Name: Efficiënte Sporulatie van Saccharomyces cerevisiae In een 96 Multiwell Format (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Leer efficiënte sporulatie van Saccharomyces cerevisiae in een 96-well formaat voor high-throughput screening. Deze methode optimaliseert beluchting en maakt kosteneffectief genetisch onderzoek mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Joseph P. Healey subsidie ​​van de Universiteit van Massachusetts Boston (LSH) en R15 GM86805 van de NIH (LSH). SMP wordt gedeeltelijk ondersteund door een Sanofi-Genzyme Fellowship aan de Universiteit van Massachusetts Boston.

1. Voorbereidingen voor Sporulatie Let op:. De in dit protocol beschreven media worden gemaakt met behulp van standaard recepten en methodes 13,17 Tabel 1 geeft de formulering voor 1 liter van de verschillende media gebruikt in dit protocol. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" height="180" width="469"><colgroup><col /><col /><col span="3" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"></td><td style="width: 55px;"> Bacto Peptone </td><td style="width: 50px;"> Gist extract </td><td style="width: 50px;"> Bacto Agar </td><td style="width: 60px;"> dextrose </td><td style="width: 70px;"> kaliumacetaat </td><td style="width: 60px;"> Glycerol </td><td style="width: 60px;"> DDH 2 O </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPG platen </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 30 ml </td><td> 970 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPD platen </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPD vloeibaar </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPA vloeistof </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr><tr height="15"><td style="height: 20px; width: 80px;"> sporulatie media </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr></tbody></table> Tabel 1:. Media formuleringen Bedragen worden gegeven voor 1 L van media. Bijzonderheden over mediaingrediënten zijn te vinden in de Materials tabel. <ol><li> Als alle sporenvormende cellen hetzelfde genotype zullen zijn, volgt u deze procedure: <ol><li> Thaw giststam om gebruikt te worden op een YPG (YPGlycerol) plaat. Gist groeien gedurende 12-16 uur bij 30 ° C. Belangrijk is, zijn SK1 cellen ook klaar om sporuleren, dus SK1 stammen moet niet te lang op YPG platen worden gelaten, of ze kunnen sporuleren op het bord. Opmerking: Een vers ontdooide stam gekweekt op YPG voorkeur, als het gebruik van glycerol als een koolstofbron vereist oxidatieve fosforylering en derhalve selecteert op cellen die functionele mitochondriale DNA hebben. SK1 cellen hebben de neiging om functionele mitochondriaal DNA verliezen en petites. Functionele mitochondriaal DNA nodig voor sporulatie. </li><li> Streak gist uit de YPG plaat op een YPD (YPDextrose) plaat voor enkele kolonies. Grow gist op YPD plaat 24-28 uur bij 30 ° C. </li><li> Na ongeveer 36-48 uur groeien op YPD vaste media, start een 25 ml YPD kweek met een enkele kolonievan de YPD plaat. Groei deze cultuur tot cellen zijn over OD 600 = 4,0-7,0. Voer deze stap bij 30 ° C gedurende de nacht in een schuddend incubator, schudden bij 220 rpm. </li><li> Van de YPD cultuur, gebruik van een geschikt aantal cellen voor 1000 ml YPA (YPAcetate) cultuur start die OD 600 = 0,1 per 96 putjesplaat behoefte in hoofdstuk 2. Kweek gist in een 30 ° C incubator schudden (schudden bij 220 rpm) totdat de kweek OD 600 tussen 1,3 tot 1,5. Noot: Inoculeer 100 ml YPA kweek per 96 multi-putjesplaat te screenen in hoofdstuk 2. Als bijvoorbeeld screening vier 96 putjes en wordt 400 ml YPA kweek nodig. Te beginnen met 10% extra volume in het YPA cultuur is noodzakelijk om te beschermen tegen door verdamping volume verlies. Doorgaans duurt het tussen de 12-16 uur voor de cellen naar de juiste OD 600 te bereiken; de hoeveelheid kan variëren afhankelijk van het genotype van de giststam. YPA is de presporulation media. Pregrowthacetaat helpt induceren expressie van genen (zoals IME1) nodig voor een efficiënte en synchrone sporulatie 6. </li><li> Spin op 1.800 xg in een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten aan cellen gekweekt in YPA pellet. Was de cellen 1x met 0,5 volume van steriel geautoclaveerd gedemineraliseerd water. Spin weer, en gooi te wassen. Resuspendeer cellen in 1x volume sporulatie media. Ga verder naar deel 2. </li></ol></li><li> Bij gebruik van cellen voor sporulatie die verschillende genotypen, (dwz, getransformeerd met verschillende plasmiden of met verschillende mutaties, typisch verkregen en opgeslagen als bevroren voorraden), array cellen van de verschillende genotypen in een 96 multiwell format. Daarna volgt te werk: <ol><li> Gebruik een steriele 96 tand Frogger om cellen te brengen van ontdooide bevroren voorraden in 96 multi-putjesplaat (s) op YPG vaste media. Grow gist &#39;s nachts bij 30 ° C. </li><li> Met behulp van een steriele 96 riek Frogger, transfer cellen uit YPG vaste media op YPD vaste media of selectievevaste media (bijv synthetisch minimaal medium zonder aminozuren, als de cellen bevatten plasmiden die selectie vereist). Gist groeien bij 30 ° C totdat kolonies worden gevormd voor elke stam, gewoonlijk 1 dag YPD en 2 dagen als selectief medium nodig is. </li><li> Aliquot 1,2 ml YPD vloeibare media of selectieve vloeibare media in elk putje van een 96 diepe 2 ml multiwell plaat. Transfer cellen uit vaste media in vloeibare media met een frogger, bedekken met een plastic deksel op zijn plaats gehouden door tape en gedurende de nacht groeien in 30 ° C schudder, schudden bij 220 rpm. Opmerking: Om besmetting te minimaliseren, afdekplaten met behulp van de plastic deksels uit een rechthoekige petri plaat. Houd deksels op zijn plaats met behulp van een stukje tape, zodat de luchtcirculatie minimaal wordt beperkt. </li><li> Centrifugeer platen bij 1800 g gedurende 5 minuten, met een swinging bucket centrifuge een adapter 96 putjesplaten tegemoet. Giet media uit cellen; voeg 500 ul YPA aan elk putje en resuspendeer celpellets in YPA. dekselmet kunststof deksel op zijn plaats gehouden door tape. </li><li> Kweek cellen gedurende 15 uur bij 30 ° C in een schudincubator, schudden bij 220 rpm. Ga verder naar deel 2. </li></ol></li></ol> 2. sporenvormende cellen in een 96 Multiwell Format <ol><li> Voeg één 3 mm steriele vaste glasparels of een steriele 5 mm x 2 mm magnetische roerstaaf in elk putje van een plaat met 96 putjes met 1,3 ml. (Zie Representatieve resultaten hieronder voor een discussie over de vraag of een kraal of een roerstaafje gebruiken.) </li><li> Als alle cellen worden gescreend zijn van hetzelfde genotype, naar 2.2.1. Als cellen te screenen van verschillende genotypen, naar 2.2.2. <ol><li> Neem cellen uit stap 1.1.5 en hoeveelheid 500 pl cellen plus medium in elk putje van de multi-putjesplaat 96. Dek af met plastic deksel op zijn plaats gehouden door tape. Ga verder met 2.3. </li><li> Spin cellen die in YPA van 1.2.4 bij 1800 g gedurende 5 minuten, met een swinging bucket centrifuge een adapter 96 putjesplaten tegemoet. giet vanf media uit cellen. Voeg 500 ul van sporulatie medium aan elk putje en resuspendeer celpellets in de sporulatie media. Dek af met plastic deksel op zijn plaats gehouden door tape. Ga verder met 2.3. </li></ol></li><li> Bij gebruik van een glasparel, plaats monsters in een schudincubator bij 30 ° C en schudden bij 220 rpm gedurende sporulatie. Bij gebruik van een magnetische roerstaaf, plaats monsters op een roer plaat binnenkant van een 30 ° C incubator voor sporulatie. Opmerking: De exacte roersnelheid voor magnetische roerstaven is niet belangrijk, zolang alle bars energetisch bewegen en de kweek belucht. </li><li> Om progressie te monitoren door middel van sporulatie, monsters van de sporulerende cultuur te trekken voor visualisatie, Voeg 6 ul van cellen uit de sporulerende culturen tot 24 ul van sporulatie media in een 96 well dekglaasje plaat (1: 5 verdunning). Laat cellen om zich te vestigen gedurende 5 minuten voordat de behandeling van cellen met behulp van een omgekeerde microscoop. Opmerking: In wild-type SK1 cellen, zal compact rijpe sporen te vormen door 36 uur na overdracht naar sporulatie media. Doorlopen van sporulatie kan worden gevolgd door microscopie met fluorescerende merkers, zoals een nucleaire marker (bijv HTB2-mCherry 18) aan de meiotische deling of prospore membraan merker te onderzoeken (dat wil zeggen, G20 19) om sporen morfogenese bestuderen. Als alternatief kan de vorming van refractiele sporen zichtbaar via DIC Nomarski microscopie vanaf ongeveer 12 uur na overdracht naar sporulatie medium. </li></ol>

<ol><li>Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+in+budding+yeast%3A+sister+chromatid+cohesion+and+related+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms.</a> Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).</li>
<li>Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+meiotic+recombination+initiation%3A+general+principles+and+molecular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways.</a> Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).</li>
<li>Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+signaling+pathways+orchestrate+yeast+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development.</a> Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).</li>
<li>Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+control+of+growth+and+development+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nutritional control of growth and development in yeast.</a> Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).</li>
<li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sum1%2FNdt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparison+of+recombination+and+synaptonemal+complex+formation+during+meiosis+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae.</a> Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).</li>
<li>Liti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+genomics+of+domestic+and+wild+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population genomics of domestic and wild yeasts.</a> Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).</li>
<li>McCusker, J. H., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+sporulation+of+yeast+in+media+buffered+near+pH6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6.</a> J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).</li>
<li>Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+which+affect+the+frequency+of+sporulation+and+tetrad+formation+in+Saccharomyces+cerevisiae+baker%27s+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).</li>
<li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).</li>
<li>Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6rner%2C+GV+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22">Cold Spring Harb. Protoc</a>. 2015 (11), 1003-1008 (2015).</li>
<li>Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6rner%2C+GV+%22Cold+Spring+Harb.+Protocols%22">Cold Spring Harb. Protocols</a>. (10), 908-913 (2015).</li>
<li>Jones, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+library+for+comprehensive+overexpression+screens+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).</li>
<li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+yeast+plasmid+overexpession+screen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput yeast plasmid overexpession screen.</a> J. Vis. Exp. (53), e2836(2011).</li>
<li>Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timely+Closure+of+the+Prospore+Membrane+Requires+SPS1+and+SPO77+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. , (2016).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Labooratory+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).</li>
<li>Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPO71+mediates+prospore+membrane+size+and+maturation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).</li>
<li>Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+a+SNARE+protein+by+control+of+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization.</a> Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).</li>
<li>Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smk1p+MAP+kinase+negatively+regulates+Gsc2p%2C+a+1%2C3-beta-glucan+synthase%2C+during+spore+wall+morphogenesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Hier presenteren we een protocol voor sporulerend SK1 gist in een 96 multiwell format. Beluchting is belangrijk voor een efficiënte sporulatie, waarbij het gebruik van hetzij een roerstaaf of een glasparel in elk putje vereist. Wanneer cellen worden gesporuleerde in een 96 multiwell plaat in een incubator schudden zonder begeleiding van een kraal of een roerstaafje, hoeft cellen niet efficiënt sporuleren. Slechts een kleine toename van sporulatie efficiëntie wordt waargenomen wanneer de cellen gesporuleerde zonder dat e...

Sporulatie in de gist is bestudeerd om inzicht in vele aspecten van de biologie, met inbegrip van de controle van chromosoomsegregatie bieden tijdens meiose 1, mechanismen voor genetische recombinatie 2, de controle van de ontwikkeling van cell signaling 3, nutritionele regeling van ontwikkeling 4, de transcriptionele regulering van de ontwikkeling 5, en het onderzoek van de spore vorming 6. Spoorvorming omvat een nieuwe celdeling gebeurtenis waarbij de vorming van nieuwe membraancompartimenten binnen de moedercel gevolgd door het afzetten van een beschermende spore wand 6. Deze studies die sporenvormende cellen onderzocht vaak gebruik maken van het snel sporulerende giststam SK1, die het proces van sporulatie in ongeveer 24 uur op een relatief efficiënte wijze 7,8 kan ondergaan. Hoewel optimalisering van sporulatie voorwaarden voor gist zijn beschreven 9-13, die experiments onderzocht sporulatie op vaste media of in grotere schaal vloeibare culturen waar sporulatie met behulp van cultuur buisjes of flesjes wordt uitgevoerd. Hier beschrijven we een werkwijze voor sporenvormende gist in een 96 multi-putjesplaat formaat. We zien dat deze werkwijze beluchting is kritisch voor synchrone en efficiënt sporulatie en hebben technieken ontwikkeld om voldoende sporulatie garanderen een klein volume multiwell format. Sporenvormende in een 96 multi-putjesplaat formaat maakt cellen worden gescreend met behulp van high-throughput technieken en reagentia geoptimaliseerd voor een multiwell plaat formaat, zoals screening voor hoog kopie onderdrukkers met een betegelde library 14-16.

<table><tbody><tr><td>Nunc 1.3 ml DeepWell Plates</td><td>ThermoScientific</td><td>260251</td><td>Gebruikt voor sporulatie</td></tr><tr><td>Nunc 2.0 ml DeepWell plates</td><td>ThermoScientific</td><td>278743</td><td>Gebruikt voor presporulatie groei, stap 1.2.3</td></tr><tr><td>3 mm glazen kraal</td><td>Fisher</td><td>11-312A</td><td>Gebruikt voor sporulatie</td></tr><tr><td>5 mm x 2 mm roerbaar, pak van 12</td><td>Fisher</td><td>14-511-82</td><td>Gebruikt voor sporulatie</td></tr><tr><td>96 well frogger</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>VP407</td><td>nodig voor stap 1.2</td></tr><tr><td>bibliotheekkopieerapparaat</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>VP381</td><td>nodig voor stap 1.2; te gebruiken met de frogger</td></tr><tr><td>rechthoekige Petri-schaal</td><td>ThermoScientific</td><td>264728</td><td>nodig voor stap 1.2</td></tr><tr><td>Bacto Pepton</td><td>BD</td><td>211677</td><td>nodig voor media</td></tr><tr><td>Gist Extract</td><td>BD</td><td>212750</td><td>nodig voor media</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>212750</td><td>nodig voor media</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D16-3</td><td>nodig voor media</td></tr><tr><td>Kalium Acetaat</td><td>Fisher</td><td>P171-500</td><td>nodig voor media</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>nodig voor media</td></tr><tr><td>Zwarte 96 well glazen bodemplaat</td><td>MatTek</td><td>PBK96G-1.5.5-F</td><td>nodig voor stap 2.4</td></tr></tbody></table>

efficiënte sporulatie van<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt; in een 96 multiwell format

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Tijdens periodes van nutritionele stress ondergaat Saccharomyces cerevisiae gametogenese, bekend als sporulatie. Diploïde gistcellen die worden uitgehongerd voor stikstof en koolstof, zullen het sporulatieproces initiëren. Het proces van sporulatie omvat meiose gevolgd door sporevorming, waarbij de haploïde kernen worden verpakt in omgevingsbestendige sporen. We hebben methoden ontwikkeld voor de efficiënte sporulatie van knopsporen in 96 multiwell platen, om de doorvoer van het screenen van gistcellen voor sporulatiefenotypen te verhogen. Deze methoden zijn compatibel met het screenen van gist met plasmiden die nutritionele selectie vereisen, wanneer geschikte minimale media worden gebruikt, of met het screenen van gist met genomische aanpassingen, wanneer een rijk presporulatieregime wordt gebruikt. We vinden dat voor deze methode beluchting tijdens sporulatie cruciaal is voor sporevorming, en we hebben technieken ontwikkeld om voldoende beluchting te garanderen die compatibel zijn met het 96 multiwell platenformaat. Hoewel deze methoden niet het typische ~80% niveau van sporulatie bereiken dat kan worden bereikt in grootschalige flesgebaseerde experimenten, zullen deze methoden betrouwbaar ongeveer 50-60% sporulatieniveau bereiken in kleine volume multiwell platen.

<html> Dit protocol te evalueren werden sporulatie rendementen verkregen van sporenvormende cellen in platen met meerdere putjes (zoals hierboven beschreven) vergeleken met cellen gesporuleerde gebruik van grotere volumes in flessen (tabel 2). Het gebruik van multi-putjesplaten heeft de hoge efficiëntie gezien wanneer sporulerend in flessen, waarbij ~ 80% rendement routinematig blijkt niet bereiken. Sporenvormende in multiwell platen met goede beluchting (door glasparels ...

Hier wordt sporulatie van Saccharomyces cerevisiae uitgevoerd in een 96 multiwell formaat.

Efficiënte Sporulatie van<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; In een 96 Multiwell Format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

Het algemene doel van dit protocol is om bakkersgist efficiënt te laten sporuleren in een 96-wells formaat. Hoewel er veel grootschalige screens zijn uitgevoerd bij de bakkersgist, zijn high-throughput studies naar meiose en sporulatie beperkt gebleven. De in deze video beschreven techniek heeft het voordeel dat gist efficiënt en kosteneffectief kan worden gesporuleerd in een 96-wells formaat dat geschikt is voor high-throughput screening.Ik kreeg het idee voor deze methode omdat ik een getegelde twee micron plasmidenbibliotheek wilde gebruiken om te screenen naar high-copy suppressoren van een mutant die geen refractiele sporen kon vormen. Aanvankelijk waren mijn sporulatie-efficiënties in het 96-well formaat gering. Ik ontdekte dat dit te wijten was aan onvoldoende beluchting.Begin deze procedure door de SK1-giststam te ontdooien op een gistextract-pepton-glycerol- of YPG-plaat. Gebruik een steriel stokje om een kleine hoeveelheid cellen uit het vriesbuisje met de glycerolstock te schrapen en verspreid deze op een YPG-plaat. Laat de gist 12 tot 16 uur groeien bij 30 °C.Strijk vervolgens de gist van de YPG-plaat uit op een gistextract-pepton-dextrose- of YPD-plaat voor enkelvoudige kolonies. Laat de gist 24 tot 48 uur groeien op de YPD-plaat bij 30 degrees Celsius. Start na 24 tot 48 uur groei op vaste YPD-media een YPD-cultuur van 25 milliliter met behulp van een enkelvoudige kolonie van de YPD-plaat.Kweek deze cultuur gedurende de nacht in een schudincubator bij 30 °C en 220 RPM totdat de cellen een OD600 van 4,0 tot 7,0 bereiken. Gebruik de volgende dag een passende hoeveelheid cellen van de YPD-cultuur om een cultuur van 125 ml te starten in gistextract-pepton-acetaat, of YPA, met een OD600 van 0,1. Kweek de cultuur in een schudincubator bij 30 °C en 220 RPM totdat de OD600 tussen 1,3 en 1,5 ligt.Breng de cultuur over naar centrifugebuizen en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij 1800X G in een tafelcentrifuge om de cellen te pelletteren. Was de cellen eenmaal met een 0,5 volume steriel geautoclaveerd gedeïoniseerd water. Centrifugeer opnieuw en gooi het water weg.Resuspendeer de cellen in een 1X volume sporulatiemedium. Om cellen van verschillende genotypen voor te bereiden, worden cellen uit ontdooide bevroren stocks in een 96-wells plaat eerst overgebracht naar vaste YPG-media. Flameer een 96-tands frogger en koel deze vervolgens kort af op een plaat met vast medium voordat u deze tegen de gistkolonies aanbrengt.Kweek de gist gedurende de nacht bij 30 °C. Breng de cellen de volgende dag over van YPG-vaste media naar YPD- of selectieve vaste media, afhankelijk van het genotype van de stam. In deze demonstratie wordt YPD gebruikt.Kweek de gist bij 30 °C totdat er voor elke stam kolonies zijn gevormd. Verdeel aliquots van 1,2 milliliters YPD vloeibaar medium over elke put van een 96 deep well plate. Overbreng de cellen van het vaste medium naar het vloeibare medium.Dek de plaat af met een plastic deksel van een rechthoekige petrischaal en bevestig het deksel met een stuk plakband om de luchtcirculatie minimaal te beperken. Kweek de cellen overnacht in een schudincubator op 30 °C bij 220 RPM. Centrifugeer de volgende dag gedurende vijf minuten bij 1800X G.Giet het medium af en voeg 500 µL YPA toe aan elke put. Resuspendeer vervolgens de gepelletteerde cellen. Dek de plaat af met een plastic deksel dat met tape op zijn plaats wordt gehouden.Kweek de cellen gedurende 15 uur in een schudincubator bij 30 °C op 220 RPM. Om een goede beluchting voor een efficiënte sporulatie te waarborgen, voegt u aan elke put van een 96-wellplaat ofwel één steriele glazen kraal van 3 mm toe, ofwel een steriele magnetische roerstaaf van 5 mm bij 2 mm. Indien alle cellen hetzelfde genotype hebben, verdeelt u aliquots van 500 µL cellen inclusief medium over elke put van de 96-wellplaat.Dek de plaat af met een plastic deksel dat met tape op zijn plaats wordt gehouden. Als de cellen verschillende genotypen hebben, centrifugeer de cellen in YPA dan bij 1800X G gedurende vijf minuten en giet het medium af. Voeg 500 microliters sporulatiemedium toe aan elke put.Resuspendeer de gepelletteerde cellen in het sporulatiemedium. Dek de plaat af met een plastic deksel dat met plakband wordt vastgezet. Indien glazen kralen worden gebruikt, plaats de monsters dan in een schudincubator bij 30 °C en schud deze bij 220 RPM voor sporulatie.Indien er magnetische roerstaafjes worden gebruikt, plaats de monsters voor sporulatie op een roerplaat in een incubator van 30 degrees Celsius. De exacte roersnelheid van de magnetische staafjes is niet van groot belang, zolang alle staafjes krachtig bewegen en de cultuur belucht wordt. Haal de monsters na 36 uur op om de voortgang van de sporulatie te monitoren.Neem zes µL cellen uit elke sporulerende cultuur en voeg deze toe aan 24 µL sporulatiemedium in een 96-wells coverslip-plaat. Laat de cellen vijf minuten bezinken voordat ze worden onderzocht met een omgekeerde microscoop. Een representatieve sporulatie van twee verschillende stammen wordt getoond in deze afbeeldingen van cellen, gevisualiseerd met een 63X objectief op een omgekeerde microscoop.Refractiele tetraden, aangegeven door de pijlpunten, zijn zichtbaar in de wildtype-cultuur. Deze zijn echter niet aanwezig in de cultuur met de sporulatie-deficiënte smk1-deletiecellen. Er zijn vergelijkingen gemaakt tussen de sporulatie-efficiënties van cellen die zijn gesporuleerd in multi-wellplaten en cellen die zijn gesporuleerd met grotere volumes in kolven.Het gebruik van multi-well platen behaalde niet de hoge efficiëntie die routinematig wordt gezien bij het gebruik van het meer typische protocol van sporulatie in kolven. Sporulatie in multi-well platen met een adequate beluchting kan voldoende sporulatie-efficiënties van meer dan 50% bereiken, waarbij de beste resultaten werden behaald met een roerpaltje van vijf millimeter. Gezien de hoge kosten van de kleine roerpaltjes zijn de efficiënties die met glasparels worden behaald echter vergelijkbaar.Hoewel zowel roerstaafjes van vijf millimeter als van zeven millimeter in de putjes van een 96-wells plaat passen, leidde het gebruik van een roerstaafje van zeven millimeter tot een slechte sporulatie-efficiëntie. Een roerstaafje van zeven millimeter in een putje heeft de neiging om te interfereren met een roerstaafje in een aangrenzend putje, waardoor de staafjes niet correct kunnen roeren en er onvoldoende beluchting van de cultuur plaatsvindt.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe gistcellen efficiënt kunnen worden gesporuleerd in vloeibare cultuur in het 96-well formaat. Eenmaal onder de knie, kan dit proces in zes dagen worden voltooid, mits correct uitgevoerd. Deze procedure kan worden gebruikt voor het screenen van verschillende mutantstammen, plasmiden of kleine molecuulremmers op hun effect op meiose en sporulatie.Na de ontwikkeling werd deze techniek gebruikt om de regulatie van de meiotische celcyclus te bestuderen en om te onderzoeken hoe cytokinese en meiose gekoppeld zijn aan sporulatie in Saccharomyces cerevisiae.

efficient-sporulation-saccharomyces-cerevisiae-96-multiwell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Micromanipulatie van de gistcellen is nodig voor de meiose genetische analyse of om diploïde zygoten te selecteren. Deze micromanipulations worden uitgevoerd met behulp van de microneedle van een dissectie microscoop. De microneedle wordt gebruikt om de cellen te verplaatsen en wordt gecontroleerd door een micromanipulator die beschikbaar zijn met een verschillende mate van automatisering.

Dissectie van Saccharomyces Cerevisiae Asci

GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

Hier beschrijven we een plasmide overexpressie scherm...

High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

De Green Monster methode kan de snelle montage van meerdere deleties gemarkeerd met een reportergen codeert groen fluorescent eiwit. Deze methode is gebaseerd op een giststammen door herhaalde cycli van seksuele assortiment van deleties en fluorescentie gebaseerde verrijking van cellen die meer deleties.

The Green Monster Werkwijze voor de generatie van giststammen dragen Meerdere gendeleties

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Hier presenteren we een protocol voor het inschatten van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme door het aanbrengen van de exponentiële groei van Saccharomyces cerevisiae voor de vergelijking van exponentiële groei. Berekening van de kinetische parameters zorgt voor de screening van invloeden van stoffen/verbindingen op gisting of mitochondriaal ademhaling.

Saccharomyces cerevisiae Exponentiële groei kinetiek in Batch cultuur voor het analyseren van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme

Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

We presenteren een protocol voor lamellenpreparaat van diepgevroren biologische monsters door cryo-gerichte ionenbundelmicromachining voor structurele studies met hoge resolutie van macromoleculen in situ met cryo-elektronentomografie. Het gepresenteerde protocol biedt richtlijnen voor de bereiding van hoogwaardige lamellen met een hoge reproduceerbaarheid voor structurele karakterisering van macromoleculen in de Saccharomyces cerevisiae.

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

De ACT1-CUP1-test, een kopergroeitest, biedt een snelle uitlezing van precursor messenger RNA (pre-mRNA) splicing en de impact die mutante splicingfactoren hebben op de spliceosomale functie. Deze studie biedt een protocol en benadrukt het maatwerk dat mogelijk is om de splicingvraag van belang aan te pakken.

ACT1-CUP1-testen bepalen de substraatspecifieke gevoeligheden van spliceosomale mutanten in ontluikende gist

Leer efficiënte sporulatie van Saccharomyces cerevisiae in een 96-well formaat voor high-throughput screening. Deze methode optimaliseert beluchting en maakt kosteneffectief genetisch onderzoek mogelijk.

Efficiënte Sporulatie van

Meer video's verkennen