Name: De Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Leer hoe je Drosophila oog-antenne imaginale schijven en hersenen dissecteert om genexpressie en tumorinvasiviteit te visualiseren en kwantificeren met behulp van genetische mozaïeken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken het Bloomington Stock Center (Bloomington, USA), Dirk Bohmann, Katja Brückner en Istvan Ando voor vliegensoorten en antilichamen. We danken Marek Jindra en Colin Donohoe voor hun opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Sofja Kovalevskaja Award aan M.U. van de Alexander von Humboldt Foundation en DFG project UH243/1-1 aan M.U. van de German Research Foundation.

LET OP: Dit werk maakt gebruik van de eyFLP1; handeling&gt; y +&gt; Gal4, UAS-GFP; FRT82B, bad-GAL80 MARCM 82B Green tester lijn 11. De oversteek van de MARCM 82B Green tester maagden om mannetjes van stammen zoals w; UAS-a; UAS-RNAi b, c FRT82B mut genotype zal nageslacht waarin mitotische recombinatie zal optreden tussen de rechter armen van de 3 e homologe chromosomen opleveren. Zo zal klonen homozygoot mutant gen c distaal aan de FRT82B plaats binnen de hersenen EAD en neuro-epitheel worden gegenereerd. Deze klonen zullen GFP, transgene en een dsRNA voor gen-b (Figuur 1A) uit te drukken. Diverse eyFLP-MARCM tester lijnen voor recombinatie op de X, 2L, 2R, 3L en 3R zijn vastgesteld en beschikbaar zijn binnen de vlieg gemeenschap. 1. Fly Handling, Kruisen en Staging <ol><li> Vouw de juiste MARCM tester voorraad bij kamertemperatuur door bevolken meerdere bottles tegelijkertijd. Flip de volwassenen in de frisse flessen om de 2-3 dagen, zodat genoeg maagden kan worden verzameld voor de volgende kruisingen. LET OP: Bij het verzamelen van maagden, voorkomen dat er een langdurige blootstelling aan CO 2, omdat dit afbreuk doet vrouwelijke vruchtbaarheid. </li><li> Afhankelijk van de omvang van het experiment opgezet vlieg kruisen in flesjes gebruikmaking van ten minste 10 MARCM tester maagden en 4 mannen (bijvoorbeeld voor beeldvorming van fluorescente reporters en immunokleuring) of flessen met tenminste 30 maagden en 10 mannen (bijvoorbeeld voor RNA isolatie en kwantificering van invasiviteit). </li><li> Raise nakomelingen bij 25 ° C onder een lange dag 16 uur / 8 uur licht-donker cyclus. Flip ouders in nieuwe flesjes / flessen elke 24 uur tot reproduceerbare enscenering van larven te vergemakkelijken en overbevolking te voorkomen. LET OP: Vanaf dag 6 na de eileg (AEL), de late derde instar controle larven stop voeden, beginnen dwalen en voer verpopping. In contrast, kan het begin van de larvale-popstadium overgang worden degelegd of non-existent in larven EAD richting hyperplastische of kwaadaardige tumoren klonale. </li></ol> 2. Verzamelen Derde Instar Larven <ol><li> Voor immunokleuring, laat ongeveer 20 late derde instar larven (zwerven aan de wand en die van een vergelijkbare lichaamsgrootte van de voeding). Gebruik een tang om voorzichtig plukken larven uit het flesje of blikje en breng ze in een embryo glazen schaaltje gevuld met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). <ol><li> Voor RNA isolatie en kwantificering van invasiviteit, laat tenminste 80 late derde instar larven (zwerven aan de wand en die van een vergelijkbare lichaamsgrootte van de voeding). Gebruik een spuit fles PBS spuiten in een fles vlieg met larven totdat het oppervlak is bedekt. </li><li> Verzachten de bovenste lagen van voedsel met een spatel en giet het eten mash met larven in een petrischaal. Met behulp van een tang voorzichtig plukken larven en breng ze in een embryo glazen schaaltje gevuld met PBS. </li></ol></li><li> Was larven met PBS until alle overgebleven voedsel wordt verwijderd. Inspecteer de larven onder fluorescerende stereomicroscoop met 8 tot 16x vergroting voor alle &quot;luipaard larven&quot; die willekeurige GFP-positieve plekjes in het larvale lichaam (Figuur 2A, 2B en zie discussiedeel) dragen ontdoen. Opmerking: Voor RNA-isolatie, zoals een na laatste wasstap in 70% EtOH gedurende 1 min. </li><li> Plaats het schaaltje met geselecteerde larven in PBS op ijs tot dissectie. Proces larven binnen 30 minuten om de negatieve gevolgen van koude en honger te voorkomen. </li></ol> 3. Dissectie van Larven <ol><li> De EAD ontleden onder een stereomicroscoop Gebruik een pincet om voorzichtig op het midden van de larven tegen de glazen schaal bodem. Met de tweede tang, pak de larvale mond haken en trek ze uit de buurt van het lichaam (figuur 2C). LET OP: De trekkracht is vaak voldoende om de optische stengels aansluiten van de EAD pai brekenr naar de hersenen lobben. Als de hersenen of onderdelen aangesloten blijven EAD en hun aanwezigheid niet gewenst voor verdere toepassingen, stuurde de optiek stengels met behulp van de twee paar pincetten. Voor invasieve tumoren (bv ras V12 Scrib 1) wordt de verbinding tussen EAD en de hersenen lobben steeds verduisterd met de tijd door de begroeiing en het migreren van klonale cellen. <ol><li> Om de EAD / brein complex met een intacte ventrale zenuw kabel (VNC) (Figuur 2D) voor te bereiden, een tang om een larve te snijden in het midden van het lichaam. Gooi de achterste helft. </li><li> Houd de voorste helft van het larvale lichaam tussen de uiteinden van een tang, draai de larve binnenstebuiten door de knop in de mond haken met de punt van de tweede tang en het rollen van de cuticula over het met de tang eerste paar. </li></ol></li><li> Met behulp van een tang verwijder zorgvuldig alle vreemde weefsels (bv speekselklieren, vet lichaam, en darm), terwijl de EAD pair ofde EAD / hersenen complex aangesloten op de mond haken. Ontwarren de mond haken van de bovenliggende opperhuid. Bevrijd de VNC door het doorsnijden van de axonale uitsteeksels aan het lichaam spieren en epidermis (figuren 1B, 2C, 2D). LET OP: De mond haken zorgen voor een veilige manipulatie van het weefsel met een pincet en efficiënter zinken en gemakkelijke herkenning van het weefsel tijdens het wassen te vergemakkelijken. Ontleed EAD verandering morfologie relatief snel bij bewaring niet vastgelegde in PBS. Beperk de dissectie tijd om 20-30 min. </li><li> Om het weefsel over te dragen, jas een P20 micropipet tip door pipetteren de resterende lichaam karkassen een paar keer op en neer. Om de grotere EAD / brain complexen over te dragen, snijd de P20 micropipet tip met een schaar. OPMERKING: De bekledingswerkwijze is kritisch om plakken en verlies van ontleed weefsel tijdens overdracht te voorkomen. Gebruik van een micropipet P20 minimaliseert de overdracht PBS in fixeeroplossing, ongewenste beperkende verdunning. <ol><li> Voor immunokleuring, overdragende EAD ontleed in een 0,5 ml buis gevuld met 400 ui 4% paraformaldehyde (PFA) fixeermiddel. Gebruik 1,5 ml buis met 1 ml PFA voor groter EAD / brain complexen bedoeld voor het scoren van invasieve. LET OP: PFA is zeer giftig. Draag beschermende handschoenen en kleding. contact met de huid, ogen of slijmvliezen. </li><li> Voor RNA-isolatie overdragen ontleed EAD in een nieuwe glazen schaal gevuld met koude PBS. Gebruik een tang om schoon te maken EAD uit de ring en de lymfeklieren, om te proeven verontreinigingen te minimaliseren. </li><li> Maak de EAD uit de mond haken door het doorsnijden van de verbinding tussen de antenne-schijven en de mond haken behulp van een tang (figuur 2E). RNA degradatie en genexpressie artefacten te voorkomen, beperken de dissectie tijd 30 min. Ga verder met stap 7. LET OP: Een ervaren onderzoeker kan ongeveer 60 larven ontleden in 30 min met uitzondering van de tijd die nodig is voor larven verzamelen en wassen. Totaal RNA opbrengsten zijn afhankelijk van de EAD grootte die variëren tussen genotypen en developmentÃl fasen. Dissectie van 80-100 controle EAD pairs uit de late derde instar larven moeten 5-8 ug totaal RNA opleveren. </li></ol></li></ol> 4. Fixing, Immunokleuring en Montage <ol><li> Fix monsters PFA fixatief 25 minuten onder Tuimelschijfmeter bij kamertemperatuur. De fixatietijd kan worden verlengd tot 60 minuten zonder dat weefselmorfologie en de antigeniciteit van eiwitten. </li><li> Verwijder het fixeermiddel en spoelmonsters met PBST (PBS met 0,1% Triton X-100) drie keer gedurende 10 minuten met een nutator. Gebruik voldoende volume PBST voor elke wasstap (400 ul / 0,5 ml buisje). OPMERKING: Vaste EAD / brain complexen bedoeld voor het scoren van invasieve niet immunokleuring niet nodig. GFP signaal blijft goed zichtbaar na fixatie. Ga verder met stap 4.4 voor de finale dissectie. <ol><li> Voor immunokleuring, blok weefsel in 200 ui van een blokkeeroplossing (PBST met 0,3% BSA) gedurende 20 minuten onder zacht schudden bij kamertemperatuur. <ol><li> Incubate met primary antilichamen verdund in 100 ul van een blokkerende oplossing overnacht bij 4 ° C onder zacht schudden. Raadpleeg primair antilichaam datasheet of gepubliceerde literatuur voor de aanbevolen antilichaam verdunning. LET OP: De primaire antilichaam verdunning zou moeten worden geoptimaliseerd. </li><li> Na vijf 10 minuten wassen in PBST, vlek weefsel met fluorescerende secundaire antilichamen verdund in blokkeeroplossing onder zacht schudden gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C in het donker. </li><li> Spoelmonsters driemaal 10 min in PBST. </li></ol></li></ol></li><li> Vervang PBST met 500 ui DAPI-kleuroplossing. F-actine label, voeg phalloidin geconjugeerd aan een fluorescente kleurstof DAPI-kleuroplossing. Na 15 min nutatie in het donker, weefsel eenmaal wassen gedurende 10 minuten met PBST. LET OP: F-actine labeling kan onafhankelijk van DAPI kleuring worden uitgevoerd. </li><li> Voor de laatste stap dissectie, transfer weefsel terug in een PBS-gevulde glazen schaal met een 1 ml piPette. Met behulp van de twee paar tang clip uit de mond haken. <ol><li> Scheid de hersenen die worden gebruikt voor het kwantificeren van invasiviteit van de EAD door het snijden van de optische stengel zo overwoekerd EAD kan de analyse belemmeren. </li></ol></li><li> Een druppel van de montage medium (15 gl van een 22 mm x 22 mm dekglaasje) op een objectieve dia. Met behulp van forceps tips, verdelen het medium in een dunne laag. Transfer EAD, hersenen of de EAD / brein complexen in de montage medium met een P20 micropipet. </li><li> Gebruik de tang tips of een wolframstaaf om weefsel te verspreiden en strek de VNC op de dia. </li><li> Om de vorming van bellen tijdens het monteren, eerste aanraking een rand van een dekglaasje aan het fixeermiddel en vervolgens langzaam op het fixeermiddel met behulp van forceps voorkomen. Gebruik kleine stukjes filtreerpapier of tissue veeg om overtollige fixeermiddel absorberen rond dekglaasje randen. LET OP: DABCO / Poly (vinyl alcohol) 4-88 montage medium verhardtbij 4 ° C binnen een uur. Dia&#39;s kunnen worden bewaard maanden bij 4 ° C. </li></ol> 5. Confocale Imaging <ol><li> Verwerven enkele confocale secties en stapels met behulp van een confocale microscoop met 20X, 40X en 60X olie doelstellingen. </li><li> Voorkom pixel verzadiging. Gebruik hetzelfde beeld acquisitie parameters zoals beeldresolutie, laser input power, gain, offset, kader middeling, een stap grootte in een z-serie en deze instellingen voor alle genotypes te voeren, zodat voor vergelijkingen van pixel intensiteiten tussen verschillende genotypen 21,22. LET OP: Voor de visualisatie van EAD / hersenen complex, het genereren van maximale projecties en steek respectieve, naburige beelden. Voor de uiteindelijke beeld voorbereiding, gebruiken na de beeldverwerking software voor paneel montage en om de helderheid en het contrast aan te passen. </li></ol> 6. Kwantificering van Tumor Invasiviteit <ol><li> Definieer een scoresysteem dat de verschillende tumor invasivenes zal kenmerkendis gezien het ruimtelijk patroon van invasie en het aantal GFP-positieve cellen zich naar de hersenen en VNC. Bereid evaluatie platen voor documentatie (figuur 3A). </li><li> Mount tenminste 80 vaste intacte hersenen voor elk genotype op een dia via 40 gl van het fixeermiddel per 24 mm x 50 mm dekglaasje. <ol><li> Om onpartijdige scoring mogelijk te maken, vraag dan een neutrale partij bij de dia&#39;s anonimiseren, zodat de scoring procedure is onpartijdige. Evalueer geanonimiseerde dia&#39;s door twee lab leden onafhankelijk van elkaar. Openbaren genotypes pas na de telling is voltooid. </li></ol></li><li> Evalueer de mate van maligniteit door een blinde scoring van gemonteerde hersenen onder een tl-stereomicroscoop uitgerust met een GFP filter set. Gebruik een marker om de hersenen die al zijn bekeken om dubbeltellingen (Figuur 3B) te vermijden labelen. </li><li> Bereken het percentage van de hersenen die in elk van de gedefinieerde invasieve categorieën per genotype. Bepaal de statistische significance met behulp van een chi-kwadraattoets (figuur 3C). </li></ol> 7. RNA isolatie, DNase behandeling en Kwaliteitscontrole Opmerking: Alle reagentia (oplossingen, plasticware) van de volgende stappen moeten vrij van RNase activiteit. Draag altijd handschoenen en gebruik maken van een chemische kap voor het werken met organische oplosmiddelen. <ol><li> Breng de schone EAD met een gecoate P20 micropipet tip in 1,5 ml buis. </li><li> Laat weefsel zinken naar de bodem van de buis, verwijder PBS en vervangen door 100 ul RNA lysisreagens (voldoende voor 140 EAD). </li><li> Lyse weefsel door vortexen. Op dit punt kunnen de monsters bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C of direct verwerkt met het standaard RNA-isolatie-protocol. LET OP: Monsters van gelijke genotypen uit meerdere dissectie rondes kan één keer worden samengevoegd in RNA-lysis reagens. </li><li> Vul het monstervolume tot 0,9 ml met RNA lysis reagens. Voeg 0,2 ml chloroform en meng monsters vigorously gedurende 15-20 sec. </li><li> Na 2-3 minuten incubatie bij kamertemperatuur gecentrifugeerd monsters bij 10.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Transfer kleurloze bovenste waterige fase die RNA in een nieuwe buis zonder interfase verstoren. Blijf weg van de tussenfase als het proteïnen en genoom DNA bevat. Opmerking: Het teruggewonnen volume moet ongeveer 60% van het volume van RNA lysis reagens gebruikt voor homogenisatie zijn. </li><li> Precipiteren het RNA door toevoeging van 0,5 ml isopropylalcohol. Vortex en incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 10.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en was de RNA pellet eenmaal met 600 ui 75% ethanol. Na een korte vortex en centrifugatie (10.000 x g gedurende 7 minuten bij 4 ° C) leggen alle ethanol en laat de RNA pellet drogen gedurende 5-10 min plaatsen van de open buis op een schone tissue afvegen. LET OP: Het RNA pellet kan zichtbaar als een klein ondoorzichtig / wit st zijnrijp op de bodem van de buis of onzichtbaar. De resterende ethanol druppels kunnen voorzichtig worden verwijderd met P10 micropipet tip. </li><li> Ontbinden RNA in 50 ul van DEPC-behandeld water door vortexen of het doorgeven oplossing een paar keer door middel van een pipet tip. </li><li> Om contaminatie met genomisch DNA minimaliseren, behandel totaal RNA met DNase door toevoeging van 50 pl van een mengsel dat 1 ul DNase (2 U / pl) en 10 pl 10X DNase buffer in DEPC-behandeld water. Vortex en spin down. </li><li> Incubeer monsters bij 37 ° C in een waterbad of verwarmingsblok gedurende 30 tot 40 minuten. Na incubatie, voeg 100 pl DEPC-behandeld water in elk monster. </li><li> De enzymatische activiteit en schone RNA inactiveren van DNase, voeg 200 ul fenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) oplossing, vortex gedurende 1 min en gecentrifugeerd monsters bij 10.000 xg gedurende 7 minuten bij 4 ° C. </li><li> Breng voorzichtig de bovenste waterige fase die RNA in een nieuwe buis. Voeg gelijk volume (200 pl)chloroform, mix en herhaal het centrifugeren stap van boven. </li><li> Verzamel zorgvuldig de bovenste fase en RNA te precipiteren door toevoeging van 1/10 volume 3 M natriumacetaat, pH 5,2 bereid in DEPC H2O en 2,5 volumina 100% ethanol. Meng goed door vortexen. Opmerking: Het toevoegen 0,5 ui glycogeen (20 ug / ul) een precipitatie mengsel helpt om de RNA pellet visualiseren. RNA te minimaliseren, gebruiken gesiliconiseerd, low-bindende 1,5 ml microcentrifugebuizen. </li><li> Precipiteren RNA bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur. LET OP: De incubatie kan worden uitgevoerd &#39;s nachts uitgevoerd. Monsters bij -80 ° C geplaatst ook. </li><li> Pellet RNA door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Was en droog pellet volgens de beschrijving in 7.9. </li><li> Ontbinden RNA in 10-15 pi DEPC-behandeld water. RNA opslag bij -80 ° C. </li><li> Bepaal hoeveelheid en zuiverheid van RNA door het meten van OD bij 230 nm, 260 nm en 280 nm met een spectrofotometer. Bereken RNA concentration door toepassing van de conventie die 1 OD bij 260 nm gelijk aan 40 ug / ml RNA. OPMERKING: De A 260/280-verhouding van &quot;zuivere&quot; RNA gelijk aan 2,0, terwijl A 260/230-verhouding dient in het traject van 2,0-2,2. RNA-monsters met een A 260/280 verhouding tussen 1,7 en 2,0 zijn geschikt voor verdere toepassingen zoals cDNA-synthese. Voor de bereiding van mRNA-bibliotheken seq de kwaliteit en kwantiteit van RNA gecontroleerd worden door middel van een geautomatiseerd elektroforesesysteem. De 28S / 18S verhouding moet hoger zijn dan 1,8. </li></ol>

<ol><li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li>
<li>Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%3A+a+bold+past%2C+a+bright+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future.</a> J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).</li>
<li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+design%3A+How+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li>
<li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).</li>
<li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li>
<li>Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPagliarini%2C+RA+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22">Science (New York, NY)</a>. 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li>
<li>Uhlirova, M., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK-+and+Fos-regulated+Mmp1+expression+cooperates+with+Ras+to+induce+invasive+tumors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila.</a> EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).</li>
<li>Turkel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BTB-zinc+finger+transcription+factor+abrupt+acts+as+an+epithelial+oncogene+in+Drosophila+melanogaster+through+maintaining+a+progenitor-like+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state.</a> PLoS Genet. 9 (7), e1003627(2013).</li>
<li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Ras+Diverts+a+Host+TNF+Tumor+Suppressor+Activity+into+Tumor+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li>
<li>Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Drosophila%2C+RhoGEF2+cooperates+with+activated+Ras+in+tumorigenesis+through+a+pathway+involving+Rho1-Rok-Myosin-II+and+JNK+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling.</a> Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).</li>
<li>Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sds22%2FPP1+links+epithelial+integrity+and+tumor+suppression+via+regulation+of+myosin+II+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling.</a> Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).</li>
<li>Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+Drosophila+Tumors+Interrupt+Insulin+Signaling+to+Induce+Cachexia-like+Wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting.</a> Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).</li>
<li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127 (4), 851-860 (2000).</li>
<li>Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology+of+the+eyeless+gene+of+Drosophila+to+the+Small+eye+gene+in+mice+and+Aniridia+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans.</a> Science. 265 (5173), 785-789 (1994).</li>
<li>Külshammer, E., Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+cross-linker+Filamin%2FCheerio+mediates+tumor+malignancy+downstream+of+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
<li>Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+cell+polarity+drives+tumor+growth+and+invasion+through+JNK+activation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila.</a> Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).</li>
<li>Külshammer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+among+Drosophila+transcription+factors+Ets21c%2C+Fos+and+Ftz-F1+drives+JNK-mediated+tumor+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).</li>
<li>Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+innate+immune+response+of+blood+cells+to+tumors+and+tissue+damage+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).</li>
<li>Chatterjee, N., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+%CE%A6C31+based+reporter+system+for+measuring+AP-1+and+Nrf2+signaling+in+Drosophila+and+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture.</a> PloS One. 7 (4), e34063(2012).</li>
<li>Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li>
<li>Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peripheral+nervous+system+supports+blood+cell+homing+and+survival+in+the+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva.</a> Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).</li>
<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemese%2C+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein%2C+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li>
<li>Andersen, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+TNF+receptor+Grindelwald+couples+loss+of+cell+polarity+and+neoplastic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth.</a> Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).</li>
<li>Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+remodeling+is+essential+for+Drosophila+disc+eversion+and+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).</li>
<li>Larionov, A., Krause, A., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+curve+based+method+for+relative+real+time+PCR+data+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A standard curve based method for relative real time PCR data processing.</a> BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).</li>
<li>Mirth, C. K., Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+body+and+organ+size+in+Drosophila%3A+recent+advances+and+outstanding+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems.</a> Front Endocrinol. 3 (49), (2012).</li>
<li>French, V., Feast, M., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+size+and+cell+size+in+Drosophila%3A+the+developmental+response+to+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature.</a> J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).</li>
<li>Ashburner, M., Bonner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+gene+activity+in+drosophila+by+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The induction of gene activity in drosophila by heat shock.</a> Cell. 17 (2), 241-254 (1979).</li>
<li>Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactive+effects+of+rearing+temperature+and+oxygen+on+the+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Biochem+Zool%22%5BJournal%5D)">Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster.</a> Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+system%3A+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression%2C+lineage+tracing%2C+and+mosaic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li>
<li>del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).</li>
<li>Rynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+Transcription+Factor+3+Regulates+Immune+and+Metabolic+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis.</a> Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).</li>
<li>Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+role+of+the+steroid-deficiency+protein+ecdysoneless+in+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004287(2014).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+intestinal+stem+cells+from+adult+Drosophila+midguts+by+FACS+to+study+stem+cell+behavior+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

De technieken voor het genereren van genetische mozaïeken in Drosophila behoren tot de meest verfijnde hulpmiddelen voor het analyseren en manipuleren genfunctie 33. De eyFLP-MARCM systeem heeft bewezen krachtig en robuust als het laat de inductie van visueel gemarkeerd, genetisch bepaald klonen in een ruimtelijk beperkte wijze, dat wil zeggen, in de weefsels waar de eyeless enhancer actief is 9,18. Dit is vooral belangrijk wanneer meerdere genetische laesies worden gecom...

Kanker is een van de meest genetisch heterogene groep van ziekten, waarvan de incidentie en sterfte neemt drastisch toe, vooral onder ouderen wereldwijd. Cancer afkomstig klonaal uit een tumor-initiërende cel die inherent tumor suppressor mechanismen ontsnapt en verdeelt uit de hand. De geleidelijke toename van de genetische laesies die gezamenlijk het stimuleren van groei, proliferatie en de beweeglijkheid, terwijl het remmen van de dood en differentiatie transformeert de eerste goedaardige begroeiing in een zeer kwaadaardige, metastatische en dodelijke tumor. Gebleken is dat naast genetische veranderingen, tumorprogressie veranderingen nodig in de omliggende stroma en overspraak tussen tumortypes en verschillende celtypes (bijvoorbeeld fibroblasten, immuun- en endotheelcellen) in de micro-omgeving. Het begrijpen van de moleculaire principes die ten grondslag liggen kwaadaardige transformatie, inclusief de tumor-stroma interacties is van groot belang voor de ontwikkeling van Preventie en vroege screeningsstrategieën, alsmede nieuwe en effectieve behandelingen voor kanker en metastase geneesmiddelresistentie bestrijden. De fruitvlieg Drosophila melanogaster is een aantrekkelijk systeem voor kankeronderzoek 1-4 dankzij zijn snelle generatie tijd geworden, opmerkelijke behoud van de signalering knooppunten tussen vliegen en de mens, beperkte genetische redundantie en de rijkdom van geavanceerde genetische tools die manipulatie van bijna elk gen in te vergemakkelijken een tijdelijk en ruimtelijk beperkte wijze. Genetische gedefinieerde tumoren van verschillende maligniteit kan reproduceerbaar worden gemanipuleerd in Drosophila door de invoering gain en verlies-van-functie mutaties in een subset van voorlopercellen in een overigens wildtype weefsel met behulp van de techniek MARCM 5. De MARCM gereedschap combineert FLP / FRT (FLP recombinase / FLP Erkenning Target) gemedieerde mitotische recombinatie 6 met FLP-out 7 en Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) 8 doelwit genexpressiesystemen 9. Met deze werkwijze expressie van een-UAS gebaseerde transgene, waaronder oncogeen of fluorescerend eiwit cDNA&#39;s of geïnverteerde DNA repeats voor dsRNA-geïnduceerde genuitschakeling, wordt beperkt tot een kloon van cellen die een specifieke genetische locus en een Gal4 repressor door recombinatie verloren (Figuur 1A). Klonen plekken gemarkeerd met green fluorescent (GFP) of rood fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld, RFP, DsRed, mCherry) kan eenvoudig worden gevolgd tijdens de ontwikkeling, geïsoleerd en geanalyseerd. Belangrijker is dat hun gedrag rechtstreeks vergeleken met de aangrenzende wildtype weefsel. Zo vragen relevant zijn voor de cel autonome als niet-autonome effecten van genetische laesies kunnen gemakkelijk worden bestudeerd. Soortgelijke zoogdieren, alleen klonen waarin meerdere oncogene laesies combined maligne Drosophila worden en herhalen belangrijkste kenmerken van kankercellen van een zoogdier. Ze overproliferate, ontwijken apoptose, induceren ontsteking, onsterfelijk en Invasive uiteindelijk het doden van de gastheer 10-17. Hier beschrijven we een protocol om genetisch bepaald klonale tumoren in het oog / antennaal en hersenweefsel van Drosophila larven te genereren met behulp van de MARCM techniek. De werkwijze berust op een MARCM tester materieel dat de gist FLP recombinase onder de controle van de enhancer ogenloze (eyFLP) 18,19 uitdrukt. Op deze wijze worden gemerkt GFP klonen gegenereerd in zowel peripodial en cilindrisch epitheel van de EAD en neuro-epitheel van de hersenen tijdens de embryonale en larvale stadia (Figuur 1A, B en referentie 20). Klonen kunnen eenvoudig worden gevolgd tot volwassenheid als EAD zich ontwikkelt tot de volwassen oog, antenne en het hoofd capsule, terwijl de neuroepithelium aanleiding geeft tot neuroblasts dat gedifferentieerde optische kwab neuronen produceren. Uitgebreide moleculaire, functionele en fenotypische karakterisering van het mozaïek weefsel, we de te vergemakkelijkenschrijver een protocol voor dissectie van de EAD en hersenen van de derde instar larven en een beschrijving te verwerken voor drie verschillende toepassingen: (i) het opsporen van transgene fluorescente reporters en immunokleuring, (ii) kwantificering van tumor invasiviteit en (iii) analyse van genexpressie verandert met een kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) of high-throughput sequentiebepaling mRNA (mRNA-seq) (Figuur 1C). De immunokleuring protocol kan worden gebruikt om een ​​eiwit van belang te visualiseren met een specifiek antilichaam. Transgene fluorescerende transcriptionele reporters bieden handige en nauwkeurige tijdruimtelijke gegevens over de activiteit van een bepaalde signaleringsroute. Cel-afstammingslijn specifieke reporters, anderzijds, tijdens kwalitatieve en kwantitatieve veranderingen in celpopulaties binnen de mozaïek weefsel en bij tumoren van verschillende genotypes. Kwantificering van invasieve gedrag maakt de vergelijking van tumor maligniteit tussen genotypes. Ten slotte is het protocol beschrijft inzameling en verwerking van mozaïek EAD voor RNA-isolatie is geschikt voor zowel kleine als grote schaal downstream-toepassingen zoals reverse transcriptie gevolgd door qRT-PCR en genoom-brede mRNA-seq, respectievelijk. De kwalitatieve en kwantitatieve gegevens verkregen uit deze testen leveren nieuwe inzichten in het sociale gedrag van klonale tumoren. Bovendien produceren ze een solide basis voor functionele studies over de rol van individuele genen, genetische netwerken en tumor micro-omgeving in verschillende stadia en aspecten van tumorigenese.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Gew&uuml;rzm&uuml;hle Brecht, Eggenstein, Germany</td><td>00262-0500</td><td>Fly food recept: Bereid 20 L vliegvoer met 160 g agar, 360 g gist, 200 g sojameel, 1,6 kg gele maïsmeel, 1,2 L moutextract, 300 ml maïsstroop, 130 ml propionzuur en 200 ml 15% nipagin. Vliegvoer moet gedurende 1 uur worden gekookt op 85&nbsp;&deg;C.</td></tr><tr><td>Corn syrup</td><td>Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany</td><td>01939</td><td></td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6026.1</td><td></td></tr><tr><td>Cornmeal</td><td>ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany</td><td>4010155063948</td><td></td></tr><tr><td>Malt extract</td><td>CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany</td><td>728985</td><td></td></tr><tr><td>Soy flour</td><td>Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany</td><td>1000246441010</td><td></td></tr><tr><td>Yeast</td><td>Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany</td><td>210099K</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-4-benzoate/ Nipagin</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>H5501</td><td>Maak een 15% stamoplossing met 70% EtOH</td></tr><tr><td>Drosophila fly food vials</td><td>Kisker Biotech, Steinfurt, Germany</td><td>789008</td><td></td></tr><tr><td>Vial plugs</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Germany</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila fly food bottles</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td><td>960177</td><td></td></tr><tr><td>Bottle plugs</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Germany</td><td>1002 S</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>81381</td><td>Montagemedium recept: Los 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 op in 39&nbsp;ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) en 12,5 ml glycerol. Roer een nacht bij 50&nbsp;&deg;C en centrifugeer 20&nbsp;min bij 5.000 rpm. Voeg DABCO toe aan het supernatant om een uiteindelijke concentratie van 2,5% te verkrijgen. Bewaar aliquots bij -20&nbsp;&deg;C.</td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline/ PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 en 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 in Millipore H2O</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>0,1% Triton X-100 in PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde/ PFA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>158127</td><td>4% PFA fixeermiddelrecept: Los 4&nbsp;g PFA op in 80 ml Millipore H2O op een magnetische roerplaat verwarmd tot 55&nbsp;&deg;C. Voeg druppelsgewijs 1 M NaOH toe totdat alle PFA-deeltjes zijn opgelost. Voeg 10 ml 10x PBS toe en pas de pH aan tot 7,4 met 1 M HCl. Meng 100 &micro;l Triton X-100 en vul aan met Millipore H2O tot 100 ml. Bewaar aliquots bij -20 &deg;C. Vermijd herhaald ontdooien. (VOORZICHTIG: PFA is zeer giftig. Bereid het PFA-fixeermiddel in een afzuigpunt voor. Draag een zelfstandige ademhalingstoestel, handschoenen en kleding. Vermijd contact met huid, ogen of slijmvliezen.)</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin/ BSA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>A3059</td><td>Blokkaroplossing recept: Los 0,3% BSA op in PBST</td></tr><tr><td>Fluorescently labeled phalloidin</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes</td><td>A12379, A22283, A22284</td><td>Phalloidin stamoplossing: Los poeder (300 U) op in 1,5 ml Methanol. Bewaar bij -20 &deg;C. Gebruik voor kleuring in verdunning 1:250 (A12379, A22283) en 1:100 (A22284) in PBST.</td></tr><tr><td>4&rsquo;,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6335</td><td>DAPI-kleuringsoplossing: Bereid een stamoplossing van 5 mg/ml in Millipore H2O en bewaar aliquots bij 4 &deg;C. Gebruikt in verdunning 1:1.000 in PBST.</td></tr><tr><td>Mouse anti-H2 antibody</td><td>Kurucz et al., 2003</td><td></td><td>Gebruikt in verdunning 1:500 in blokkaroplossing</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK</td><td>715-175-151</td><td>Gebruikt in verdunning 1:500 in blokkaroplossing</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Glass embryo dish (30&nbsp;mm)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>E90</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten needles</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>10130-20</td><td></td></tr><tr><td>Nickel Plated Pin Holder</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>631-1553</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gl&auml;ser)</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16&nbsp;mm)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>1076371</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Precision Wipes</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>06-677-70</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting stereomicroscope</td><td>Olympus, Hamburg, Germany</td><td>SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent stereomicroscope</td><td>Olympus, Hamburg, Germany</td><td>SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) met

de<em&gt; drosophila</em&gt; imaginal disc tumor model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en tumor invasiviteit met behulp van genetische mozaïeken

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster is opgekomen als een krachtig experimenteel systeem voor functionele en mechanistische studies van tumorontwikkeling en -progressie in de context van een heel organisme. Geavanceerde technieken om genetische mozaïeken te genereren, vergemakkelijken de inductie van visueel gemarkeerde, genetisch gedefinieerde klonen, omgeven door normaal weefsel. De klonen kunnen worden geanalyseerd door middel van diverse moleculaire, cellulaire en omics benaderingen. Deze studie beschrijft hoe fluorescent gelabelde clonale tumoren van variërende maligniteit in de oog/antennale imaginaire schijven (EAD) van Drosophila-larven kunnen worden gegenereerd met behulp van de Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) techniek. Het beschrijft procedures om de mozaïek EAD en hersenen uit de larven te herstellen en hoe deze te verwerken voor gelijktijdige beeldvorming van fluorescente transgene reporters en antilichaamkleuring. Om moleculaire karakterisering van het mozaïekweefsel te vergemakkelijken, beschrijven we een protocol voor isolatie van totaal RNA uit de EAD. De dissectieprocedure is geschikt om EAD en hersenen van elk larvestadium te herstellen. Het fixatie- en kleuringsprotocol voor imaginaire schijven werkt met een aantal transgene reporters en antilichamen die Drosophila-eiwitten herkennen. Het protocol voor RNA-isolatie kan worden toegepast op verschillende larvale organen, hele larven en volwassen vliegen. Totaal RNA kan worden gebruikt voor profilering van genexpressieveranderingen met behulp van kandidaat of genoombrede benaderingen. Ten slotte beschrijven we een methode voor het kwantificeren van de invasiviteit van de clonale tumoren. Hoewel deze methode beperkt van toepassing is, is het onderliggende concept breed toepasbaar op andere kwantitatieve studies waarbij cognitieve bias moet worden vermeden.

Om het potentieel van de eyFLP-MARCM techniek om GFP gemerkt stukken gedefinieerde genotypen in Drosophila EAD genereren demonstreren, werden drie klonen geïnduceerd: (1) controle expressie alleen GFP, (2) maligne tumoren tot expressie een oncogene vorm van de kleine G-proteïne Ras (Ras V12) in een achtergrond van homozygote verlies van een tumorsuppressorgen scribble (Scrib 1) en (3) begroeiing maar niet-invasieve ras V12 S...

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Het algemene doel van dit protocol is om te demonstreren hoe de oog-antenne-imaginale schijven en hersenen van drosophila, met genetisch gedefinieerde fluorescentie-gemarkeerde klonen, gedisseceerd kunnen worden en hoe deze verwerkt moeten worden om veranderingen in genexpressie en celinvasiviteit te visualiseren en te kwantificeren. De beschreven procedures kunnen helpen om nieuwe inzichten te verschaffen in de rol van genen bij epitheliale ontwikkeling, homeostase of ziekte, en om mechanismen te ontleden die ten grondslag liggen aan hun competitie, compensatoire proliferatie of interklonale samenwerking. Het belangrijkste voordeel van deze studie is dat wij een volledig pakket protocollen bieden die zijn afgestemd op diepgaande kwantitatieve en kwalitatieve analyse van drosophila genetische mozaïeken.Over het algemeen hebben personen die voor het eerst met het drosophila-model werken moeite omdat zij de oog-antenne-imaginale schijf niet kunnen onderscheiden van andere imaginale schijven. Om de herkenning van oog-antenne-imaginale schijven met fluorescent gemerkte klonen in het larvenlichaam te vergemakkelijken, wordt aanbevolen om de eerste dissecties onder een fluorescentiemicroscoop uit te voeren. Mozaïekanalyse met een onderdrukbare celmarker of MARCM maakt de generatie van genetisch gedefinieerde clonale clusters mogelijk in een verder fenotypisch wild-type context.Een FLP die wordt aangestuurd door een eyeless-promotor katalyseert recombinatie tussen twee FRT-elementen die een stopcassette flankeren, gemarkeerd met een geel gen. Na DNA-replicatie katalyseert FLP de uitwisseling van de niet-zusterchromatiden tussen de homologe chromosomen, waardoor zusterchromatiden ontstaan: één die het wildtype-allel en de Gal80-repressor draagt, en de andere het mutant.Bij mitose scheiden deze zich zodanig dat er twee dochtercellen ontstaan, waarvan één een homozygote mutant is en de andere wildtype. Verlies van de Gal80-repressor maakt GFP-expressie mogelijk in de mutant, terwijl de wildtype-cellen GFP-negatief blijven. Begin het experiment door mozaïeklarven te oogsten door PBS in het vliegenflesje te spuiten om het oppervlak van het voedsel te bedekken.Maak vervolgens de bovenlaag zacht met een spatel en giet het voedselmengsel met de larven in een petrischaal. Pak de larven voorzichtig op en breng ze over naar een embryo-schaaltje gevuld met PBS. Verzamel ten minste 20 larven voor immunokleuring en 80 larven voor de kwantificering van de tumorinvasiviteit.Was de larven met PBS om alle voedselresten te verwijderen. Identificeer en verwijder met een fluorescent stereomicroscoop bij een vergroting van 8,16x alle 'leopard'-larven; dit zijn de larven die willekeurige GFP-positieve vlekken over het gehele lichaam vertonen. Plaats de schaal met de overgebleven larven in PBS op ijs tot aan de dissectie.Om de oog-antenne-imaginale schijf onder de stereomicroscoop te dissekeren, gebruikt u één paar pincetten om de larve voorzichtig vast te pakken op ongeveer 2/3 van de lichaamslengte posterieur van de kop. Pak met het tweede paar pincetten de mondhaken van de larve vast en trek deze weg van het lichaam. Ontward met pincetten de mondhaken van de bovenliggende cuticula en overbodig weefsel, zoals de speekselklieren en het vetlichaam.Om alternatief het oog-antenne-schijf-hersencollectief voor te bereiden waarbij het ventrale zenuwwand intact blijft, gebruik dan een pincet om een larve in het midden van het lichaam door te snijden. Verwijder de posterieure helft. Houd de anterieure helft van het larvenlichaam vast met de punten van één pincet en keer de larve vervolgens binnenstebuiten door de mondhaken met de punt van het tweede pincet naar binnen te duwen en de cuticula eroverheen te rollen met het eerste pincet.Verwijder zorgvuldig al het overbodige weefsel, inclusief het darmstelsel, het vetlichaam en de speekselklieren. Trek de mondhaken voorzichtig los van de cuticula. Maak het complex van de oog-antenne-schijf en het brein, dat vastzit aan de mondhaken, vrij door de axonale projecties door te snijden die zich uitstrekken van het ventrale zenuwkoord naar de spieren en de epidermis.Om het weefsel over te brengen, wordt eerst een P20-micropipetpunt gecoat door de overgebleven lichaamskarkassen meerdere keren op en neer te pipetteren; gebruik vervolgens dezelfde punt om het gedisseceerde weefsel over te brengen. Om grotere oog-antenne-schijf hersencomplexen over te brengen, moet de P20-punt vooraf worden ingekort om de opening te vergroten. Fixeer de monsters in 400 µL 4% PFA-fixeermiddel gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur onder nutatie.Verwijder vervolgens het fixeer middel en was de monsters drie keer gedurende 10 minuten met PBST onder nutatie. Vervang daarna de PBST door 500 µL DAPI-kleuringsoplossing en nutate gedurende 15 minuten in het donker. Was het weefsel eenmaal gedurende 10 minuten met PBST.Om de dissectie te voltooien, gebruikt u een pipette van één milliliter om het weefsel terug over te brengen naar een met PBS gevulde glazen schaal. Scheid met twee pincetten de hersenen die gebruikt zullen worden voor de kwantificering van de invasiviteit van de oog-antenne-schijven door de optische stelen door te snijden. Bevrijd de oog-antenne-schijven door ze van de mondhaken af te knippen.Plaats een druppel monteermedium op een objectglas en verdeel de vloeistof met een pincet tot een dunne laag. Om de invasiviteit te kwantificeren, plaatst u ten minste 80 gefixeerde, intacte hersenen per genotype op één enkel objectglas. Strijk het weefsel glad en positioneer het naar wens.Raak met één rand van een dekglas voorzichtig het medium aan en laat het langzaam zakken met behulp van een pincet om luchtbellen te voorkomen. Gebruik een laboratoriumdoekje om overtollig medium aan de randen te absorberen. Het weefsel kan nu worden onderzocht met behulp van confocale beeldvorming.Vraag een neutrale partij om de coupes te anonimiseren, zodat de scorebepaling onbevooroordeeld verloopt. Laat de coupes onafhankelijk worden geëvalueerd door ten minste twee onderzoekers. Onthul de genotypen pas nadat de scorebepaling is voltooid.Evalueer de graad van maligniteit onder een fluorescente stereomicroscoop uitgerust met een GFP-filterset. Gebruik een markering om hersenen die al zijn bekeken te labelen om dubbeltellingen te voorkomen. Fluorescente confocale beelden tonen hersenen gedisseceerd uit larven met maligne RAS V12 scribble-mutante GFP-gelabelde clonale tumoren, gekleurd met DAPI.De panelen representeren de vier verschillende gradaties van tumorinvasiviteit. Onbevooroordeelde kwantificering onthulde dat inhibitie van JNK-signalering en RAS V12 scribbled one-klonen de tumorinvasiviteit onderdrukten. In controle oog-antenneschijven labelt de JNK-gevoelige TRE-DsRED-reporter slechts een smalle strook cellen die van het antennegedeelte naar het ooggedeelte loopt.In tegenstelling hiermee was de TRE-DsRED-activiteit duidelijk verhoogd in de GFP-positieve maligne clonale tumoren. Tegen dag 8 waren de tumorcellen overgegroeid op de oog-antenne-schijven en verspreid naar het ventrale zenuwkoord. De binnendringende tumorcellen vertoonden ook een verhoogde JNK-activatie in vergelijking met het omringende weefsel.Hoewel het blokkeren van JNK de TRE-DsRED-activiteit in de tumorclonen duidelijk verminderde, onthulde een verhoging van de laserintensiteit een toename in de epitheelcellen rondom de clonen. Daarnaast toonde een hemolectine delta DsRED-reporter aan dat, in tegenstelling tot de enkele clusters hemocyten die gevonden werden in de inkepingen van het controle-oog-antenne-epitheel, hemocyten accumuleerden in het oog-antenne- en hersenweefsel dat uit maligne tumoren bestond. Na inhibitie van JNK nam het aantal geassocieerde immuuncellen drastisch af.De verhoogde tumorinvasiviteit, JNK-activiteit en hemocyteninfiltratie gingen gepaard met een significante opregulatie van MMP1 mRNA, bepaald via QRTPCR met gebruik van totaal RNA geïsoleerd uit gedissecteerde mozaïek oog-antenne-schijven. Zodra men de techniek beheerst, kunnen er meer dan 60 paren oogschijven en hersenen binnen 30 minuten worden gedissecteerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er een voldoende aantal larven van de gewenste genotypen gegenereerd moet worden.Werk snel maar nauwkeurig tijdens het dissekeren om monsters die bestemd zijn voor RNA-isolatie RNase-vrij te houden. Na de dissectieprocedure kan western blotting worden gebruikt als alternatief voor immunokleuring om veranderingen in eiwitexpressie tussen verschillende genotypen te beoordelen. Het creëren van genetische mozaïeken en het analyseren ervan met de beschreven procedures maakt onderzoek mogelijk naar anderszins lethale mutaties en naar mechanismen van oncogene cooperatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u mozaïekweefsels van de oog-antenne-schijf en hersenen van derdestadiumlarven moet dissekeren en hoe u deze moet verwerken voor immunokleuring, visualisatie van transgene en reporteractiviteit, RNA-extractie en de kwantificering van invasiviteit.Houd er rekening mee dat PFA, alsozowel als fenol-chloroform en DAPI, zeer toxisch zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van beschermende handschoenen en kleding, bij het werken met deze middelen.

the-drosophila-imaginal-disc-tumor-model-visualization-quantification

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Mesoscopische fluorescentie tomografie opereert buiten de grenzen van de penetratie-weefsel snijden fluorescentie microscopie. De techniek is gebaseerd op multi-projectie verlichting en een foton transport beschrijving. Tonen we aan in-vivo het hele lichaam 3D-visualisatie van de morfogenese van GFP-expressie vleugel imaginaire schijven...

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Met behulp van kwantitatieve PCR, we zien hoe de gevestigde chick CAM-model kan worden gebruikt om kwantitatief analyseren van de uitzaaiing van menselijke tumorcellen naar verre organen.

Kwantitatieve analyse van kanker metastase met behulp van een Avian Embryo Model

We hebben 3D coculture modellen voor live-cell imaging in real-time van de interacties tussen borsttumor cellen en andere cellen in hun micro-omgeving die van invloed zijn progressie naar een invasieve fenotype. Deze modellen kunnen dienen als preklinisch schermen voor drugs te paracriene-geïnduceerde proteolytische, chemokine / cytokine en kinase pathways die betrokken zijn bij invasiviteit richten.

MAME Modellen voor 4D live-cell imaging van de tumor: micro-omgeving interacties die van invloed zijn Maligne Progression

Samenwerking tussen een geactiveerd oncogen zoals RAS V12 en mutaties in cel polariteit genen zoals gekrabbeld, leiden tot tumorgroei in Drosophila waar tumorcellen ook weergeven invasief gedrag. Hier een eenvoudig protocol voor de inductie en observatie van de goedaardige en invasieve tumoren wordt gepresenteerd.

Een protocol voor Genetische Inductie en Visualisatie van goedaardige en Invasieve Tumoren in Cephalic Complexen van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

De volwassen structuren van Drosophila zijn afgeleid van zak-achtige structuren die imaginale schijven worden genoemd. Analyse van deze schijven biedt inzicht in vele ontwikkelingsprocessen, waaronder weefselbepaling, oprichting van compartimentgrenzen, celproliferatie, celbestemmingsspecificatie en cellulaire planaire polariteit. Dit protocol wordt gebruikt om imaginale schijven voor te bereiden op licht-/fluorescentiemicroscopie.

Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster

Het doel van deze studie is om aan te tonen hoe de mozaïek transgenese strategie kan worden gebruikt bij zebravissen om snel en efficiënt de relatieve bijdragen van meerdere oncogenen in tumorinitiatie en progressie in vivo te beoordelen.

Mozaïek zebravis Transgenese voor Functioneel genomische analyse van de kandidaat-coöperatieve genen in Tumor Pathogenese

Mozaïek kloon analyse in Drosophila imaginal disc epithelia is een krachtig model systeem om de genetische en cellulaire mechanismen van tumorigenese te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om tumoren te induceren in Drosophila- vleugel-imaginale schijven met behulp van het GAL4-UAS-systeem, en introduceert een diagnose-methode om de tumorfenotypen te classificeren.

Inductie en diagnose van tumoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

Dit protocol is ontworpen voor de beeldvorming en analyse van de dynamiek van celoriëntatie en weefselgroei in de Drosophila abdominale epithelia terwijl de fruitvlieg een metamorfose ondergaat. De hier beschreven methodologie kan worden toegepast op de studie van verschillende ontwikkelingsstadia, weefsels en subcellulaire structuren in Drosophila of andere modelorganismen.

Beeldvorming en analyse van weefseloriëntatie en groeidynamiek in de ontwikkeling van Drosophila Epithelia tijdens pupale stadia

Dit protocol biedt gedetailleerde richtlijnen voor de initiële en voortgezette generatie allotransplantatie van Drosophila-tumoren in de buik van volwassen gastheren voor het bestuderen van verschillende aspecten van neoplasie. Met behulp van een auto-injectorapparaat kunnen onderzoekers verbeterde efficiëntie en tumoropbrengsten bereiken in vergelijking met die bereikt door traditionele, handmatige methoden.

Tumor allotransplantatie in Drosophila melanogaster met een programmeerbare Auto-Nanoliter Injector

Hier bieden we een stapsgewijs protocol, met tips om xenograften te genereren en richtlijnen voor tumorgedragsanalyse, whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming kwantificering.

Generatie zebravislarven xenografts en tumorgedragsanalyse

Het gebruik van een immunocompetent, autochtoon tumormodel aangedreven door gemeenschappelijke patiëntmutaties voor preklinische tests is van cruciaal belang voor immunotherapeutische tests. Dit protocol beschrijft een methode om muismodellen voor hersentumoren te genereren met behulp van op elektroporatie gebaseerde afgifte van plasmide-DNA die veelvoorkomende patiëntmutaties vertegenwoordigen, waardoor een nauwkeurig, reproduceerbaar en consistent muismodel wordt verkregen.

Modellering van hersentumoren in vivo met behulp van op elektroporatie gebaseerde afgifte van plasmide-DNA dat de handtekeningen van patiëntmutaties vertegenwoordigt

Leer hoe je Drosophila oog-antenne imaginale schijven en hersenen dissecteert om genexpressie en tumorinvasiviteit te visualiseren en kwantificeren met behulp van genetische mozaïeken.

De Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken (Video) | JoVE Journal

De

Meer video's verkennen