Bacteriële Inner-membraan Display voor het screenen van een bibliotheek van antilichaamfragmenten

Het algemene doel van deze procedure is om de vouwkwaliteitscontrole van de twin-arginine translocatieroute te benutten om antilichaamfragmentbinding en intracellulaire vouwing in een enkele stap te ontwerpen, wat toepassingen zal hebben bij het ontwerpen van antilichamen om intracellulair te functioneren. Deze methode kan helpen bij het overwinnen van belangrijke uitdagingen in het veld van antilichaamontwikkeling, zoals het overwinnen van de moeilijkheid om antilichamen te ontwerpen om goed te vouwen en te functioneren in de reducerende cytoplasmatische omgeving. Alleen antilichamen die goed vouwen in het cytoplasma worden weergegeven en getest op binding.

Een voordeel bieden ten opzichte van gist- en fagendisplay die afhankelijk zijn van secretoire routes voor weergave. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot onze therapie van neurodegeneratieve ziekten, kanker en virale infecties omdat deze ziekten intracellulaire pathogenese omvatten die door antilichamen kan worden aangevallen. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat het begrijpen hoe te genereren en werken met sfeeroplasten een uitdaging is.

Na het fuseren van de scFv-bibliotheek met de ssTorA-signaalsequentie en het groeien ervan bij 37 graden Celsius met schudden gedurende drie uur, laat de expressie van de scFv-bibliotheek overnacht gedurende 15 tot 22 uur toe bij 20 graden Celsius en 225 rpm. Gebruik na de incubatie een spectrofotometer om de optische dichtheid bij 600 nanometer te meten. Centrifugeer vervolgens het berekende volume van de geïnduceerde cultuur in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter bij 12.000 keer g en kamertemperatuur gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant en gebruik 100 microliters ijskoud fractioneringsbuffer of fB om de pellets op te schorsen. Centrifugeer vervolgens de monsters bij 12.000 keer g en kamertemperatuur gedurende één minuut. Gebruik na het verwijderen van het supernatant 350 microliters ijskoud fB aangevuld met 3,5 microliters van 10 milligram per milliliter lysozym om de pellets op te schorsen.

Voeg vervolgens, terwijl u de buizen langzaam voortschuift, druppelsgewijs 700 microliters van 1 millimolair EDTA toe en incubeer de buizen op een buisrotator bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om de monsters te mengen. Verwijder de buizen uit de rotator. Voeg 50 microliters ijskoud punt vijf molair MgCl2 toe aan elke buis en incubeer ze gedurende 10 minuten op ijs.

Centrifugeer vervolgens de monsters bij 11.000 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Trek nu met een micropipet en een tip van één milliliter langzaam een deel van de pellet op. Terwijl u de buis vasthoudt, heft u de pipettip langzaam op uit het supernatant en laat u het pellet in de nieuwe buis glijden, onder een hoek met de opening direct boven een nieuwe buis van 1,5 milliliter.

Verwijder het overtollige supernatant en gebruik één milliliter ijskoud PBS om de sfeeroplasten op te schorsen. Sfeeroplasten moeten volledig worden opgeschort voorafgaand aan het pannen omdat niet-bindende scFvs die aanwezig zijn in aggregaten, zullen leiden tot valse positieven uit het pannen. Na biotinylering van het doelantigeen volgens het tekstprotocol, schorste u streptavidin-gecoate magnetische kralen opnieuw in hun originele flesje.

Breng vervolgens zeven tot tien keer 10 tot de 9e kralen over naar een buis van 1,5 milliliter. Plaats de buis met kralen op het magnetische rek gedurende twee minuten om de kralen aan de zijkant van de buis te verzamelen en pipet om voorzichtig het supernatant te verwijderen. Verwijder de buis van de magneet en gebruik PBS om de kralen op te schorsen zonder bubbels te genereren.

Breng vervolgens de buis terug naar de magneet en verwijder de buffer voordat u de kralen nogmaals twee keer met PBS wast. Voeg één milliliter lysate met het biotinyleerde antigeen toe aan de kralen en incubeer het bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten terwijl u zachtjes ronddraait. Gebruik na de incubatie PBS met 1%BSA om de kralen vijf keer te wassen.

Gebruik vervolgens PBS met 1%BSA om de kralen op te schorsen. Om de scFv-bibliotheek te screenen, begint u door vier keer 10 tot de 9e sfeeroplasten en acht keer 10 tot de 8e kralen toe te voegen aan een steriele buis van 15 milliliter. Voeg een x PBS met 1%BSA toe om het totale volume op vier milliliter te brengen.

Breng vervolgens de oplossing in aliquotten van vier buizen van 1,5 milliliter van elk één milliliter en incubeer de reacties bij vier graden Celsius door vijf uur lang voorzichtig te draaien. Om de bead-gebonden sfeeroplasten voor PCR voor te bereiden, plaatst u de panningsreactiebuizen gedurende drie minuten op de magneet. Verwijder het supernatant en was de kralen met één x PBS met 1%BSA vier keer zoals eerder.

Gebruik vervolgens 25 microliters ddH20 per buis om de kralen op te schorsen. Voer zoals beschreven in het tekstprotocol volledige plasmide PCR uit om de genen voor bead-gebonden scFvs te versterken en recirculariseer vervolgens het plasmide vanaf het PCR-product. Transformeer de volledige reactie in MC4100 geëgaliseerd cellen volgens het tekstprotocol.

Om klonen te identificeren met behulp van ELISA, ontdooi één buis van de gepannde subbibliotheek en plateer op LB-agarplaten. Voeg 200 microliters LB met 20 microgram per milliliter chlooramfenicol toe aan elk putje van een 96-putjes ronde bodemcultuurplaat. Kies met een pipettip een individuele kolonie van de agarplaat.

Plaats vervolgens de punt in het eerste putje van de 96-putjes plaat en roer voorzichtig om te inoculeren. Inoculeer vervolgens een kolonie in elk putje. Incubeer gedurende 20 tot 24 uur bij 37 graden Celsius op een microplaat shaker.

Na het bereiden van een doelantigeencoatingoplossing volgens het tekstprotocol, voegt u 50 microliters van de oplossing toe aan elk putje van een 96-putjes hoge binding heldere polystyreen ELISA-plaat. Incubeer