Efficiënte Sporulatie van Saccharomyces cerevisiae In een 96 Multiwell Format

Het algemene doel van dit protocol is om kiemende gist efficiënt te sporuleren in een 96-well formaat. Hoewel er veel grootschalige screenings zijn uitgevoerd op de kiemende gist, zijn high-throughput studies naar meiose en sporulatie beperkt. De techniek beschreven in deze video heeft het voordeel van het efficiënt sporuleren van gist op een kosteneffectieve manier in een 96-well formaat compatibel met high-throughput screening.

Ik kreeg het idee voor deze methode omdat ik een gesegmenteerde twee micrometer plasmide bibliotheek wilde gebruiken om te screenen voor hoge kopie suppressoren van een mutant die geen brekingssporen kon vormen. Aanvankelijk waren mijn sporulatie-efficiënties slecht in het 96-well formaat. Ik ontdekte dat dit te wijten was aan onvoldoende beluchting.

Begin deze procedure door de SK1-giststam op te ontdooien op een gist extract pepton glycerol of YPG-plaat. Gebruik een steriele stick om een kleine hoeveelheid cellen uit de vrieserfles met de glycerol stock te schraap en spreid het uit op een YPG-plaat. Laat de gist 12 tot 16 uur groeien bij 30 graden Celsius.

Streek vervolgens de gist van de YPG-plaat op een gist extract pepton dextrose, of YPD, plaat voor enkele kolonies. Laat de gist 24 tot 48 uur groeien bij 30 graden Celsius. Na 24 tot 48 uur groei op YPD vaste media, start een 25 milliliter YPD cultuur met een enkele kolonie van de YPD-plaat.

Laat deze cultuur overnacht groeien in een schuddende incubator van 30 graden Celsius bij 220 RPM tot de cellen een OD600 van 4,0 tot 7,0 bereiken. Gebruik de volgende dag een geschikte hoeveelheid cellen uit de YPD-cultuur om een 125 milliliter cultuur te starten in gist extract pepton acetaat, of YPA, met een OD600 van 0,1. Laat de cultuur groeien in een schuddende incubator van 30 graden Celsius bij 220 RPM tot de OD600 tussen 1,3 en 1,5 is.

Breng de cultuur over naar centrifugeerbuisjes en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1800X G in een tafelcentrifuge om de cellen te pelleten. Was de cellen eenmaal met een 0,5 volume steriele geautoclaveerde gedeïoniseerd water. Centrifugeer opnieuw en gooi het water weg.

Suspendeer de cellen in een 1X volume sporulatie media. Om cellen van verschillende genotypen voor te bereiden, worden cellen van ontdooid bevroren stocks in een 96 multiwell plaat eerst overgebracht op YPG vaste media. Ontvlam een 96 tandvork en koel het vervolgens even op een plaat met vaste media voordat het de gistkolonies raakt.

Laat de gist overnacht groeien bij 30 graden Celsius. Breng de cellen de volgende dag over van YPG vaste media naar YPD of selectief vaste media, afhankelijk van het genotype van de stam. YPD wordt in deze demonstratie gebruikt.

Laat de gist groeien bij 30 graden Celsius totdat er kolonies worden gevormd voor elke stam. Pipetteer 1,2 milliliter YPD vloeibaar media in elke put van een 96 diepe puttenplaat. Breng de cellen van het vaste media over in vloeibaar media.

Dek de plaat af met een plastic deksel van een rechthoekige petrischaal en houd het deksel op zijn plaats met behulp van een stukje plakband om de luchtcirculatie minimaal te beperken. Laat de cellen overnacht groeien in een shaker van 30 graden Celsius bij 220 RPM. De volgende dag centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1800X G.

Giet het media weg en voeg 500 microliter YPA toe aan elke put. En suspendeer de gepelletede cellen. Dek de plaat af met een plastic deksel gehouden op zijn plaats door tape.

Laat de cellen 15 uur groeien in een schuddende incubator van 30 graden Celsius bij 220 RPM. Om een goede beluchting te bieden voor efficiënte sporulatie, voeg in elke put van een 96-well plaat een drie millimeter steriele vaste glazen kraal of een steriele vijf millimeter bij twee millimeter magnetische roerstaaf toe. Als alle cellen van hetzelfde genotype zijn, pipetteer 500 microliter cellen plus media in elke put van de 96-multiwell plaat.

Dek de plaat af met een plastic deksel gehouden op zijn plaats door tape. Als cellen van verschillende genotypen zijn, centrifugeer de cellen die in YPA zitten bij 1800X G gedurende vijf minuten en giet het media weg. Voeg 500 microliter sporulatie media toe aan elke put.

En suspendeer de gepelletede cellen in het sporulatie media. Dek de plaat af met een plastic deksel gehouden op zijn plaats door tape. Als glazen kralen worden gebruikt, plaats de monsters in een schuddende incubator van 30 graden Celsius en schud bij 220 RPM voor sporulatie.

Als magnetische roerstafjes worden gebruikt, plaats de monsters op een roerplaat in een incubator van 30 graden Celsius voor sporulatie. De exacte roersnelheid voor de magnetische staafjes is niet erg belangrijk, zolang alle staven energiek bewegen en de cultuur wordt belucht. 36 uur later, haal de monsters om de voortgang door sporulatie te controleren.

Neem zes microliter cellen uit elke sporulerende cultuur en voeg toe aan 24 microliter sporulatie media in een 96-well coverslip plaat. Laat de cellen vijf minuten bezinken voordat u ze onderzoekt met behulp van een omgekeerde microscoop. Een representatieve sporulatie van twee verschillende stammen wordt getoond in deze afbeeldingen van cellen gevisualiseerd met behulp van een 63X objectief op een omgekeerde microscoop.

Brekingstetraden, aangegeven door de pijltjes, zijn te zien in de wild-type cultuur. Maar niet in de cultuur met de sporulatie-deficiënte smk1 delete cellen. Vergelijkingen werden gemaakt tussen sporulatie-efficiënties van cellen sporuleerd in multi-well platen en cellen sporuleerd met grotere volumes in kolven.

Het gebruik van multi-well platen bereikte niet de hoge efficiëntie die routinematig wordt gezien bij het gebruik van het meer typische protocol van sporulatie in kolven. Sporulatie in multi-well platen met goede beluchting kan voldoende sporulatie-efficiënties bereiken van meer dan 50% met de beste resultaten verkregen met behulp