurende vier minuten. Zonder het pellet te verstoren, draagt u voorzichtig het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis en centrifugeert u bij 16.000 keer g en vier graden Celsius gedurende één minuut. Draag voorzichtig het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis, voeg vervolgens RNase A toe tot een eindconcentratie van 20 microgram per milliliter, en incubeer de inhoud bij kamertemperatuur zonder te schudden gedurende 30 minuten.

Voeg sucrose toe tot een eindconcentratie van 7% en meng goed door voorzichtig pipetteren, bereid vervolgens aliquots van de PIC's in microcentrifugebuizen. Vriezen in vloeibare stikstof en plaats in een negatieve 80 graden Celsius vriezer voor langdurige opslag. Om het doel-DNA voor te bereiden dat wordt gebruikt in de in vitro integratie of IVI-assay, verzamelt u de PCR-mengsels om een 2,0 kilobase gebied van het phiX174 plasmide DNA te versterken met behulp van de op maat gemaakte primers phiX174-Forward en phiX174-Reverse, en voert u PCR uit volgens het programma volgens het tekstprotocol.

Na het gel zuiveren en aliquoteren van het monster, voegt u 600 nanogram doel-DNA toe aan 200 microliters PIC's. Meng goed en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 45 minuten. Stop de IVI-reactie door SDS, EDTA en proteinase K toe te voegen, meng vervolgens de reactie-inhoud grondig en incubeer bij 56 graden Celsius gedurende de nacht.

De volgende dag, om het totale DNA van de IVI-reactie te zuiveren, voegt u een gelijk volume fenol toe aan het gedeproteiniseerde monster. Meng krachtig door te vortexen en centrifugeer gedurende twee minuten. Verwijder voorzichtig de bovenste waterige fase en breng deze over in een nieuwe buis voordat u de fenolextractie herhaalt, voeg vervolgens een gelijk volume van een op een fenol chloroform toe.

Meng het monster door te vortexen en centrifugeer de buis gedurende twee minuten, en breng vervolgens de bovenste waterige fase over in een nieuwe buis. Na extractie met chloroform volgens het tekstprotocol, precipiteer het DNA uit de waterige fase door 0,1 microgram per microliter glycogeen, 0,3 molair natriumacetaat en 2,5 volumes ijskoud 100%ethanol toe te voegen. Plaats de buis gedurende de nacht bij negatieve 80 graden Celsius.

De volgende dag centrifugeert u het monster bij 16.000 keer g en vier graden Celsius gedurende 30