Name: Bacteriële Inner-membraan Display voor het screenen van een bibliotheek van antilichaamfragmenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Leer het screenen van antilichaamfragmenten voor bindingsaffiniteit en oplosbaarheid met behulp van het twin-arginine translocatiepad van Escherichia coli. Deze methode maakt effectieve intracellulaire antilichaamengineering mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Tomer Zohar voor het werk aan scFv screenings- en karakteriseringsassays. Een deel van dit werk werd ondersteund door toekenning nummer F32CA150622 van het National Cancer Institute (aan AJK). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Cancer Institute of de National Institutes of Health.

<ol><li>Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., Campioni, N., Cattaneo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+immunization+with+cytosolic+recombinant+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Intracellular immunization with cytosolic recombinant antibodies.</a> Biotechnology (NY). 12 (4), 396-399 (1994).</li>
<li>Chen, S. Y., Bagley, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+antibodies+as+a+new+class+of+therapeutic+molecules+for+gene-therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intracellular antibodies as a new class of therapeutic molecules for gene-therapy.</a> Hum. Gene Ther. 5 (5), 595-601 (2008).</li>
<li>Gargano, N., Biocca, S., Bradbury, A., Cattaneo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+recombinant+antibody+fragments+neutralizing+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+provide+an+experimental+basis+for+the+structural+classification+of+the+DNA+polymerase+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human recombinant antibody fragments neutralizing human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase provide an experimental basis for the structural classification of the DNA polymerase family.</a> J Virol. 70 (11), 7706-7712 (1996).</li>
<li>Mhashilkar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+Tat-mediated+LTR+transactivation+and+HIV-1+infection+by+anti-Tat+single+chain+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 Tat-mediated LTR transactivation and HIV-1 infection by anti-Tat single chain intrabodies.</a> Embo J. 14 (7), 1542-1551 (1995).</li>
<li>Strube, R. W., Chen, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anti-cyclin+E+single-chain+Fv+antibodies+and+intrabodies+in+breast+cancer+cells%3A+enhanced+intracellular+stability+of+novel+sFv-F-c+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Characterization of anti-cyclin E single-chain Fv antibodies and intrabodies in breast cancer cells: enhanced intracellular stability of novel sFv-F-c intrabodies.</a> J. Immunol. Meth. 263 (1-2), 149-197 (2002).</li>
<li>Mössner, E., Koch, H., Plückthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+selection+of+antibodies+without+antigen+purification%3A+adaptation+of+the+protein+fragment+complementation+assay+to+select+antigen-antibody+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fast selection of antibodies without antigen purification: adaptation of the protein fragment complementation assay to select antigen-antibody pairs.</a> J. Mol. Biol. 308 (2), 115-122 (2001).</li>
<li>Wörn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+in+vitro+stability+and+in+vivo+performance+of+anti-GCN4+intrabodies+as+cytoplasmic+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors.</a> J Biol Chem. 275 (4), 2795-2803 (2000).</li>
<li>Knappik, A., Plückthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+turns+of+a+recombinant+antibody+improve+its+in+vivo+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineered turns of a recombinant antibody improve its in vivo folding.</a> Protein Eng. 8 (1), 81-89 (1995).</li>
<li>Martineau, P., Jones, P., Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+antibody+fragment+at+high+levels+in+the+bacterial+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of an antibody fragment at high levels in the bacterial cytoplasm.</a> J Mol Biol. 280 (1), 117-127 (1998).</li>
<li>Steipe, B., Schiller, B., Plückthun, A., Steinbacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+statistics+reliably+predict+stabilizing+mutations+in+a+protein+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain.</a> J. Mol. Biol. 240 (3), 188-192 (1994).</li>
<li>Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+with+bacterial+display%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering with bacterial display.</a> Curr Opin Struct Biol. 17 (4), 474-480 (2007).</li>
<li>Lener, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverting+a+protein+from+its+cellular+location+by+intracellular+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Diverting a protein from its cellular location by intracellular antibodies.</a> Eur. J. Biochem. 267 (4), 1196-1205 (2000).</li>
<li>Lynch, S. M., Zhou, C., Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+scFv+intrabody+against+the+nonamyloid+component+of+%CE%B1-synuclein+reduces+intracellular+aggregation+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An scFv intrabody against the nonamyloid component of α-synuclein reduces intracellular aggregation and toxicity.</a> J. Mol. Biol. 377 (1), 136-147 (2008).</li>
<li>Gai, S. A., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+for+protein+engineering+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display for protein engineering and characterization.</a> Curr. Opin. Struc. Biol. 17 (4), 467-473 (2007).</li>
<li>Kieke, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+functional+T+cell+receptor+mutants+from+a+yeast+surface-display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (10), 5651-5656 (1999).</li>
<li>Steiner, D., Forrer, P., Stumpp, M. T., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+sequences+directing+cotranslational+translocation+expand+the+range+of+proteins+amenable+to+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Signal sequences directing cotranslational translocation expand the range of proteins amenable to phage display.</a> Nat. Biotechnol. 24, 823-831 (2006).</li>
<li>Pugsley, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+general+secretory+pathway+in+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria.</a> Microbiol. Rev. 57 (1), 50-108 (1993).</li>
<li>Rapoza, M. P., Webster, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+filamentous+bacteriophage+assembly+proteins+require+the+bacterial+SecA+protein+for+correct+localization+to+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The filamentous bacteriophage assembly proteins require the bacterial SecA protein for correct localization to the membrane.</a> J. Bacteriol. 175 (6), 1856-1859 (1993).</li>
<li>Karlsson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+antibody+fitness+and+function+using+membrane-anchored+display+of+correctly+folded+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering antibody fitness and function using membrane-anchored display of correctly folded proteins.</a> J. Molec. Biol. 416 (1), 94-107 (2012).</li>
<li>DeLisa, M. P., Tullman, D., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+quality+control+in+the+export+of+proteins+by+the+bacterial+twin-arginine+translocation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Folding quality control in the export of proteins by the bacterial twin-arginine translocation pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 6115-6120 (2003).</li>
<li>Fisher, A. C., Kim, W., DeLisa, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+selection+for+protein+solubility+enabled+by+the+folding+quality+control+feature+of+the+twin-arginine+translocation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic selection for protein solubility enabled by the folding quality control feature of the twin-arginine translocation pathway.</a> Protein Sci. 15 (3), 449-458 (2006).</li>
<li>Maynard, J., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Antibody engineering.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 339-376 (2000).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1, Fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioNumbers--the+database+of+key+numbers+in+molecular+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioNumbers--the database of key numbers in molecular and cell biology.</a> Nucleic Acids Res. 38, D750-D753 (2010).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Third, Elsevier/Academic Press. (2013).</li>
<li>Tayapiwatana, C., Chotpadiwetkul, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+using+streptavidin+magnetic+bead-sorted+in+vivo+biotinylated+survivin+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach using streptavidin magnetic bead-sorted in vivo biotinylated survivin for monoclonal antibody production.</a> J Immunol Methods. 317 (1-2), 1-11 (2006).</li>
<li>Zhu, G., Song, L., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+inhibition+of+nucleosome+mobility+and+transcription+by+cisplatin-DNA+interstrand+crosslinks+in+live+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Visualizing inhibition of nucleosome mobility and transcription by cisplatin-DNA interstrand crosslinks in live mammalian cells.</a> Cancer Res. 73 (14), 4451-4460 (2013).</li>
<li>Bogsch, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+component+of+a+novel+bacterial+protein+export+system+with+homologues+in+plastids+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An essential component of a novel bacterial protein export system with homologues in plastids and mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 18003-18006 (1998).</li>
<li>Julian, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+affinity+and+stability+of+grafted+amyloid-motif+domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng.+Des.+Sel%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of affinity and stability of grafted amyloid-motif domain antibodies.</a> Protein Eng. Des. Sel. 28 (10), 339-350 (2015).</li>
<li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies+rise+again%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies rise again.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 13 (11), 799-801 (2014).</li>
<li>Marschall, A. L., Dübel, S., Böldicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+in+vivo+knockdown+of+protein+function+by+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Specific in vivo knockdown of protein function by intrabodies.</a> MAbs. 7 (6), 1010-1035 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Engineering van antilichamen voor cytoplasmatische activiteit is een moeilijke taak vanwege het reducerende milieu van het cytoplasma, die de vorming van stabiliserende disulfidebindingen 6,7 belemmert. Dit veroorzaakt de meeste antilichamen cytoplasmatisch inactief tenzij zij zijn ontworpen voor stabiliteit en oplosbaarheid in het cytoplasma, naast het feit ontworpen voor bindingsaffiniteit. De bestaande methoden van faagdisplay, bacteriële oppervlakte-en gist oppervlakte-methoden gebruiken allemaal de secretieroute 14-16 voor de weergave van gemanipuleerde antilichamen, maar deze werkwijzen hebben geen middelen om intracellulaire vouwen ingenieur. Antilichamen gemanipuleerd middels binnenste membraan beeldscherm hebben cytoplasmatische stabiliteit en oplosbaarheid verbeterd doordat het vouwen kwaliteitscontrole van de Tat pathway voorkomt translocatie van antilichamen die slecht gevouwen en stabiel in het cytoplasma. Deze methode vereenvoudigt het iteratief proces engineering intracellulaire antilichamen voor een affiniteitnd oplosbaarheid, de twee eigenschappen zijn gemanipuleerd in één stap. Hoewel deze methode is ontworpen voor engineering antilichamen met oplosbaarheid in het reducerende intracellulaire omgeving, kan het ook worden toegepast op technische antilichamen functioneren in niet-reducerende omstandigheden, omdat de eiwitten ontworpen met behulp van deze methode behouden hun vouwen in de oxiderende omgeving van het periplasma. Hoewel deze techniek vereenvoudigt het proces van engineering van antilichamen met een hoge affiniteit en hoge cytoplasma oplosbaarheid, een aantal beperkingen zijn belangrijk om te overwegen bij het gebruik van dit protocol. Bij de analyse van secundaire screening ELISA signalen te identificeren veelbelovende scFv varianten, de drempel voor veeleisende tussen potentieel interessante varianten en die adequate antigeenbindend niet kan vertonen waarschijnlijk niet duidelijk tot na verscheidene klonen verder gekarakteriseerd. Het is belangrijk om te zoeken naar verbeterde binding via ouderlijke antilichaam; echter,een abnormaal hoog signaal kan indicatief aviditeit 29 of aggregatie effecten 30, een uitdaging die niet uniek is voor de binnenste membraan weergave screening aanpak. Een belangrijke beperking te onthouden bij gebruik van dit protocol is het onvermogen om sferoplasten herstellen na panning, die immers niet-levende (ongepubliceerde gegevens). Dit vereist de DNA-amplificatie en transformatie stappen om de antilichaam coderend plasmiden herstellen. Verschillende kritische stappen van het protocol in te schakelen de simultaneous engineering van het vouwen en binden van antilichamen. Voor screening succesvol te zijn, moet de scFv-bank wordt gescreend worden uitgedrukt als een fusie met het ssTorA signaalpeptide. Zonder deze procedure stelt antilichamen niet worden gericht op de Tat pathway en bijgevolg niet worden getransloceerd naar het periplasma 19. Bovendien is het noodzakelijk dat een C-terminale epitoop tag gefuseerd met de antilichamen om detectie van de geëxposeerde antilichamen toe in de prullenbakding assays. Duidelijk, E. coli stam gebruikt om de scFvs moet ook de nodige Tat pathway machines drukken, maar dit geldt voor de gebruikte E. coli. Wijzigingen in dit protocol zijn mogelijk om zijn potentieel te verbeteren om antilichamen met de gewenste eigenschappen te isoleren. Een subtractieve panning stap kan voorafgaand aan panning tegen het doelwit antigeen aan de scFv bibliotheek van niet-gewenste bestanddelen afbreken worden afgerond. De bibliotheek sferoplasten kunnen worden geïncubeerd met magnetische bolletjes gecoat met BCCP alleen of bekleed met een niet-gewenste eiwit, en de sferoplasten die binden aan de kralen kunnen worden verwijderd voor het screenen van de resterende ongebonden sferoplasten voor binding aan het gewenste doel. Zoals in het Representatieve resultaten, een werkwijze ter verbetering van de affiniteit van een geïsoleerde scFv is een oplosbare concurrent in de panning reactie te concurreren met de informatie op de sferoplasten scFvs omvatten. Omdat de oplosbare compingetitor is een gezuiverd eiwit, geen DNA wordt geamplificeerd uit, dus alleen sequenties van de informatie op de sferoplasten scFvs wordt de PCR-reactie worden gewonnen. Daarnaast kan deze werkwijze worden uitgebreid naar andere typen techniek antilichamen of niet-antilichaam bindende eiwitten. E. coli binnenste membraan beeldscherm is een krachtig platform voor engineering antilichamen met hoge affiniteit en hoge niveaus van intracellulaire oplosbaarheid. Deze methode is bijzonder geschikt voor efficiënte engineering van antilichamen zijn ontworpen om te functioneren in de intracellulaire omgeving. Deze intracellulaire antilichamen worden reeds onderzocht als potentiële geneesmiddelen in een aantal gebieden, met inbegrip van neurodegeneratieve ziekten, kanker en virale infecties 31. Deze techniek wordt meer algemeen gebruik van intracellulaire antilichamen als hulpmiddelen voor onderzoek en geneeskunde op deze gebieden en elk ander gebied waarop bestuderen een eiwitdoel in situ gewenst mogelijk.

Antilichamen kunnen vouwen en functioneren in de intracellulaire omgeving zijn veelbelovend gereedschap voor zowel onderzoek en therapeutische toepassingen. Ze hebben het vermogen om eiwitten te moduleren door te binden aan een doeleiwit in cellen voorkomen eiwit-eiwit interacties verstoren eiwit-nucleïnezuur interacties of substraattoegang enzymen 1-5 voorkomen. Hoewel antilichamen veel mogelijkheden voor intracellulaire toepassingen, engineering van hen om juiste vouwing en oplosbaarheid in de intracellulaire omgeving, terwijl de mogelijkheid om te binden aan een doelwit antigeen uitdaging. De reducerende cytoplasmatische omgeving voorkomt de vorming van de disulfide bindingen normaliter voor de stabiele vouwen van full-length antilichamen en antilichaamfragmenten, waaronder enkele keten variabel fragment (scFv) antilichamen 6,7. Een aantal gerichte evolutie benaderingen zijn gebruikt om antilichamen met h engineeroge affiniteiten voor target antigenen 8-10. Deze benaderingen vaak gebruikt faagdisplay, gist oppervlakte-of bacteriële oppervlakte-grote libraries van antilichamen 11-13 screenen. Deze werkwijzen zijn krachtig en effectief voor het identificeren van antilichamen die binden aan doelen, maar ze zijn afhankelijk van de secretieroute eiwitten die wordt weergegeven 14-16 vervoeren. De secretieroute translocatie ongevouwen eiwitten in het cytoplasma vermindering in het endoplasmatisch reticulum lumen in gist of in het periplasma van bacteriën. De eiwitten vouw onder oxiderende omstandigheden en worden weergegeven op het celoppervlak of verpakt in faagdeeltjes te screenen op bindingsaffiniteit 17,18. Hierdoor antilichamen die middels deze technieken niet noodzakelijkerwijs goed vouwen in de cytoplasma en intracellulaire oplosbaarheid moeten vaak afzonderlijk worden gemanipuleerd wanneer de antilichamen worden gebruikt voor intracellulaire toepassingen. Verbeterende doeltreffendheid van technische antilichamen die goed gevouwen in het cytoplasma, we eerder gemeld het succes van MAD-TRAP (membraan-verankerde display Tat-gebaseerde herkenning associëren eiwitten), een werkwijze voor het screenen van een antilichaam scFv bibliotheek die Escherichia coli binnen- membraan-display 19. Bacteriële binnenste membraan weergave afhankelijk van de twin-arginine translocatie (Tat) pathway voor het transporteren van geëxposeerde antilichamen, in tegenstelling tot andere gemeenschappelijke weergavemethoden de secretieroute gebruiken. De Tat pathway bevat een mechanisme voor kwaliteitscontrole waardoor slechts oplosbaar, correct gevouwen eiwitten worden vervoerd van de E. coli cytoplasma, over het binnenste membraan, en in het periplasma 20,21. Overexpressie Tat substraten (bijv., Eiwitten gericht op de Tat pathway met een N-eindstandige fusie met het Tat signaalpeptide ssTorA) die goed gevouwen in het cytoplasma vormen een langlevende translocatie tussenproduct de N-terminus in het cytoplasma en de C-terminus in het periplasma 19. Dit maakt weergave van correct gevouwen Tat substraten, waaronder antilichaamfragmenten, aan de periplasmatische zijde van het E. coli binnenste membraan. Na verwijdering van het buitenmembraan door enzymatische digestie sferoplasten produceren worden antilichamen blootgesteld aan de extracellulaire ruimte (figuur 1). Hierdoor kan Tat substraten op het binnenmembraan worden gescreend op binding aan een specifiek doel. Belangrijker is het benutten van de Tat pathway van celoppervlak scherm zorgt ervoor dat alleen de antilichamen in de bibliotheek die goed gevouwen in het cytoplasma wordt ondervraagd voor binding, het gelijktijdig engineering van bindingsaffiniteit en intracellulaire vouwen. In dit protocol beschrijven we hoe u een scFv-bibliotheek op de E. tonen coli binnenste membraan, pan de bibliotheek tegen een doelantigeen, en het uitvoeren van een tweede scherm om de meest veelbelovende bestanddelen van de bibliotheek te identificeren. Terwijl we ons richten<html> het protocol inzake scFvs, kan de methode worden toegepast op engineering van een eiwit waarvan de toepassing vereist binding en intracellulaire vouwen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig1.jpg" /> Figuur 1. Tat binnenste membraan-display. In E. coli, scFv antilichamen die tot expressie worden gebracht als een fusie met het ssTorA signaalsequentie correct gevouwen en in het cytoplasma getransporteerd over het binnenmembraan. Een translocatie tussenvormen, waarbij de scFvs verankerd in de binnenmembraan van de N-terminus in het cytoplasma en de C-terminus in het periplasma. E. coli buitenmembraan enzymatisch gedigereerd sferoplasten vormen, waarbij het verankerde antilichamen blootgesteld aan de extracellulaire ruimte en beschikbaar voor detectie door toepassing van een antilichaam dat bindt aan de C-terminaal gesmolten epitooplabel het geëxposeerd antilichaam.load / 54583 / 54583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

<table><tbody><tr><td>scFv bibliotheek</td><td>Varies</td><td></td><td>Een geschikte scFv bibliotheek moet worden verkregen bij een commerciële of academische bron.</td></tr><tr><td>MC4100 E. coli cellen</td><td>Coli Genetic Stock Center</td><td>6152</td><td>Cellen moeten chemisch competent of elektrocompetent zijn, afhankelijk van de gekozen transformatiemethode.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Difco gedehydrateerd kweekmedium LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenicol (Cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat, dibasisch (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat, monobasisch (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,5 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3790-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>VWR</td><td>97043-564</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2646100</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-1</td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix (cellysis detergent)</td><td>EMD Millipore</td><td>71456</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO, 3.000 daltons</td><td>GE Healthcare Sciences</td><td>28932240</td><td></td></tr><tr><td>Doel-antigeen</td><td>Varies</td><td>N/A</td><td>Gepuurd doel-antigeen kan worden gekocht of geproduceerd/gezuiverd.</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 magneet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Buisrotator</td><td>VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>PCR-primers</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Primersequenties zijn zoals beschreven in het protocol.</td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase reactiebuffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynukleotidkinase (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td>Zorg ervoor dat de T4 ligase buffer die wordt gebruikt in de primerfosforyleringsreactie 1 mM ATP bevat.&nbsp;</td></tr><tr><td>5x Phusion HF bufferpack</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) oplossingsmix, 10 mM elk dNTP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td>Andere high-fidelity polymerases kunnen als alternatief worden gebruikt, maar de annealing temperatuur in Tabel 3 moet worden aangepast.</td></tr><tr><td>C1000 Touch thermocycler met dubbele 48/48 fast reactiemodule</td><td>Bio-Rad</td><td>185-1148</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel kleurstof</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV gel en PCR reinigingssysteem</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Microdialyse membraanfilter</td><td>EMD Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>96-well polystyreen ronde bodem celcultuur platen</td><td>VWR</td><td>10062-902</td><td></td></tr><tr><td>Costar algemene polystyreen assay plaatdeksels</td><td>Corning</td><td>3931</td><td></td></tr><tr><td>Microtiterplaat shaker</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 wel EIA/RIA Easy Wash heldere platte bodem polystyreen hoge bind microplaat</td><td>Corning</td><td>3369</td><td></td></tr><tr><td>Bel-blotter polycarbonaat 96-wel replicerend gereedschap</td><td>Bel-Art Products</td><td>378760002</td><td></td></tr><tr><td>Instant non-vet droge melk</td><td>Quality Biological</td><td>A614-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polysorbaat 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>PopCulture reagens (geconcentreerd cellysis detergent)</td><td>EMD Millipore</td><td>71092-3</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) antilichaam geproduceerd in muis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast OPD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9187-50SET</td><td></td></tr><tr><td>Zwavelzuur (H2SO4), 10&nbsp;N oplossing</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds Wrap aluminiumfolie</td><td>VWR</td><td>89079-075</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Epoch microplaatspectrofotometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>11120570</td><td></td></tr></tbody></table>

bacteriële inner-membraan display voor het screenen van een bibliotheek van antilichaamfragmenten

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antilichamen die zijn ontworpen voor intracellulaire functie, moeten niet alleen affiniteit hebben voor hun doel-antigeen, maar ook oplosbaar zijn en correct worden gevouwen in het cytoplasma. Veelgebruikte methoden voor het weergeven en screenen van recombinante antilichaambibliotheken bevatten geen kwaliteitscontrole voor het vouwen van intracellulaire eiwitten en daarom moeten de antigeenbindende capaciteit en het cytoplasmatische vouwen en de oplosbaarheid van antilichamen die met deze methoden zijn ontworpen, vaak afzonderlijk worden geconstrueerd. Hier beschrijven we een protocol om een recombinante bibliotheek van single-chain variabele fragment (scFv) antilichamen te screenen op antigeenbinding en correct cytoplasmatisch vouwen tegelijkertijd. De methode benut het intrinsieke intracellulaire vouwenkwaliteitscontrolemechanisme van de Escherichia coli twin-arginine translocatie (Tat) route om een scFv-bibliotheek op het E. coli binnenmembraan weer te geven. De Tat-route zorgt ervoor dat alleen oplosbare, goed gevouwen eiwitten uit het cytoplasma worden getransporteerd en op het binnenmembraan worden weergegeven, waardoor slecht gevouwen scFvs worden geëlimineerd voordat ze worden onderzocht op antigeenbinding. Na verwijdering van het buitenmembraan, worden de scFvs die op het binnenmembraan worden weergegeven, gepanneerd tegen een doel-antigeen dat is geïmmobiliseerd op magnetische kralen om scFvs te isoleren die aan het doel-antigeen binden. Een op een enzym-gekoppelde immunosorberend test (ELISA) gebaseerde secundaire screening wordt gebruikt om de meest veelbelovende scFvs te identificeren voor aanvullende karakterisering. Antigeenbinding en cytoplasmatische oplosbaarheid kunnen worden verbeterd met daaropvolgende rondes van mutagenese en screening om antilichamen met hoge affiniteit en hoge cytoplasmatische oplosbaarheid voor intracellulaire toepassingen te ontwerpen.

De intracellulaire eiwitvouwing kwaliteitscontrole mechanisme van de Tat pathway van E. coli beperkt transport over de binnenste celmembraan eiwitten die goed gevouwen in het reducerende cytoplasmatische milieu. Door overexpressie een fusie van een scFv met de ssTorA signaalsequentie (de signaalsequentie van het eiwit TORA, dat van nature wordt getransporteerd door de Tat pathway 20), wordt translocatie geblokkeerd, waardoor weergave van scFvs op het binnenste membraan 19. Na enzymatische verstoring van de buitenmembraan zijn de geëxposeerde antilichamen beschikbaar gesteld voor het screenen op antigeenbindingsactiviteit. De mogelijkheid om te profiteren van de Tat pathway van scFv weergave werd aangetoond door Karlsson et al. 19 (figuur 6). De scFv antilichamen scFv13 en scFv13.R4 werden gefuseerd aan ofwel de natieve sequentie ssTorA of een gemodificeerde ssTorA dat de arginine-arginine residu pair erkend mistde Tat pathway. scFv13.R4 werd ontwikkeld door Martineau et al. van scFv13 door middel van vier ronden van gerichte evolutie en is bekend om goed vouwen in de cytoplasma 9. Dit scFv werd op het binnenste membraan, maar alleen uitgedrukt als een fusie met de natieve signaalsequentie ssTorA (figuur 6). In tegenstelling, scFv13 niet goed gevouwen cytoplasmatisch 9, zodat het niet goed op het binnenste membraan, ongeacht de signaalsequentie waaraan het is gefuseerd. Bovendien, als de scFvs werden tot expressie gebracht in cellen die de TatC eiwit, een essentieel onderdeel van het Tat machine 20,28 ontbrak, vertoning werd niet waargenomen, waaruit het belangrijke verband tussen binnenste membraan display en de Tat pathway. Deze resultaten demonstreren dat alleen eiwitten die de Tat signaalpeptide bevatten en die correct in het cytoplasma worden gevouwen worden op het binnenste membraan, waardoor transport door de Tat pathway te functioneren als een scherm voor intracellulaire folding. <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig6.jpg" /> Figuur 6. Detectie van scFvs weergegeven op het binnenste membraan. Flowcytometrie-analyse werd uitgevoerd om de weergave van slecht gevouwen scFv13 en goed gevouwen scFv13.R4 detecteren op het binnenste membraan. scFvs werden gefuseerd met natieve ssTorA of ssTorA (KK), waarbij de Arg-Arg pair in ssTorA sequentie werd gemodificeerd om Lys-Lys. Het C-terminale FLAG-epitoop tags op de scFvs werden gedetecteerd met een fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd anti-FLAG antilichaam. Cellen zonder TatC eiwit (ΔtatC) en ssTorA-scFv13 zonder de FLAG tag werden getest als controles. M geeft de mediane fluorescentie waarde. Overgenomen uit referentie 19 met toestemming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <p class="jove_content" fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Inner-membraan scherm kan succesvol scFv antilichamen te isoleren met een hoge affiniteit voor een doeleiwit en hoge niveaus van cytoplasmatische oplosbaarheid. Bovendien, de daaropvolgende ronden van gerichte evolutie gebruik binnenste membraan-scherm te verbeteren antilichaam kenmerken 19. Om dit aan te tonen, een voor fouten gevoelige PCR bibliotheek op basis van scFv13, dat een lage bindingsaffiniteit voor β-galactosidase is, is gepand tegen het doelantigeen β-galactosidase Display en panning werkwijze beschreven in het protocol. scFv 1-4 werd geïsoleerd na één ronde van mutagenese en panning en hadden hogere bindingsaffiniteit voor p-galactosidase dan scFv13 (figuur 7A) en een hogere oplosbaarheid cytoplasma (Figuur 7B). Een nieuwe bibliotheek op basis van scFv 1-4, werd gemaakt met voor fouten gevoelige PCR en panning van deze tweede generatie bibliotheek tegenβ-galactosidase werd uitgevoerd met een modificatie van het protocol beschreven. De panning tegen β-galactosidase voor de tweede ronde van ontwikkeling werd uitgevoerd in de aanwezigheid van gezuiverde, oplosbare scFv 14 als concurrent van de waarschijnlijkheid isoleren klonen met hogere affiniteit dan scFv 1-4 verbeteren. Na deze tweede ronde van mutagenese en panning, scFv en scFv 2-1 2-3 werden geïsoleerd met behulp van de ELISA-gebaseerde secundaire screening. Deze scFvs niet alleen hadden hogere bindingsaffiniteit voor β-galactosidase dan scFv13, maar vertoonden betere binding dan de eerste ronde scFv kloon 1-4. scFv 2-1 vertoonden β-galactosidase binding vergelijkbaar met die van scFv13.R4 (figuur 7A). scFv 2-3 toont ook een verdere toename van cytoplasmatische oplosbaarheid vergeleken met scFv 14, aandacht voor de gelijktijdige engineering van oplosbaarheid en antigeenbindende. Aangezien affiniteit en oplosbare expressie van de scFvs worden gescreend voor het gelijktijdig, is het mogelijk dat een geselecteerde scFv is moderate oplosbaarheid maar hoge binding of vice versa. Bijvoorbeeld, scFv 2-1 een lagere expressie dan oplosbare scFv 2-3, maar vertoont hogere bindingsaffiniteit voor p-galactosidase. <img alt="figuur 7" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig7.jpg" /> Figuur 7. Target-binding en cytoplasmatische expressie van scFv varianten die middels binnenste membraan display. (A) scFvs werden uitgedrukt in het cytoplasma van E. coli-cellen (bijv., zonder dat de ssTorA signaalsequentie) met een hexahistidine (6 x His) tag en gezuiverd met behulp van nikkel-nitrilotriazijnzuur spin-kolommen. De binding van het gezuiverde scFvs aan P-galactosidase werd gemeten met een ELISA. Gezuiverde scFvs werden op-β-galactosidase beklede ELISA platen en gebonden scFvs werden gedetecteerd met een anti-6 x His antilichaam. De gegevens zijn een gemiddelde van zes herhalingen, en de fout balk toont standaardafwijking van het gemiddelde.(B) De oplosbare en onoplosbare fracties van cellysaten van cellen die het cytoplasmatisch scFvs werden geanalyseerd met een Western blot geprobed met een anti-6 x His antilichaam. Totale eiwitconcentratie werd gebruikt voor het laden van de monsters te normaliseren. Herdrukt (A) en aangepast (B) uit referentie 19 met toestemming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

We bieden een methode om gelijktijdig een bibliotheek van antilichaamfragmenten te screenen op bindingsaffiniteit en cytoplasmatische oplosbaarheid door gebruik te maken van de Escherichia coli twin-arginine translocatieroute, die een inherente kwaliteitscontrolemechanisme heeft voor intracellulaire eiwitvouwing, om de antilichaamfragmenten op het binnenmembraan weer te geven.

Bacteriële Inner-membraan Display voor het screenen van een bibliotheek van antilichaamfragmenten

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Het algemene doel van deze procedure is om de kwaliteitscontrole van de vouwing van het twin-arginine translocatiepad te benutten om de binding en intracellulaire vouwing van antilichaamfragmenten in één stap te manipuleren, wat toepassingen heeft bij het ontwerpen van antilichamen die intracellulair functioneren. Deze methode kan helpen bij het overwinnen van belangrijke uitdagingen in het veld van antilichaam engineering, zoals de moeilijkheid om antilichamen zo te modificeren dat ze correct vouwen en functioneren in de reducerende cytoplasmatische omgeving. Alleen antilichamen die goed vouwen in het cytoplasma worden gepresenteerd en getest op binding.Dit biedt een voordeel ten opzichte van gist- en fagedisplay, die voor de presentatie afhankelijk zijn van secretiepaden. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot onze therapie voor neurodegeneratieve ziekten, kanker en virale infecties, omdat deze ziekten een intracellulaire pathogenese omvatten die met antilichamen kan worden aangepakt. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat het begrijpen van het genereren en werken met sferoplasten uitdagend is.Nadat de scFv-bibliotheek is gefuseerd met de ssTorA-signaalsequentie en drie uur lang bij 37 °C onder schudcondities is gekweekt, wordt de expressie van de scFv-bibliotheek overnight gedurende 15 tot 22 uur bij 20 °C en 225 rpm toegestaan. Meet na de incubatie met een spectrofotometer de optische dichtheid bij 600 nm. Centrifugeer vervolgens het berekende volume van de geïnduceerde cultuur in een microcentrifugebuis van 1,5 mL bij 12.000 ×g en kamertemperatuur gedurende vijf minuten.Verwijder het supernatant en gebruik 100 µL ijskoude fractioneringsbuffer of fB om de pellets te resuspenderen. Centrifugeer de monsters vervolgens bij 12 000 ×g en kamertemperatuur gedurende één minuut. Verwijder het supernatant en gebruik 350 µL ijskoude fB aangevuld met 3,5 µL lysozym van 10 mg/mL om de pellets te resuspenderen.Voeg vervolgens, terwijl de buisjes langzaam worden gevortext, druppelsgewijs 700 µL 1 mM EDTA toe en incubeer de buisjes vervolgens 20 minuten bij kamertemperatuur op een buisjesrotator om de monsters te mengen. Haal de buisjes uit de rotator. Voeg aan elk buisje 50 µL ijskoude 0,5 M MgCl2 toe en incubeer deze 10 minuten op ijs.Centrifuge de monsters vervolgens bij 11.000 ×g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Trek nu met een micropipet en een tip van één milliliter langzaam een deel van de pellet op. Houd de buis vervolgens onder een hoek vast, met de opening direct boven een nieuwe buis van 1,5 milliliter, til de pipetpunt langzaam uit het supernatant en schuif de pellet in de nieuwe buis.Verwijder het overtollige supernatant en gebruik één milliliter ijskoud PBS om de sferoplasten te resuspenderen. Sferoplasten moeten volledig geresuspendeerd zijn vóór het pannen, omdat niet-bindende scFv's in aggregaten zullen leiden tot fout-positieve resultaten tijdens het pannen. Nadat het doelantigeen volgens het tekstprotocol is gebiotineerd, worden de streptavidine-gecoate magnetische beads in hun oorspronkelijke flacon geresuspendeerd.Breng vervolgens zeven tot 10 × 10⁹ beads over naar een buisje van 1,5 milliliter. Plaats het buisje met de beads gedurende twee minuten op het magneetrek om de beads tegen de wand van het buisje te verzamelen en verwijder het supernatant zorgvuldig met een pipet. Haal het buisje van de magneet en resuspendeer de beads met PBS zonder luchtbellen te vormen.Plaats de buis vervolgens terug in de magneet en verwijder de buffer voordat de beads nog twee keer worden gewassen met PBS. Voeg één milliliter lysaat met het gebiotineerde antigeen toe aan de beads en laat dit 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur onder zachte rotatie. Was de beads na de incubatie vijf keer met PBS met 1%BSA.Gebruik vervolgens PBS met 1% BSA om de beads opnieuw te suspenderen. Om de scFv-bibliotheek te screenen, begint u met het toevoegen van 4 x 10⁹ sferoplasten en 8 x 10⁸ beads aan een steriele buis van 15 milliliter. Voeg 1x PBS met 1% BSA toe om het totale volume aan te vullen tot vier milliliter. Verdeel vervolgens de oplossing over vier buisjes van 1,5 milliliter in aliquoten van één milliliter en incubeer de reacties gedurende vijf uur bij vier graden Celsius onder zachte rotatie. Om de aan de beads gebonden sferoplasten voor PCR voor te bereiden, plaatst u de panning-reactiebuisjes drie minuten op de magneet. Verwijder het supernatant en was de beads vier keer met één x PBS met 1%BSA, zoals eerder beschreven.Gebruik vervolgens 25 µL ddH20 per buis om de beads te resuspenderen. Voer, zoals beschreven in het tekstprotocol, een whole plasmid PCR uit om de genen voor bead-gebonden scFv's te amplificeren en recirculariseer vervolgens het plasmide vanuit het PCR-product. Transformeer de volledige reactie in geëgaliseerde MC4100-cellen volgens het tekstprotocol.Om klonen via ELISA te identificeren, wordt één buis van de gepande subbibliotheek ontdooid en uitgeplaat op LB-agarplaten. Voeg 200 µL LB met 20 µg/mL chloramfenicol toe aan elke put van een 96-wells kweekplaat met ronde bodem. Pak met een pipetpunt een individuele kolonie van de agarplaat.Plaats vervolgens de pipetpunt in de eerste put van de 96-wellplaat en roer voorzichtig om te inoculeren. Ga op dezelfde wijze verder door één kolonie in elke put te inoculeren. Incubeer gedurende 20 tot 24 uur bij 37 graden Celsius op een microplate-shaker.Nadat een coatingoplossing van het doelangeneen is voorbereid volgens het tekstprotocol, worden 50 µL van de oplossing aan elke well van een 96-well high-binding heldere polystyreen ELISA-plaat toegevoegd. Incubeer de platen gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Vervolgens worden de kolonies van de 96-well kweekplaten overgezet op agarplaten volgens het tekstprotocol.Giet vervolgens de coating-oplossing uit de ELISA-platen en voeg 100 microliters blokkeringsoplossing, bereid volgens het tekstprotocol, toe aan elke put. Incubeer gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur of overnight bij vier graden Celsius. Voeg 20 microliters geconcentreerd cellysis-detergens toe aan elke put van de ronde bodem kweekplaat en incubeer de kweekplaat op een microplaat-shaker bij kamertemperatuur gedurende 15 tot 20 minuten.Verwijder de blokkeringsoplossing uit de ELISA-platen en was de wells vier keer met 200 microliters wasbuffer, bereid volgens het tekstprotocol. Nadat de laatste wasstap is voltooid, worden 50 microliters uit elke well van de cellysisplaat overgebracht naar de overeenkomstige well van de ELISA-plaat. Incubeer de platen gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur.Leeg vervolgens de monsters uit de ELISA-plaat en was de putjes vier keer. Bereid daarna de antilichaamoplossing om scFv's te detecteren volgens het tekstprotocol. Voeg 50 µL van het antilichaam toe aan elk putje en incubeer gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur.Was de ELISA-platen vier keer met wasbuffer voordat er 200 µL per well HRP-substraat wordt toegevoegd, bereid volgens het protocol van de fabrikant. Incubeer de platen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 tot 60 minuten. Voeg om de reactie te stoppen 50 µL van drie molair H2SO4 toe aan elke well en pipetteer voorzichtig om de oplossing te mengen.Meet tenslotte de absorptie met een plaatlezing bij 492 nanometer. In dit experiment werden scFv-antilichamen scFv13 en scFv13. R4 gefuseerd aan respectievelijk de native ssTorA-sequentie of een gemodificeerde ssTorA die niet wordt herkend door het twin-arginine translocatiepad, ook wel het Tat-pad genoemd.ScFv.R4 vouwt goed en wordt op het binnenmembraan tot expressie gebracht wanneer gefuseerd aan native ssTorA. ScFv13 vouwt niet goed en wordt niet op het binnenmembraan gepresenteerd, ongeacht aan welk Tat-signaalpeptide het is gefuseerd. Deze resultaten tonen aan dat alleen eiwitten die het Tat-signaalpeptide bevatten en correct zijn gevouwen in het cytoplasma op het binnenmembraan worden gepresenteerd, waardoor de Tat-route kan functioneren als een screening voor intracellulaire vouwing.In dit experiment werd een foutgevoelige PCR-bibliotheek gebaseerd op scFv13, die een lage bindingsaffiniteit vertoonde voor beta-galactosidase, gepand tegen beta-gal. ScFv 1-4 werd geïsoleerd en vertoonde een hogere bindingsaffiniteit voor beta-gal dan scFv13, evenals een hogere mate van cytoplasmatische oplosbaarheid. Door scFv 1-4 als competitor te gebruiken tegen de tweede generatie scFv 1-4-bibliotheek, werden scFv 2-1 en 2-3 geïsoleerd; deze vertoonden een nog hogere bindingsaffiniteit voor beta-gal dan scFv13 1-4, wat de gelijktijdige engineering van oplosbaarheid en antigeenbinding onderstreept.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals ELISA's met gezuiverd lysaat, worden uitgevoerd om de antigenspecificiteit te verifiëren en de bindingsaffiniteit van geïsoleerde klonen te bepalen. Na het bekijken van deze video zou u moeten begrijpen hoe u een antilichaam kunt screenen op binding aan een antigeen van belang door de Tat-route te gebruiken om die bibliotheek te presenteren en magnetische kraal-panning toe te passen om antigenbinders te verrijken en te isoleren. Vergeet niet dat werken met zwavelzuur extreem gevaarlijk kan zijn en dat het dragen van passende persoonlijke beschermingsmiddelen noodzakelijk is.

bacterial-inner-membrane-display-for-screening-library-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een werkwijze wordt beschreven visuele begeleiding voor het uitvoeren schaalbare, high throughput selecties van faagweergegeven combinatoriële synthetische antilichaam bibliotheken tegen honderden antigenen tegelijkertijd. Met behulp van deze parallelle aanpak, hebben we geïsoleerd antilichaam fragmenten die een hoge affiniteit en specificiteit vertonen voor diverse antigenen die functioneel in standaard immunoassays zijn.

Schaalbare High Throughput Selectie Van faagweergegeven Synthetische Antibody Bibliotheken

Hier presenteren de auteurs een eenvoudig en efficiënt protocol om een lineair antigeen epitoop te definiëren met behulp van een gezuiverd monoklonaal antilichaam en peptide scanning door dot-blot hybridisatie. De geïdentificeerde epitoop kan vervolgens worden gebruikt in therapeutische en diagnostische toepassingen.

Peptide Scanning-bijgestaan ​​Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop

Biopanning bacteriële display bibliotheken is een bewezen techniek voor ontdekking van peptide affiniteit reagentia, een robuust alternatief voor antilichamen. De semi-automatische sorteermethode hierin heeft gestroomlijnd biopanning als u wilt verkleinen van het optreden van valse positieven. We illustreren hier het denkproces en de technieken toegepast in de beoordeling van kandidaten en het minimaliseren van de downstream-analyse.

Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

De beschreven protocollen toestaan de bouw, karakterisering en selectie (tegen het doelwit) van een bibliotheek van de "domainome" gemaakt van elke bron van DNA. Dit wordt bereikt door een onderzoek-pijpleiding dat verschillende technologieën combineert: faag display, een opvouwbare verslaggever en de volgende generatie sequencing met een web-tool voor data-analyse.

Interactome-Seq: Een Protocol voor Domainome bibliotheek bouw, de validatie en de selectie door Phage Display en volgende generatie sequentiebepaling

Hier presenteren we een protocol bij scherm extracellulaire proteïne microarrays voor de identificatie van nieuwe receptor-ligand interacties in hoge-doorvoer. Ook beschrijven we een methode ter verbetering van de opsporing van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie met behulp van eiwit-microbead complexen.

Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

De BSelex-methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van humane perifere bloed mononucleaire cellen te identificeren en te herstellen combineert Flowcytometrie met eencellige PCR en klonen.

Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

Hier presenteren we een methode om te selecteren voor nieuwe varianten van de E. coli Biotine-proteïne ligase BirA dat biotinyates een specifieke doel peptide. Het protocol beschrijft de bouw van een plasmide voor de bacteriële weergave van de doel peptide, het genereren van een BirA bibliotheek, selectie en karakterisering van BirA varianten.

Bacteriële peptide weergave voor de selectie van nieuwe Biotinylating enzymen

Het creëren van chemisch geïnduceerde eiwit door dimerisatie systemen met de gewenste affiniteit en specificiteit voor een bepaalde kleine molecule ligand zou veel biologische sensing en bediening toepassingen. Hier beschrijven we een efficiënte, generaliseerbare methode voor de Novo engineering van chemisch geïnduceerde door dimerisatie systemen via de stapsgewijze selectie van een Phage-weergegeven combinatorische single-Domain antilichamen bibliotheek.

Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek

Dit protocol beschrijft de essentiële stappen voor het uitvoeren van selectiecampagnes voor gistoppervlakken om eiwitvarianten te verrijken die binden aan een interessant antigeen.

Eiwittechniek door gist Surface Display

Dit protocol beschrijft de productie van een therapeutisch antilichaam in een zoogdier expressiesysteem. De beschreven werkwijzen omvatten bereiding van vector-DNA, transfectie en stabiele serumvrije adaptatie van humane embryonische nier 293 cellijn opgezet van grootschalige kweken en zuiveren met behulp van affiniteitschromatografie.

Laboratoriumschaal Productie en zuivering van een therapeutisch antilichaam

Leer het screenen van antilichaamfragmenten voor bindingsaffiniteit en oplosbaarheid met behulp van het twin-arginine translocatiepad van Escherichia coli. Deze methode maakt effectieve intracellulaire antilichaamengineering mogelijk.

Bacteriële Inner-membraan Display voor het screenen van een bibliotheek van antilichaamfragmenten

Meer video's verkennen