Name: De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer de ELISpot-methode voor het kwantificeren van antilichaam-uitscheidende B-cellen uit menselijk bloed. Deze techniek maakt detectie op enkelcellig niveau mogelijk voor immunologisch en vaccinonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door een onderzoekssubsidie van het Ministerie van Wetenschap en Technologie van de Uitvoerende Yuan van Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). Ik wil de uitstekende service bedanken die wordt geleverd door de Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core van het First Core Laboratory in de Faculteit Geneeskunde van de Nationale Universiteit van Taiwan.

Humaan perifeer bloed moet worden verkregen van gezonde donoren in het kader van informed consent, en het gebruik van bloedmonsters moeten voldoen aan de door de individuele institutionele review boards erkende richtlijnen. In deze studie, het protocol om menselijk bloed te gebruiken in een demonstratie van de resultaten van flowcytometrie (Figuur 1) en ELISpot assays (figuur 3) werd goedgekeurd door de interne Review Board van de National Taiwan University Hospital (protocol nummer 201307019RINB). 1. isolatie en zuivering van de humane perifere bloed B-cellen <ol><li> Teken ~ 10 ml bloed uit de mediaan cubitaal ader (in de cubital fossa anterior aan de elleboog) in een 15-mL buis met K 2 EDTA (1,5 tot 2,0 mg / ml bloed) en onmiddellijk de buis omkeren meerdere malen te stollen te voorkomen vorming. </li><li> Voeg 35 mL autoclaaf (121 ° C, 15 min) rode bloedcellen (RBC) lysis buffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3 en 1 mM EDTA; pH 7,4) naar de buis die vers bloedmonster (≥ 3: 1 vol / vol) en incubeer bij kamertemperatuur (KT) gedurende maximaal 5 minuten. Opmerking: Het uiterlijk van lichttransmissie door de buis geeft de beeindiging van RBC lysis. </li><li> Centrifugeer bij 600 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Zorg ervoor dat de pellet is wit van kleur. </li><li> Resuspendeer de pellet met 10 ml autoclaaf fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 4,3 mM Na 2 HPO 4 en 1,47 mM KH 2PO 4, pH 7,4) en gecentrifugeerd zoals in stap 1,3. </li><li> Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet met 10 ml RPMI 1640 medium (supplementen: 10% foetaal kalfsserum, 100 U / ml penicilline / streptomycine, 0,25 ug / ml amfotericine B, en 2 mM L-glutamine) en plaat de cellen in een 10-cm cultuur schotel (10 ml bloed per gerecht). Plaats de schotel in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 30 minuten. </li><li> Zwenk de cultuur schotel een paar keer en plaats dekweekmedium (schorsing cellen) in 15 ml plastic conische buizen. Gooi de hechtende cellen (voornamelijk macrofagen) op kweekschalen. </li><li> Centrifugeer bij 600 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de pellet met 1 ml RPMI 1640 medium. Tel het aantal cellen met een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller. OPMERKING: De levensvatbaarheid van de geïsoleerde leukocyten gewoonlijk meer dan 90% door trypan blauw exclusie. </li><li> Centrifuge in stap 1,7 en resuspendeer de cellen in ~ 200 pi koude PBS buffer (0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA) bij een concentratie van 5-10 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Voeg 5 ul gebiotinyleerd anti-humaan Ab cocktail specifieke bloedcellen (voor negatieve selectie van B-cellen) per 10 6 cellen en incubeer op ijs gedurende 30 min 21. OPMERKING: De anti-humaan Ab cocktail moet tenminste Abs specifiek CD2 (of CD3), CD14 en CD16. </li><li> Voeg een 10-voudige overmaat volumesteriel PBS aan de cellen gecentrifugeerd bij 600 g gedurende 5 min en gooi het supernatant. </li><li> Voeg gelijke hoeveelheden streptavidine-geconjugeerd microbolletjes (5 ul per 10 6 cellen) aan de pellet en meng. </li><li> Incubeer op ijs gedurende 30 min in een 15 ml plastic conische buis. </li><li> Voeg 2 mL PBS buffer in de buis. </li><li> Breng de buis in een magnetische standaard en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 min. De bruine microkorrels geleidelijk hechten aan de buiswand naast de magneet 22. </li><li> De overige in de magnetische stand buis voorzichtig overdracht van de supernatant in een nieuwe steriele 15 ml buis 22. </li><li> Herhaal stap 1,14-1,16, en combineren de twee supernatanten die de ongerepte B-cellen bevatten. Gooi de microbolletjes. </li><li> Centrifugeer bij 600 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de pellet in RPMI 1640 medium voor downstream experimenten. LET OP: Typisch, 1-5 x 10 5 B-cellen witha zuiverheid van meer dan 95% van 10 ml perifeer bloed kunnen worden geïsoleerd 23. </li></ol> 2. Zuivering en scheiding van Herdenking en Naïve B Cellen van Geïsoleerde B-cellen <ol><li> Gebruik cellen gezuiverd van stap 1 en het bepalen van het aantal cellen met behulp van een hemocytometer of een automatische cel teller. </li><li> Resuspendeer de cellen in 100 ul koud PBS buffer na centrifugatie bij 600 x g en kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 1-2 ug gebiotinyleerd CD27 mAb per 10 6 cellen en incubeer op ijs gedurende 30 min. </li><li> Voeg 10 mL van PBS buffer aan de buis en centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 50 ui PBS buffer. </li><li> Voeg gelijke hoeveelheden streptavidine magnetische microkralen (1-2 ug / 10 6 cellen) aan cellen in een 15 ml plastic conische buis. </li><li> Voorzichtig goed mengen en incubeer op ijs gedurende 30 min. </li><li> Voeg 2-3 ml PBS-buffer aan de buis. </li><li> Plaats debuis in een magnetische standaard en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 minuten om de bruine microkralen te hechten aan de zijde het dichtst bij de magneet. </li><li> De buis in de magnetische stand voorzichtig breng de vloeistoffractie in een nieuwe steriele buis. Deze fractie bevat de verrijkte CD27 - naïeve B-cellen. </li><li> Voeg 5 ml tot de buis met de microbolletjes en voorzichtig resuspendeer de microbolletjes (dat wil zeggen, de verrijkte fractie van CD27 + memory B-cellen) 24-25. </li><li> Centrifugeer bij 600 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Resuspendeer de pellets met RPMI 1640 medium voor de stroomafwaartse experimenten. OPMERKING: Gewoonlijk ~ 30-60% van B-cellen kan worden gezuiverd zoals CD27 + geheugencellen van de PBMC van een gezonde donor 7, 25-26. </li></ol> 3. Cell Sorting voor de inzameling van naïeve B-cellen, B-geheugencel, en PBS / pc&#39;s <ol><li> Met de cellen gezuiverd uit stap 1 Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer of een automatische cel teller. </li><li> Resuspendeer de cellen in koude PBS buffer bij een concentratie van 10 7 per ml in 5 ml polystyreen buis. </li><li> Voeg 1-2 ug humaan IgG per 10 6 cellen en incubeer op ijs gedurende 10 min voor het Fc blok. </li><li> Voeg 1 ug elk van anti-CD19-APC (kloon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (kloon: O323) en anti-CD38-PE (kloon: HIT2) per 10 6 cellen; Meng goed en incubeer op ijs gedurende 30 min 4, 27. </li><li> In de laatste 5 min in stap 3.4, voeg 5 pi van de commerciële 7-amino-actinomycine D (7-AAD). </li><li> Voeg 2 ml PBS aan de buis, vortex en centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de cellen in sortering buffer (steriel PBS met 2% BSA en 2 mM EDTA) bij een concentratie van 1-5 x 10 7 cellen per ml in een 15 ml buis. </li><li> Filter de cellen door een nylon mesh cel zeef (40 um poriegrootte) naar cel klonten te elimineren. </li><li> Scheid de cellen met een flowcytometrische sorterener uitgerust met drie lasers: violet (405 nm), blauw (488 nm) en rode (640 nm). LET OP: De blauwe laser alleen al is voldoende voor 3-kleur cytometry 27-28 stromen. </li><li> Sorteren van de cellen in drie 15-ml buisjes (die 5 ml RPMI medium) voor het gelijktijdig verzamelen van naïeve B-cellen (CD19 + CD27 -), geheugen B-cellen (CD19 + CD27 +) en PBS / PC (CD19 + CD27 + / hi CD38 +) 3-4, 28. OPMERKING: Gesorteerd naïeve en memory B cellen kunnen worden gekweekt zoals beschreven in stap 4. </li></ol> 4. In vitro differentiatie van de geïsoleerde menselijke CD19 + B-cellen, CD19 + CD27 + B-geheugencel, en CD19 + CD27 - Naïve B-cellen <ol><li> Met de cellen gezuiverd stappen 1,19, 2,10, 2,11 en 3,10 Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer of een automatische celteller. </li><li> Resuspendeer de cellen met RPMI 1640 mediumbij een concentratie van 1 - 10 x 10 per 5 ml aliquot en deze in de putjes van een 12-wells plaat. </li><li> Voeg CpG (ODN 2006) bij 5 ug / 10 6 cellen / ml 18, 29. </li><li> Cultuur van de cellen in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 5 dagen. </li><li> Oogst de cellen uit elk putje, plaats ze afzonderlijk in 15 ml buizen, voeg 5 ml PBS aan elke buis en centrifugeer ze op 600 xg en KT gedurende 5 min. </li><li> Tel de cellen met een hemocytometer of een automatische celteller. Resuspendeer de cellen in een concentratie van 1-10 x 10 5 per ml met RPMI 1640 medium. </li></ol> 5. Assay ELISpot <ol><li> Voeg 30 ul van 35% ethanol in gedestilleerd water aan elk putje van de ELISPOT platen gedurende 30 s. OPMERKING: Bij pipetteren, raak het membraan in de putjes te allen tijde. </li><li> Keren de ELISpot platen om de ethanol te verwijderen. </li><li> Zet 150 ul van geautoclaveerd DDH 2 O in elk putje en incubeerze op kamertemperatuur 5 minuten doorspoelen van de resterende ethanol; volg met een wassen steriel PBS bij kamertemperatuur gedurende 3 min. OPMERKING: Stappen 5,1-5,3 is optioneel, afhankelijk van de vervaardiging van de platen. </li><li> Put 50 ui 5 ug / ml polyklonaal F (ab &#39;) 2-fragment van anti-humaan Ig (IgG + IgM + IgA) (in PBS) in elk putje van de ELISPOT platen en incubeer ze bij 4 ° C overnacht (voorkeur) of 37 ° C gedurende 2 uur 11. OPMERKING: Dicht de randen van platen met Parafilm tot gebruik. </li><li> Inverteer de platen om ongebonden Abs tweemaal verwijderen, voeg 200 ul van PBS aan elk putje en incubeer ze op kamertemperatuur 3 minuten per keer. </li><li> Voeg 200 ul PBS met 5% BSA (of RPMI 1640 medium) aan elk putje voor het blokkeren en incubeer ze op kamertemperatuur 2 uur. </li><li> De platen om de blokkerende buffer te verwijderen. Was tweemaal met elk putje 200 pl PBS, als in stap 5,5. </li><li> Voeg 100 ul RPMI 1640 medium aan elk putje en incubeer ze op 37 ° C. </li><li> Als u klaar bent om de cellen te zaaien, keren de platen aan de RPMI 1640 medium te verwijderen. </li><li> Zaad 100 pl (5 x 10 4), 50 gl (2,5 x 10 4), en 25 pl (1,25 x 10 4) van de cellen (van stap 1,19, 2,10, 2,11, 3,10 en 4,6) in de putjes van een ELISpot plaat. Met RPMI 1640 medium, breng het volume op 150 ul / putje. Opmerking: Een minimum van één of twee 2-voudige seriële verdunningen van de cellen plateren wordt aanbevolen. </li><li> Incubeer de platen in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 8-14 uur 18. Vermijd het verplaatsen van de platen tijdens de incubatie. </li><li> Inverteer de platen en de cellen RPMI 1640 medium te verwijderen. </li><li> Voeg 200 ul / putje PBS-T (PBS met 0,05% Tween 20) en incubeer ze 5 maal bij kamertemperatuur, elke keer gedurende 3 min. Keer de plaat om de wasbuffer tussen elk van de 5 wasbeurten verwijderen. </li><li> Voeg hetzij geit anti-menselijk IgG-alkalisch fosfatase (AP), Fcy-specifieke Abs (IgG detectie, 1: 5000 in PBS-T) Of geit anti-humaan IgM-AP, Fcμ fragment-specifieke Abs (voor IgM detectie, 1: 5000 in PBS-T) in de aangegeven putjes en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur in het donker. </li><li> Was tweemaal met elk putje 200 pl PBS, als in stap 5,5. </li><li> Voeg 50 ul / putje bromochloroindolyl fosfaat-nitro blauw tetrazolium (BCIP / NBT) substraatoplossing. Paars-gekleurde vlekken normaal verschijnen in 5 - 15 min. </li><li> Voeg 100 ul / putje van DDH 2 O om de over-ontwikkeling van vlekken te voorkomen. </li><li> Spoel de platen met stromend leidingwater na de volledige ontwikkeling van alle spots. </li><li> Verwijder de underdrain van de platen en laat ze aan de lucht drogen in het donker. </li><li> Tel de spots toepassing van een geautomatiseerde plaatlezer een beeldacquisitie / analyse-eenheid (bijvoorbeeld een automatische scanner of handmatig via een dissectie microscoop). OPMERKING: De platen kunnen worden bij kamertemperatuur in het donker bewaard en later geanalyseerd. </li></ol>

<ol><li>Bemark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+transitions+-+how+to+decipher+peripheral+human+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Res%22%5BJournal%5D)">Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development.</a> J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).</li>
<li>Odendahl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+migratory+antigen-specific+plasmablasts+and+mobilization+of+resident+plasma+cells+in+a+secondary+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response.</a> Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).</li>
<li>Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human B cell subsets.</a> Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).</li>
<li>Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+heterogeneity+of+human+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells.</a> Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).</li>
<li>Perez-Andres, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+B-cell+compartments%3A+A+crossroad+in+B-cell+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic.</a> Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).</li>
<li>Huggins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+DNA+activation+and+plasma-cell+differentiation+of+CD27-+na%C3%AFve+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells.</a> Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).</li>
<li>Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+CD27+negative+and+positive+B+cell+populations+in+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood.</a> Front. Immunol. 2, 81(2011).</li>
<li>Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD38hiCD138%E2%81%BA+plasma+cells+can+be+generated+in+vitro+from+CD40-activated+switched-memory+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes.</a> J. Immunol. Res. 2014, 635108(2014).</li>
<li>Wienands, J., Engels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+memory+function+of+the+B+cell+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The memory function of the B cell antigen receptor.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).</li>
<li>Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory B cells.</a> Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).</li>
<li>Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc%CE%B3RIIB+mediates+antigen-independent+inhibition+on+human+B+lymphocytes+through+Btk+and+p38+MAPK+%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK .</a> J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).</li>
<li>Ettinger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+induces+differentiation+of+human+na%C3%AFve+and+memory+B+cells+into+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells.</a> J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).</li>
<li>Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poke+weed+mitogen+requires+Toll-like+receptor+ligands+for+proliferative+activity+in+human+and+murine+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes.</a> PLoS One. 7 (1), e29806(2012).</li>
<li>Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+serological+memory+by+polyclonal+activation+of+human+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells.</a> Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).</li>
<li>Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDefrance%2C+T+%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. 175 (3), 671-682 (1992).</li>
<li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornbeck%2C+P+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , (2001).</li>
<li>Tanguay, S., Killion, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+ELISPOT+and+ELISA-based+assays+for+detection+of+individual+cytokine-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphokine+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells.</a> Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).</li>
<li>Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+human+antigen-specific+memory+B+cells%3A+a+sensitive+and+generalized+ELISPOT+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system.</a> J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).</li>
<li>Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+retarded+influenza+virus-specific+immunoglobulin+class+switch+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Cell.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice.</a> J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403(2016).</li>
<li>Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+numbers+of+memory+B-cells+and+Th2-cytokine+skewing+in+high+responders+to+hepatitis+B+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination.</a> Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).</li>
<li>Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeine%2C+G+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , (2011).</li>
<li>Safarík, I., Safaríková, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+magnetic+techniques+for+the+isolation+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Use of magnetic techniques for the isolation of cells.</a> J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).</li>
<li>Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+values+for+B+cell+subpopulations+from+infancy+to+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood.</a> Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).</li>
<li>Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThornton%2C+AM+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , (2003).</li>
<li>Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKlein%2C+U+%22J.Exp.+Med%22">J.Exp. Med</a>. 188 (9), 1679-1689 (1998).</li>
<li>Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bm1-Bm5+classification+of+peripheral+blood+B+cells+reveals+circulating+germinal+center+founder+cells+in+healthy+individuals+and+disturbance+in+the+B+cell+subpopulations+in+patients+with+primary+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome.</a> J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).</li>
<li>Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBleesing%2C+JJ+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , (2003).</li>
<li>Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+pure+lymphocyte+gate+for+subset+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry.</a> Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).</li>
<li>Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+stimulation+as+a+third+signal+required+for+activation+of+human+naive+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells.</a> Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Caraux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+human+B+and+plasma+cells.+Age-associated+changes+in+counts+and+detailed+characterization+of+circulating+normal+CD138-+and+CD138%2B+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells.</a> Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).</li>
<li>Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+IL-21+in+B+cell+activation%2C+expansion%2C+and+plasma+cell+generation+during+CD4%2B+T+cell-B+cell+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration.</a> J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).</li>
<li>Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+dissection+of+the+human+memory+B-cell+repertoire+following+infection+and+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination.</a> Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).</li>
<li>Jahnmatz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+human+IgG+B-cell+ELISpot+assay+for+the+analysis+of+vaccine-induced+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses.</a> J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).</li>
<li>Weiss, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+human+memory+B+cell+assay+and+its+application+to+studying+Plasmodium+falciparum-specific+memory+B+cells+in+natural+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections.</a> J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).</li>
<li>Leehan, K. M., Koelsch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+ELISPOT%3A+For+the+identification+of+specific+cytokine-secreting+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells.</a> Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).</li>
<li>Karahan, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+HLA+class+II-specific+memory+B+cells+in+HLA-sensitized+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals.</a> Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).</li>
<li>Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+B+cell%2Fantibody+cross-reactivity+using+a+novel+multicolor+FluoroSpot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay.</a> J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).</li>
<li>Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepping+up+ELISpot%3A+multi-level+analysis+in+FluoroSpot+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays.</a> Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).</li>
<li>Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+cell+responses+to+hepatitis+C+virus+%28HCV%29+in+the+liver+of+persons+with+HCV-HIV+coinfection+versus+HCV+monoinfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection.</a> J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).</li>
<li>Smith, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+major+factors+influencing+ELISpot-based+monitoring+of+cellular+responses+to+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS. One. 4 (11), e7972(2009).</li>
<li>Sundararaman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+reproducibility+of+ELISPOT+counts+from+nine+different+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories.</a> Cells. 4 (1), 21-39 (2015).</li>
<li>Janetzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+automated+evaluation+of+Elispot+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays.</a> Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).</li>
</ol>

De auteur verklaart geen concurrerende financiële belangen.

Isolatie en zuivering van de humane perifere bloed B-cellen Normaal gesproken kan RBC efficiënt worden verbroken en gewist door lysisbuffer (stap 1.2). Het is belangrijk om PBMC&#39;s met de RBC lysisbuffer langer dan 5 min incuberen, zoals levensvatbaarheid van de cellen kan worden beïnvloed door het ammoniumchloride. Als alternatief kunnen RBC en bloedplaatjes gelijktijdig worden verwijderd door het volgende protocol. Meng vers volbloed met zuur-citraat-dextrose (...

B-cellen spelen een centrale rol bij de ontwikkeling van humorale immuniteit. Zij oorspronkelijk ontwikkeld in het beenmerg en in de bloedsomloop als naïeve B-cellen, die migreren naar lymfoïde weefsels zoals de milt, lymfeknopen, amandelen en, voor verdere ontwikkeling. Bij Ag ontmoeting, wat naïeve B-cellen migreren naar lymfoïde follikels, waar de germinal center B-cellen kunnen differentiëren in het geheugen B-cellen en plasmablasten (PBS) / plasmacellen (pc&#39;s). Terwijl de meeste PBS / PC egress in de bloedstroom, wat uiteindelijk een verblijf in het beenmerg naar terminale differentiatie ondergaan in langlevende PC 1. B-cellen in omloop zijn heterogeen, en bij steady state, PBS / pc&#39;s zijn zeldzaam in het perifere bloed 2. Door de beschikbaarheid van lijn-specifieke oppervlakte merkers, flowcytometrie is een populaire werkwijze voor de identificatie en karakterisering van de B-cel populaties in perifeer bloed. Een uitgebreide toepassing van stroom cytometry is de toevoeging van een celsorteerinrichting functie, die de scheiding en isolatie van afzonderlijke subsets van B-cellen met hoge zuiverheid mogelijk maakt. Op basis van de expressie van specifieke oppervlak receptoren in verschillende ontwikkelingsstadia, menselijke circulerende B-cellen worden in het algemeen in drie belangrijke subpopulaties ingedeeld: naïeve B-cellen (CD19 + CD27 - CD38 -), geheugen B-cellen (CD19 + CD27 + CD38 -), en PBS / pC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (figuur 1). Naïeve B-cellen door de natuur nog niet tegengekomen Ags. Ze kunnen echter worden onderscheiden in IgM + CD27 + B-geheugencel. Hoewel naïeve B-cellen homogeen tot expressie B-cel antigen receptor (BCR) geassocieerde moleculen (bijvoorbeeld CD19, CD20 en CD22) zij zijn heterogeen in hun immunoglobulinerepertoire 5. De meeste CD27 + B-geheugencel kan worden onderscheiden in CD27+ / hi CD38 + PBS / pc 6. Bovendien, het geheugen B-cellen en PBS / PC&#39;s zijn polyklonaal en vertonen ontwikkelings- en functionele heterogeniteit 4-7. PBS / pc&#39;s in omloop zijn meestal van korte duur en niet uitdrukken CD138, maar die maakte om zich te vestigen in het beenmerg zal terminaal differentiëren en uitgegroeid tot een lange levensduur. Terminaal gedifferentieerde pc&#39;s uitdrukken CD138 en down-reguleren van CD27-moleculen op hun oppervlak 8. Aangezien zowel PBS en computers kunnen uitscheiden Abs zijn in veel gevallen worden ze collectief aangeduid als ASC. Daarentegen kan noch naïeve B-cellen of B-geheugencel aanzienlijke hoeveelheden Abs 9-10 produceren. Niettemin, wanneer geïsoleerd, zowel naïef en memory B-cellen kunnen worden onderscheiden in ASC in 3-10 dagen wanneer geplaatst in de juiste kweekomstandigheden 6, 11-15. In feite, ASC afgeleid van in vitro differentiatie aandeel vergelijkbaar oppervlak uitingen van CD27 en CD38 met de direct geïsoleerde frOM perifere bloed 6. Bovendien, het ASC gedifferentieerd in vitro drukken een geringe oppervlakte CD20, op elkaar dat circulerende PBS / pc 6. Hoewel de kweek afgeleide ASC&#39;s zijn korte duur, kunnen ze afscheiden Abs, wat aangeeft dat ze functioneel competent en kunnen bijdragen aan de humorale immuniteit. Zowel ELISA en ELISPOT zijn veruit de meest toegepaste methoden waarmee functionele gegevens over de humorale immuunrespons te verkrijgen. ELISA is een 96-well-plaat gebaseerde bepaling, en wordt vaak gebruikt om de titers van serum Ag-specifieke Abs en andere analyten (bijvoorbeeld cytokines) te meten. Het is handig en schaalbaar. ELISA is ontworpen om een vaste fase enzym-assay om de aanwezigheid van Abs of andere stoffen, zoals serum te detecteren, in een vloeistofmonster 16. De uitlezingen uit serum ELISA&#39;s op grote schaal gebruikt om de immuunrespons van het lichaam representeren. Een hulpmiddel voor de verwerving van readouts van ELISA assays is een spectrofotometer microplaat reader. De lezer kan de optische dichtheid (OD) van de eindproducten typisch resulterend uit de reactie van mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerde detectie Abs en hun specifieke substraten 17 bepalen. Met betrekking tot het rapporteren van de humorale immuunrespons, serum levels Ab bepaald met ELISA duiden het collectief, maar geen individuele prestaties van ASC in het lichaam. Bovendien ELISA geen rekening gehouden met de bijdrage van geheugen B-cellen, die niet afscheiden Abs. Zoals ELISA, ELISpot is een veel gebruikte werkwijze voor het detecteren en volgen van de immuunreactie in perifere bloedmonsters 17-18. ELISpot is een techniek soortgelijk aan een sandwich ELISA. Daarin worden cellen geplaatst in de polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan backed putjes van 96-putjes microplaten voor een korte termijn cultuur. De ELISPOT-test is analoog aan het uitvoeren van Western blotting op een microplaat en developing de vlekken op het PVDF membraan in elk putje. Een geautomatiseerde ELISPOT reader systeem of een stereomicroscoop voor handmatige telling vereist. Het belangrijkste voordeel van ELISPOT in het detecteren van een immuunreactie zijn uitstekende gevoeligheid in de kwantificering van ASC en cytokine-afscheidende cellen. Rapporteert de functionele activiteiten in humorale en cellulaire immuniteit, respectievelijk. In de meting van humorale immuunsysteem, zijn serum Ab niveau bepaald door ELISA en het aantal ASC erin genoemde ELISpot vaak gecorreleerd, maar de data uitlezingen uit deze twee assays hebben enkele verschillen in functionele implicaties 19-20. Het belangrijkste voordeel van ELISpot is de gevoeligheid van de methode. De serum Ab titers gerapporteerd door ELISA wordt voorgesteld semi-kwantitatief OD uitlezingen, duidt de relatieve Ab niveau of meer kwantitatief, zoals concentreren uitlezingen bij een bekende hoeveelheid van de juiste isotypen van Abs is opgenomen ter referentie. Daarentegen zijn de resultaten van ELISpot zijn presented de absolute aantal ASC in een cel pool van belang (bijvoorbeeld gefractioneerde perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) en gezuiverde B-cellen uit PBMC). ELISpot kan een enkele ASC te detecteren, maar ELISA vereist Ab bedragen van ASC geoptimaliseerde test-afhankelijke concentraties voorafgaand aan de meting te bereiken. Daarom ELISpot is duidelijk superieur aan ELISA gevoeligheid van kwantificering. Bovendien ELISpot is ook geschikt voor het kwantificeren van de in vitro gedifferentieerde ASC van geactiveerde B-geheugencel. Geheugen B-cellen niet scheiden Abs, maar kunnen differentiëren naar ASC bij activering; ze hebben dus geen bijdrage aan serum Abs gedetecteerd door ELISA. Aldus ELISpot is de voorkeursmethode bij het meten van de immuunrespons van circulerende geheugen B-cellen na activering in kweek. Het zorgt voor de controle op de handhaving van langdurige humorale immuniteit.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer K2E</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td>10 mL tube</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>endotoxin-vrij</td></tr><tr><td>Trypan blue 0.5% oplossing</td><td>Biological Industries</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>IMag Human B lymfocyt verrijkingsset</td><td>BD Biosciences</td><td>558007</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleerd CD27 mAb</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>Streptavidine magnetische microbeads</td><td>BD Biosciences</td><td>9000810</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Blauwe nylon mesh cell strainer, 40 &mu;m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD19-APC</td><td>Biolegend</td><td>302212</td><td>clone HIB19</td></tr><tr><td>Anti-human CD27-eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0279-42</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>303516</td><td>clone HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>560677</td><td>clone HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-human CD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>304006</td><td>clone HI30</td></tr><tr><td>Anti-human CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td>clone HI30</td></tr><tr><td>Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>124213</td><td>clone LG.3A10</td></tr><tr><td>Anti-human CD27-PerCP Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>65429</td><td>clone L128</td></tr><tr><td>Anti-human CD19-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-064</td><td>clone LT19</td></tr><tr><td>Anti-human CD19-FITC</td><td>GeneTex</td><td>GTX75599</td><td>clone LT19</td></tr><tr><td>Anti-human CD20-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555622</td><td>clone 2H7</td></tr><tr><td>biotinyleerd anti-human CD27</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>biotinyleerd anti-human CD27</td><td>eBioscience</td><td>13-0279-80</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>7-aminoactinomycine D (7-AAD)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>CpG (ODN 2006)&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-2006</td><td>type B CpG</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-10</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-21</td><td>PeproTech</td><td>200-21</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human sCD40L</td><td>PeproTech</td><td>310-02</td><td></td></tr><tr><td>Protein A van S. aureus Cowan (SAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82526</td><td></td></tr><tr><td>Pokeweed mitogeen (PWM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9379</td><td></td></tr><tr><td>MultiScreen filterplaten, 0.45 &micro;m poriegrootte</td><td>Merck Millipore</td><td>MSIPS4510</td><td>steriele, heldere 96-well filterplaat met hydrofobe PVDF-membraan</td></tr><tr><td>BCIP/NBT oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT enkele reagens, alkalische fosfatase substraat</td><td>Merck Millipore</td><td>ES006</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG, Fc fragment</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 fragment van geiten anti-human Ig (IgG + IgM + IgA)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-127</td><td></td></tr><tr><td>Geiten anti-human IgG-alkaline fosfatase, Fc&gamma; fragment specifiek</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Geiten anti-human IgM-alkaline fosfatase, Fc&micro; fragment specifiek</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-043</td><td></td></tr><tr><td>Geiten anti-human IgG-peroxidase, Fc&gamma; fragment specifiek</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-008</td><td></td></tr><tr><td>Geiten anti-human IgM-peroxidase, Fc&micro; fragment specifiek</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-095</td><td></td></tr><tr><td>BD ELISPOT AEC substraatkit</td><td>BD Biosciences</td><td>551951</td><td></td></tr><tr><td>C.T.L. ImmunoSpot analyzerg</td><td>C.T.L.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende b-cellen uit bloed: elispot als functionele uitlezing van humorale immuniteit

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Het kenmerk van humorale immuniteit functionele ASC, die synthetiseren en afscheiden Abs specifiek voor een antigen (Ag), zoals een pathogeen, en worden gebruikt voor afweer genereren. Voor de kwantitatieve bepaling van de functionele status van de humorale immuunrespons van het individu, zowel serum Abs en circulerende ASC worden gewoonlijk gemeten als functionele uitlezingen. Bij mensen, perifeer bloed is de meest geschikte en gemakkelijk toegankelijk monster dat kan worden gebruikt voor de bepaling van de humorale immuunrespons opgewekt door gastheer B-cellen. Afzonderlijke B-cel subsets, zoals ASC, kunnen direct worden geïsoleerd uit perifeer bloed via geselecteerde lijn-specifieke Ab-geconjugeerde microparels of via celsortering met flowcytometrie. Bovendien kunnen gezuiverde naïeve en geheugen B-cellen worden geactiveerd en gedifferentieerd in ASC in de cultuur. De functionele activiteiten van ASC bijdragen aan Ab secretie kunnen worden met ELISpot, die een test waarmee enzym convergeert-gebonden immunoabsorptiekolom assay (ELISA) en western blotting technologieën om de opsomming van individuele ASC mogelijk te maken bij de single-cell niveau. In de praktijk is de ELISPOT er steeds meer gebruik vaccineffectiviteit evalueren vanwege het gemak van het hanteren van een groot aantal bloedmonsters. De werkwijzen voor het isoleren van humane B-cellen uit perifeer bloed, zal de differentiatie van B-cellen ASC&#39;s in vitro, en de toepassing van ELISPOT voor de kwantificering van totaal IgM- en IgG-ASCs hier beschreven.

PBMC werden ontdaan van erytrocyten en hechtende cellen (stappen 1,2-1,7). Een monster (2 x 10 6) cellen werden onderworpen aan een flowcytometrische analyse om de populaties van naïeve B-cellen, B-geheugencel, en PBS / pc&#39;s in perifeer bloed (figuur 1) tonen. In PBMC van deze donor, ongeveer 10% van de lymfocyten waren CD19 + B-cellen. In de B-cel compartiment, het percentage van CD19 + CD27 - naïeve B-cellen was ongeveer ...

Menselijk perifeer bloed wordt vaak gebruikt voor de beoordeling van de humorale immuunrespons. Hier worden de methoden beschreven voor het isoleren van menselijke B-cellen uit perifeer bloed, het differentiëren van menselijke B-cellen in antilichaam (Ab)-secreterende B-cellen (ASC's) in cultuur en het tellen van het totale aantal IgM- en IgG-ASC's via een ELISpot-assay.

De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Het algemene doel van deze ELISpot-methodologie is het mogelijk maken van de kwantificering van antilichaam-secreterende B-cellen van mensen uit bloed. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het biomedische veld over de immunologie van B-cellen en vaccinonderzoek. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de detectie en meting van antilichaam-secreterende B-cellen op single-cell niveau mogelijk maakt.De procedure zal worden gedemonstreerd door Tsung-Chih Tseng, een promovendus uit mijn laboratorium. Direct nadat er een bloedmonster van 10 ml is afgenomen uit de vena cubitalis mediana in een buis van 15 ml met kalium-gesupplementeerde EDTA, wordt de buis meerdere keren omgekeerd om stolselvorming te voorkomen. Voeg vervolgens 35 ml autoclaaf-behandelde lysebuffer voor rode bloedcellen toe aan de cellen voor een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur.Wanneer er licht door de buis kan worden waargenomen, centrifugeer het bloed en bevestig de aanwezigheid van een wit pellet. Verwijder de resterende lysisbuffer met 10 ml geautoclaveerde PBS en resuspendeer het pellet in 10 ml RPMI 1640 medium. Plaats de cellen in een kweekschaal van 10 cm voor een incubatie van 30 minuten bij 37 °C en vijf procent CO2.Wrijf vervolgens voorzichtig een paar keer met de kweekschaal en breng de zwevende cellen over in een plastic conische buis van 15 ml. Na twee wasbeurten door centrifugatie wordt het pellet opnieuw gesuspendeerd in 200 µL koude PBS-buffer, waarbij een concentratie van vijf tot 10 keer 10⁻⁶ cellen per ml wordt aangehouden, waarna 5 µL van een gebiotinyleerde anti-menselijke antilichaamcocktail specifiek voor bloedcellen per 1 x 10⁻⁶ cellen wordt toegevoegd. Na een incubatie van 30 minuten op ijs worden de cellen gewassen in een 10-voudig overmaatvolume steriele PBS en wordt het pellet opnieuw gesuspendeerd in 5 µL streptavidine-geconjugeerde microbeads per 1 x 10⁻⁶ cellen voor een incubatie van 30 minuten op ijs.Voeg aan het einde van de incubatie 2 ml PBS-buffer toe aan de cellen en plaats de buis gedurende acht minuten bij kamertemperatuur in een magnetische standaard. Wanneer de microbeads zich aan de wand van de buis hebben gehecht, wordt het supernatant voorzichtig overgebracht naar een nieuwe conische buis en worden er nog eens 2 ml PBS-buffer aan de cellen toegevoegd. Verzamel na de tweede supernatantcollectie de samengevoegde cellen door middel van centrifugatie en breng de cellen over naar een polystyreen buis van 5 ml met verse PBS-buffer bij een concentratie van 1/10 van de 7 cellen per ml.Na het uitvoeren van aspecifieke blokkering, voeg één µg van elk geselecteerd antilichaam per 1/10e van de zes cellen toe aan de buis met voorzichtig mengen voor een incubatie van 30 minuten op ijs. Voeg tijdens de laatste vijf minuten van de incubatie vijf µL 7-AAD toe aan de cellen. Voeg vervolgens twee mL verse PBS toe aan de cellen en vortex voordat u centrifugeert.Resuspendeer het pellet in verse sorteerbuffer tot een concentratie van 1 tot 5 × 10⁵ cellen per ml en filter de cellen door een 40 micron cell strainer in een nieuwe polystyreen buis van 5 ml. Sorteer de cellen vervolgens via flowcytometrie in drie buizen van 15 ml die 5 ml vers RPMI-medium bevatten om de naïeve B-cellen, geheugen B-cellen en plasmablasten/plasmacellen op te vangen. Wanneer alle cellen zijn geoogst, zaai je de subsets uit in individuele wells van een 12-wells celkweekplaat in vers RPMI-medium bij een concentratie van 1 tot 10 × 10⁵ cellen per ml.Activeer vervolgens de B-cellen met 5 µg CPG ODN 2006 per 1x10⁶ cellen per mL per well in de celkweekincubator gedurende vijf dagen. Voeg aan het einde van de activatie 30 µL 35% ethanol en gedestilleerd water toe aan elke well van de ELISpot-platen gedurende 30 seconden. Vervang vervolgens de ethanol in elke well door 150 µL geautoclaveerd dubbel gedestilleerd water en incubeer de platen vijf minuten bij kamertemperatuur om het resterende ethanol te verwijderen.Voer een PBS-wasbeurt uit, gevolgd door de toevoeging van 50 µL van het polyklonale FAB2-fragment van anti-human IG aan elke put. Was de platen twee keer met PBS, zoals zojuist gedemonstreerd. Blokkeer de aspecifieke binding in elke put met 200 µL verse PBS met BSA gedurende twee uur bij kamertemperatuur.Na een volgende reeks wassingen met PBS, worden de wells geïncubeerd in 100 µL vers RPMI 1640-medium bij 37 °C. Vervang vervolgens het medium in elke ELISpot-well door het juiste aantal geactiveerde B-cellen. Breng het uiteindelijke volume van elke well aan tot 150 µL met vers RPMI-medium en plaats de ELISpot-plaat vervolgens gedurende acht tot 14 uur terug in de celkweekincubator.Gooi aan het einde van de incubatieperiode het medium weg en was de wells vijf keer met 200 µL PBS plus tween20 gedurende drie minuten per wasbeurt. Voeg na de laatste wasbeurt de juiste detectie-antilichamen toe aan de overeenkomstige wells en incubeer de platen gedurende twee uur in het donker. Voeg na een volgende reeks PBS-wasbeurten 50 µL BCIPMBT-substraat toe aan elke well gedurende vijf tot 15 minuten bij kamertemperatuur.Wanneer er paarse vlekken verschijnen, wordt de reactie gestopt met 100 µL dubbel gedestilleerd water per well en wordt de plaat afgespoeld met stromend kraanwater. Laat vervolgens het ELISpot-membraan aan de lucht drogen, beschermd tegen licht. In dit donor PBMC-monster waren, na lyse van rode bloedcellen en uitputting van adherente cellen, ongeveer 10 procent van de lymfocyten CD19-positieve B-cellen.In het B-celcompartiment was ongeveer 50 procent van de cellen CD27-negatieve naïeve B-cellen en 50 procent waren CD27-expresserende geheugen-B-cellen. CPG-behandeling van gezuiverde humane B-cellen en CD19+CD27+ gedurende vijf dagen, zoals zojuist gedemonstreerd, resulteert doorgaans in de generatie van 50 tot 200 IgM- en 10 tot 50 IgG-antilichaamsecreterende cellen vanuit 1 × 10⁴ geactiveerde B-cellen. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze ELISpot-methode in drie uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.Voordat u met deze procedure begint, is het belangrijk om eraan te denken de plek te coderen met geschikte capturereagentia voor het detecteren van de antilichaam-secreterende cellen. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van de vaccinologie om de effectiviteit van vaccins te onderzoeken in grootschalige trials en longitudinale follow-ups. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe menselijke B-cellen uit het bloed kunnen worden gezuiverd.Scheid naïeve en geheugen B-cellen voor hun differentiatie en voer een ELISpot-assay uit om antilichaam-secreterende cellen te kwalificeren. Vergeet niet dat werken met menselijk bloed gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

the-isolation-differentiation-quantification-human-antibody-secreting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Identificatie van microbiële doelstellingen van adaptieve immuniteit in idiopathische ziekte kan worden bewerkstelligd door het gebruik van het enzym-linked immunospot assay.

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Kwantificering van de Th-1 cellulaire immuunreacties tegen microbiële antigenen

In this video, we demonstrate the isolation of B cells from human peripheral blood using biotinylated antibodies specific for non-B cells and streptavidin-conjugated magnetic microbeads.

Isolation and Purification of B Cells from Human Peripheral Blood

In this video, we describe a protocol for the flow cytometry-based sorting of naïve B cell, memory B cell, and plasmablast plasma cell subpopulations from human peripheral blood B cells. The different B cell subpopulations can be distinguished based on fluorophore-based antibody binding to the CD19, CD27, and CD38 receptors expressed on the B cell surfaces, followed by cell sorting.

Flow Cytometry-Based Cell Sorting for Different Circulatory B Cell Populations

This video demonstrates the use of the ELISpot assay to assess the function of antibody-secreting B cells, ASCs. The antibodies secreted by the ASCs interact with the membrane-bound polyclonal antibody fragments, which are detected by the enzyme-conjugated IgG or IgM antibodies. The colored spot produced in each well indicates the presence of the specific antibody's isotype, which correlates with the B cells' secretory activity.

Functional Assessment of Antibody-Secreting B Cells Using ELISpot Assay

Nieuwe generaties van functionele testen zoals gamma interferon (IFN-γ) ELISPOT, die cytokineproductie detecteren op enkele cel en bieden zowel kwantitatieve als kwalitatieve karakterisering van T cel responsen kunnen worden gebruikt om celgemedieerde immuunresponsen tegen varicella zoster beoordelen virus (VZV).

Ontwikkeling van een IFN-γ ELISpot Assay aan varicella-zoster virus-specifieke-cel gemedieerde immuniteit na transplantatie van navelstrengbloed

Een eenvoudige maar effectieve methode die magnetische nanodeeltjes in dienst aan antigeen-reactieve B-cellen voor functionele en fenotypische analyse op te sporen en te verrijken wordt beschreven.

Detectie en Verrijking van zeldzame antigeen-specifieke B-cellen voor analyse van fenotype en functie

Beschrijven we een methode voor de productie van menselijke antilichamen specifiek voor een antigeen van belang vanaf zeldzame B-cellen die in menselijk bloed circuleren. Generatie van deze natuurlijke antilichamen is efficiënt en snel, en de verkregen antilichamen kunnen onderscheid maken tussen sterk verwante antigenen.

Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert

In deze paper beschrijven we een protocol karakteriseren T-afhankelijke en T-onafhankelijke immunoglobulin (Ig) isotype reacties in muizen met behulp van ELISA. Deze methode gebruikt alleen of in combinatie met stroom cytometry onderzoekers te identificeren van verschillen in de B-cel-gemedieerde Ig isotype reacties in muizen na T-afhankelijke en T-onafhankelijke antigeen immunisatie zal toestaan.

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

De BSelex-methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van humane perifere bloed mononucleaire cellen te identificeren en te herstellen combineert Flowcytometrie met eencellige PCR en klonen.

Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

Op volbloed gebaseerde immunoassays bieden een gemakkelijk en hulpbronnenefficiënt hulpmiddel om antigeenspecifieke immuniteit te analyseren voor diagnostische en onderzoeksdoeleinden. Dit artikel biedt een geoptimaliseerd volbloedprotocol met dubbele co-stimulatie voor uitgebreide analyse van de immuniteit van de gastheer tegen schimmel- en virale pathogenen, inclusief een versie met een laag volume voor pediatrische patiënten en kleine dieren.

Volbloedtest met dubbele co-stimulatie voor antigeenspecifieke analyse van de immuniteit van de gastheer tegen schimmel- en virale pathogenen

Leer de ELISpot-methode voor het kwantificeren van antilichaam-uitscheidende B-cellen uit menselijk bloed. Deze techniek maakt detectie op enkelcellig niveau mogelijk voor immunologisch en vaccinonderzoek.

De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit (Video) | JoVE Journal

De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

Meer video's verkennen