De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

Het algemene doel van deze ELISpot-methodologie is om de kwantificering van humane antilichaamsecreterende B-cellen uit het bloed mogelijk te maken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van bio-medische immunologie van B-cellen en vaccinonderzoek. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de detectie en meting van antilichaamsecreterende B-cellen op enkelcellementniveau mogelijk maakt.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Tsung-Chih Tseng, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Direct na het verkrijgen van een bloedmonster van 10 ml uit de mediane cubitale ader in een buisje van 15 ml met kaliumsupplementeerde EDTA, draai je de buis meerdere keren om klontering te voorkomen. Voeg vervolgens 35 ml gesteriliseerde rode bloedcel lyse buffer toe aan de cellen voor een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur.

Wanneer je licht door de buis kunt observeren, centrifugeer je het bloed en bevestig je de aanwezigheid van een wit pellet. Verwijder het resterende lyse buffer met 10 ml's gesteriliseerde PBS en suspendeer het pellet opnieuw in 10 ml van RPMI 1640 medium. Plaats de cellen in een 10 cm kweekschaal voor een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide.

Zwiep vervolgens voorzichtig een paar keer met de kweekschaal en breng de drijvende cellen over in een plastic conische buisje van 15 ml. Na twee wasbeurten door centrifugatie, suspendeer je het pellet opnieuw in vijf tot tien keer tien tot de zesde cellen per ml concentratie in 200 microliter koude PBS buffer en voeg 5 microliter gebiotineerde anti-menselijke antilichaam cocktail toe die specifiek is voor bloedcellen per een keer tien tot de zesde cellen. Na een incubatie van 30 minuten op ijs, was je de cellen in een tienvoudig overschot aan steriel PBS en suspendeer je het pellet in vijf microliter streptavidine geconjugeerde microkralen per een keer tien tot de zesde cellen voor een incubatie van 30 minuten op ijs.

Aan het einde van de incubatie voeg je twee ml PBS buffer toe aan de cellen en plaats je de buis op een magnetische standaard gedurende acht minuten bij kamertemperatuur. Wanneer de microkralen zich aan de wand van de buis hebben gehecht, draag je voorzichtig het supernatant over in een nieuw conisch buisje en voeg je 2 ml meer PBS buffer toe aan de cellen. Na de tweede supernatant verzameling, verzamel je de gepoolde cellen door centrifugatie en breng je de cellen over in een vijf ml polystyreen buisje met vers PBS buffer bij een concentratie van een keer tien tot de zevende cellen per ml.

Na het uitvoeren van niet-specifieke blokkering, voeg je één microgram van elk selectie-antilichaam toe per een keer tien tot de zesde cellen aan de buis met voorzichtig mengen voor een incubatie van 30 minuten op ijs. Tijdens de laatste vijf minuten van de incubatie voeg je vijf microliter 7-AAD toe aan de cellen. Voeg vervolgens twee milliliter vers PBS toe aan de cellen en vortex voor het centrifugeren.

Suspendeer het pellet opnieuw in vers sorteerbuffer bij een concentratie van een tot vijf keer tien tot de zevende cellen per milliliter en filter de cellen door een 40 micron celzeef in een nieuwe vijf milliliter polystyreen buis. Sorteer vervolgens de cellen door middel van flowcytometrie in drie 15 ml buisjes die 5 ml vers RPI-medium bevatten om de naïeve B-cellen, geheugen B-cellen en plasmablastplasmacellen te verzamelen. Wanneer alle cellen zijn geoogst, zaai je de subgroepen in afzonderlijke putjes van een 12-putjes kweekplaat bij een concentratie van een tot tien keer tien tot de vijfde cellen per milliliter in vers RPMI-medium.

Activeer vervolgens de B-cellen met vijf microgram CPG ODN 2006 per een keer tien tot de zesde cellen per milliliter per putje in de kweekincubator gedurende vijf dagen. Aan het einde van de activering, voeg je 30 microliter 35% ethanol en gedistilleerd water toe aan elke put van de ELISpot platen gedurende 30 seconden. Vervang vervolgens het ethanol in elke put door 150 microliter geautoclaveerde dubbel gedestilleerd water en incubeer de platen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om het resterende ethanol te verwijderen.

Voer een PBS wassing uit gevolgd door de toevoeging van 50 microliter van de polyklonale FAB2-fragment van anti-menselijke IG aan elke put. Was de platen twee keer met PBS zoals zojuist gedemonstreerd. Blokkeer de niet-specifieke binding in elke put met 200 microliter vers PBS met BSA gedurende twee uur bij kamertemperatuur.

Na een andere serie PBS wasbeurten, incubeer je de putten in 100 microliter vers RPMI 1640 medium bij 37 graden Celsius. Vervolgens vervang je het medium in elke ELISpot put door het juiste aantal geactiveerde B-cellen. Breng het eindvolume van elke put naar 150 microliter met vers RPMI medium en plaats de ELISpot plaat terug in de kweekincubator gedurende acht tot veertien uur.

Aan het einde van de incubatieperiode, gooi je het medium weg en was je de putten met 200 microliter PBS plus tween20 voor vijf, drie minuten wasbeurten. Na de laatste wassing, voeg je de juiste detectie-antilichamen toe aan hun corresponderende putten en incubeer je de platen gedurende twee uur in het donker. Na een andere serie PBS wasbeurten voeg je 50 microliter BCIPMBT substraat toe aan elke put gedurende vijf tot vijftien minuten bij kamertemperatuur.

Wanneer er paarse vlekken verschijnen, stop je de reactie met 100 microliter dubbel gedestilleerd water per put en spoel je de plaat af met stromend kraanwater. Laat vervolgens de ELISpot membraan beschermd tegen licht drogen. In dit donor PBMC-monster, na lyse van rode bloedcellen en verwijdering van adherente cellen, was ongeveer 10 procent van de lymfocyten CD19 positieve B-cellen.

In het B-celcompartiment was ongeveer 50 procent van de cellen CD27 negatieve naïeve B-cellen en 50 procent waren CD27 expresserende geheugen B-cellen. CPG-behandeling van gezuiverde humane B-cellen en CD19+CD27+ gedurende vijf dagen zo