De Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken
6 oktober 2016
Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.
Het algemene doel van dit protocol is om aan te tonen hoe de drosophila oog-antennaal imaginaire schijven en hersenen worden gedissected, met genetisch gedefinieerde fluorescent gemarkeerde klonen, en hoe ze worden verwerkt om veranderingen in genexpressie en celinvasiviteit te visualiseren en te kwantificeren. De beschreven procedures kunnen helpen om nieuwe inzichten te verschaffen in de rol van genen en epitheliale ontwikkeling, homeostase of ziekte en om mechanismen te ontrafelen die ten grondslag liggen aan hun concurrentie, compenserende proliferatie of interclonale corporatie. Het belangrijkste voordeel van de studie is dat we een volledige reeks protocollen bieden die zijn aangepast voor diepgaande kwantitatieve en kwalitatieve analyse van de genetische mozaïeken van drosophila.
Over het algemeen worstelen nieuwe mensen die met het drosophila-model werken omdat ze de oog-antennaal imaginaire schijf niet kunnen herkennen van de andere imaginaire schijf. Om de herkenning van de oog-antennaal imaginaire schijf met fluorescent gemarkeerde klonen in het lichaam van de larve te vergemakkelijken, wordt aanbevolen om de eerste dissecties onder een fluorescente microscoop uit te voeren. Mozaïekanalyse met een repressible celmarker of MARCM maakt de generatie van genetisch gedefinieerde clonale patches in een anders fenotypisch wild-type context mogelijk.
Een FLP, aangedreven door een eyeless-promoter, katalyseert recombinatie tussen twee FRT-elementen die een stopcassette flankeren, gemarkeerd met een geel gen. Na DNA-replicatie katalyseert FLP de uitwisseling van de niet-zusterchromatiden tussen de homologe chromosomen waardoor zusterchromatiden worden gegenereerd. Een die het wild-type allel en Gal80-repressor draagt en de andere de mutant.
In mitose scheiden deze zich om twee dochtercellen te produceren, één homozygoot mutant en de andere wild type. Verlies van de Gal80-repressor maakt GFP-expressie mogelijk in de mutant, terwijl de wild-type cellen GFP-negatief blijven. Om het experiment te beginnen, oogst je mozaïek larven door PBS in de vliegenfles te spuiten om het oppervlak van het voedsel te bedekken.
Verzachten vervolgens de bovenste laag met een spatel en giet de voedselslurry met larven in een petrischaal. Kies voorzichtig de larven en breng ze over in een embryobak gevuld met PBS. Verzamel minstens 20 larven voor immunokleuring en 80 larven voor kwantificering van tumorinvasiviteit.
Was de larven met PBS om alle resterende voedsel te verwijderen. Gebruik een fluorescente stereomicroscoop met 8:16x vergroting om alle luipaardlarven te identificeren en weg te gooien, dit zijn de larven die willekeurige GFP-positieve vlekken over het hele lichaam vertonen. Plaats de schaal met de resterende larven in PBS op ijs tot de dissectie.
Om de oog-antennaal imaginaire schijf onder de stereomicroscoop te dissecteren, gebruik je één paar pincetten en grijpt voorzichtig de larve op ongeveer 2/3 van de lichaamslengte achter het hoofd. Met het tweede paar pincetten grijpt je de mondhaken van de larve en trekt ze weg van het lichaam. Gebruik pincetten om de mondhaken los te maken van de overlappende cuticula en overtollig weefsel zoals de speekselklieren en het vetlichaam.
Alternatief, om de oog-antennaal schijf-hersenencomplex voor te bereiden en de ventrale zenuwstreng intact te houden, gebruik je pincetten om een larve in het midden van het lichaam te snijden. Gooi het achterste deel weg. Houd de voorste helft van het larvale lichaam met de uiteinden van één paar pincetten vast en draai de larve binnenstebuiten door de mondhaken naar binnen te duwen met de punt van het tweede paar en de cuticula erover te rollen met het eerste paar pincetten.
Verwijder voorzichtig al het overtollige weefsel, inclusief de darm, het vetlichaam en de speekselklieren. Trek voorzichtig de mondhaken weg van de cuticula. Laat het oog-antennaal schijf-hersenencomplex los dat aan de mondhaken is bevestigd door de axonale projecties door te snijden die zich uitstrekken van de ventrale zenuwstreng naar de spieren en epidermis.
Om het weefsel over te brengen, bekleed je eerst een P20 micropipettip door de resterende lichaamscarcassen meerdere keren op en neer te pipetten en gebruik vervolgens dezelfde tip om het gedissekteerde weefsel over te brengen. Om grotere oog-antennaal schijf-hersenencomplexen over te brengen, snijd je het P20-tipje voor om de opening te vergroten. Fixeer de monsters in 400 microliters van 4% PFA-fixatief gedurende 25 minuten op kamertemperatuur terwijl genuteerd wordt.
Verwijder vervolgens het fixatief en was de monsters drie keer gedurende 10 minuten met PBST met nutatie. Vervang vervolgens PBST door 500 microliters DAPI-kleuringsoplossing en nutateer gedurende 15 minuten in het donker. Was het weefsel eenmaal gedurende 10 minuten met PBST.
Om de dissectie te voltooien, gebruik je een een milliliterpipet om het weefsel terug te brengen in een met PBS gevulde glazen schaal. Gebruik twee paar pincetten om de hersenen te scheiden die zullen worden gebruikt voor kwantificering van invasiviteit van de oog-antennaal schijven door de optische stengels door te snijden. Bevrijd de oog-antennaal schijven door ze af te knippen van de mondhaken.
Plaats een druppel montagemedium op een abductieve schuif en verdeel met behulp van pincetten de vloeistof in een dunne laag. Om invasiviteit te kwantificeren, plaats je minstens 80 gefixeerde intacte hersenen voor elke genotype op een enkele schuif. Maak het weefsel recht en positioneer het zoals gewenst.
Raak voorzichtig met één rand van een dekglas het medium aan en laat het langzaam zakken met behulp van pincetten om bellen te voorkomen. Gebruik een laboratoriumdoek om overtollig montagemedium aan de randen te absorberen. Het weefsel kan nu worden onderzocht met behulp van confocale beeldvorming.
Vraag een neutrale partij om de schuiven anoniem te maken zodat de score onbevooroordeeld is. En laat schuiven onafhankelijk worden geëvalueerd door ten minste twee onderzoekers. Maak genotypen pas bekend nadat de scorering voltooid is.
Evalueer de mate van malign
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol toont hoe je de Drosophila oog-antenne imaginale schijven en hersenen ontleedt om genexpressieveranderingen en tumorinvasiviteit te visualiseren en te kwantificeren. Het biedt een uitgebreide reeks protocollen voor het analyseren van genetisch gedefinieerde fluorescent gemarkeerde klonen.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Drosophila dient als modelorganisme voor het bestuderen van genetische mozaïeken.
- De oog-antenne imaginale schijf is cruciaal voor het begrijpen van epitheliale ontwikkeling.
- Fluorescente markeringen helpen bij het identificeren van specifieke klonen.
- Inzicht in genconcurrentie en proliferatie is essentieel voor inzichten in ziektemechanismen.
Doel van de studie
- Protocollen bieden voor het ontleden van Drosophila-weefsels.
- Visuele weergave van genexpressieveranderingen in clonale tumoren.
- Kwantificering van tumorinvasiviteit en cellulaire interacties.
Gebruikte methoden
- Ontleding van derde instar larven om oog-antenne schijven en hersenen te verkrijgen.
- Gebruik van fluorescente microscopie voor initiële dissecties.
- Mosaic analyse met een repressible celmarker (MARCM).
- Kwantitatieve en kwalitatieve analyse van genetische mozaïeken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van fluorescent gemarkeerde clonale tumoren.
- Visualisatie van genexpressieveranderingen in het Drosophila model.
- Inzichten in de mechanismen van celinvasiviteit en concurrentie.
- Verbeterd begrip van epitheliale homeostase en ziekte.
Conclusies
- De protocollen maken gedetailleerde analyse van genetische interacties in Drosophila mogelijk.
- Fluorescente markeringen vergemakkelijken de studie van clonale dynamica.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van ontwikkelingsbiologie en ziektemechanismen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The Drosophila imaginal disc tumor model provides a genetically tractable system for mechanistic de-risking of oncogenic pathways and tumor-stroma interactions in a whole-organism context. By enabling visualization and quantification of gene expression changes and cellular invasiveness in defined genetic mosaics, the approach supports target validation and phenotypic screening in early discovery. It offers a disease-relevant system for assessing mechanistic drivers of tumor progression with predictive confidence for downstream translational efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing gene expression changes in fluorescently marked clonal tumors.
- Scientific Value: Supports functional target validation through MARCM-generated mosaics that isolate mutant clones in wild-type tissue.
- Scientific Value: Facilitates biological de-risking by quantifying tumor invasiveness and associated stromal responses such as hemocyte infiltration and MMP1 upregulation.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Provides a standardized dissection and fixation workflow for preparing eye-antennal discs and brains for immunostaining and transgenic reporter visualization.
- Operational Value: Enables quantitative assessment of invasiveness through blinded scoring of blinded slides by multiple researchers, reducing cognitive bias.
- Operational Value: Supports RNA isolation from dissected tissues for gene expression profiling via qRT-PCR or genome-wide approaches.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links genetic manipulations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system modeling epithelial tumor progression.
- Translational Value: Supports mechanistic de-risking by connecting JNK signaling inhibition to reduced tumor invasiveness and immune cell recruitment.
- Translational Value: Offers a platform for testing genetic or pharmacological modifiers of tumor-stroma interactions in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a scalable system for hypothesis testing, pathway clarification, and phenotypic readouts that inform lead identification and preclinical prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through visualization of transgenic reporters and antibody staining in defined genetic mosaics.
- Screening: Enables assay readiness via standardized tissue recovery, fixation, and staining protocols compatible with multiple transgenic lines and antibodies.
- Analytics: Generates quantitative outputs such as invasiveness scores and gene expression levels that allow comparative analysis across genotypes.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by modeling tumor invasiveness and stromal engagement in a whole-organism context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying genetic interactions, oncogene cooperation, and tumor progression mechanisms across multiple larval stages and genotypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in tumor-stroma and genotype-phenotype relationships.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized dissection, fixation, and blinded quantification procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of oncogenic potency and microenvironmental engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative data on tumor aggressiveness and molecular markers of progression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, fluorescent microscopy, and genetic mosaic techniques such as MARCM.
- Dependent on instrumentation including fluorescent and confocal microscopes, microtomes for slide preparation, and RNA isolation tools.
- Necessitates cross-team standardization for tissue dissection, staining, and scoring to ensure consistency across users and experiments.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different larval stages, genotypes, or transgenic reporters.
- Includes practical limitations such as the need for large larval numbers (≥80 for invasiveness quantification) and careful handling to avoid RNA degradation during dissection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Genetic Crosses and Collection of Third Instar Larvae
3:10
Dissection of Larvae
4:52
Fixing and Staining of Tissues
5:58
Tissue Mounting and Quantification of Tumor Invasiveness
7:10
Results: Visualization, Tumor Quantification, and Gene Expression
9:04
Conclusion
