Name: Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Leer een snelle methode voor circadiaan-fenotypering in Arabidopsis-protoplasten met luminescente reporters. Deze techniek analyseert circadiane perioden zonder stabiele transgene lijnen te genereren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Prof. David Somers en Dr. Jeongsik Kim bedanken voor de luciferase reporter plasmide en de initiële methodeontwikkeling. Prof. Karen Halliday verstrekte vriendelijk alle circadiane mutante lijnen die in dit onderzoek werden gebruikt. Dit onderzoek werd ondersteund door Royal Society onderzoekssubsidies RS120372 en RS140275. GvO is een Royal Society University Research Fellow (UF110173).

LET OP: In dit protocol worden reagentia en volumes beschreven uitgedrukt per Arabidopsis lijn die wordt getest, en zal resulteren in zes repliceren putten voor die genotype. Vermenigvuldig het materiaal met het aantal regels te analyseren bij het analyseren van meerdere regels. In de video, zal wildtype Arabidopsis worden vergeleken met de circadiane klok mutantlijn ZTL (hoewel representatieve resultaten van andere lijnen later worden verstrekt). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> enzymoplossing </td><td></td></tr><tr><td> cellulase </td><td> 0,5% (w / v) </td></tr><tr><td> pectinase R10 </td><td> 0,25% (w / v) </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Runderserumalbumine </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> W5-oplossing </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> MMG oplossing </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG-oplossing </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> 40% (w / v) </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td&gt; <td> 100 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Imaging oplossing </td><td></td></tr><tr><td> W5-oplossing </td><td> eindvolume </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> luciferine </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> ampicilline </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Lijst van oplossingen. 1. Voorbereiding van Materialen en Buffers <ol><li> Plant Materialen <ol><li> Houd Arabidopsis Col -0 zaden in water in een 1,5 ml buis bij 4 ° C in het donker gedurende vier dagen. Pipetteer de zaden op aarde in een pot overgebracht, staan ​​omstandigheden (16 uur licht 8 uur donker) bij 21 ° C gedurende 7 dagen. Laat een deksel op de pot voor de eerste drie dagen hoge vochtigheidsgraad waarborgen. Transplant zes zaailingen in nieuw 8 cm x 13 cm x 5 cm pot en verder groeien van de planten onder dezelfde voorwaarden another 21 dagen. Zorg ervoor dat de bodem is vochtig overal. </li></ol></li><li> Reporter Plasmid <ol><li> Zuiver het CCA1pro: LUC reporterplasmide 19 van bacteriekweek vooraf, met behulp van een DNA isolatie kit volgens instructies van de fabrikant. OPMERKING: 20 ug reporterplasmide vereist (10 gl bij 2 ug / ul in dH 2 O) voor transfectie. </li></ol></li><li> Oplossingen OPMERKING: Hiervoor protocol vijf oplossingen nodig: enzymoplossing, Wash oplossing 5 (W5) oplossing, Mannitol-Magnesium (MMG), polyethyleenglycol (PEG) oplossing en imaging oplossing (Tabel 1). Bereid deze voordat u doorgaat naar de protoplastisolatie stap. <ol><li> Bereid 10 ml enzymoplossing volgens Tabel 1, het toevoegen van de enzymen laatste en filter steriliseren van de oplossing door een 0,22 urn spuitfilter. </li><li> Bereid de resterende oplossingen in de volgende volumes: 15 ml W5-oplossing, 10 ml MMG sPLOSSING, 1 ml PEG-oplossing en 1,5 ml weergaveoplossing volgens tabel 1. Opmerking: Het is belangrijk dat de PEG-oplossing niet minder bereid dan een uur voor de transfectie zodat de PEG volledig is opgelost. Filter steriliseren de imaging oplossing door een 0,22 pm spuitfilter. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> Figuur 1:. Protoplastisolatie De bladeren van volwassen Arabidopsis planten (A) zijn bevestigd op autoclaventape met de lagere epidermale lagen naar boven (B). (C) Magic tape voorzichtig op de onderste epidermale laag met de punt van een 15 ml conische buis gedrukt. (D) De magic tape wordt verwijderd om de mesofylcellen (E) bloot. (F) Stroken autoclaaf tape met verlofs bevestigd worden geïntroduceerd op enzymoplossing die cellulase en pectinase, vrijgeven protoplasten in de oplossing. (G) De bladskeletten blijven autoclaventape na enzymdigestie worden verwijderd, waardoor de protoplasten enzymoplossing (H). (I) Final resulteert bladmoes protoplasten (Schaal bar = 50 pm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 2. protoplastisola- <ol><li> Label een petrischaaltje en voeg 10 ml-filter gesteriliseerd Enzyme oplossing. </li><li> Fix vier stroken autoclaventape met de klevende zijde naar boven op een schone laboratorium oppervlak en merk van de grootte van de petrischaal op de stroken. </li><li> Snijd de bladeren van 4 weken oude planten (figuur 1a), en druk op de bovenste epidermis op de autoclaaf tape (dwz de ondergrens huidoppervlak naar boven ( <strong&gt; Figuur 1b)). </li><li> Druk voorzichtig op strips van magie tape op het onderste epidermale oppervlak met behulp van een 15 ml conische buis. Zorg ervoor dat u het blad weefsel (figuur 1c) verpletteren. Trek de magie tape af naar de onderste epidermis strip (figuur 1d) en bloot de bladmoes cellen (Figuur 1e). </li><li> Snijd de autoclaaf tape om de petrischaal te passen, gebruik een pincet om de band te verplaatsen naar de petrischaal en drijven op het enzym-oplossing (figuur 1f), laat naar beneden. Draaien met 60 rpm op een platform schudmachine gedurende 60 minuten, waarbij de protoplasten wordt vrijgemaakt in de oplossing. </li><li> Met een pincet aan de oplossing bevattende de protoplasten (figuur 1H) in een 50 ml conische buis Verwijder de stroken autoclaventape (figuur 1G) en pipet. Gebruik een breed-boring pipetpunt (zoals een P5000 tip of een P1000 tip met het einde afgesneden). </li><li> Centrifugeer de protoplasten bij 100 xg gedurende 3 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof met een pipet. Wees voorzichtig, omdat de pellet is erg los. </li><li> Voeg 10 ml W5 oplossing voor de protoplasten en resuspendeer onder voorzichtig schudden de buis. </li><li> Rest de protoplasten op ijs gedurende 30-60 min. Tijdens deze stap beoordeelt opbrengst van protoplasten te tellen in een hemocytometer (Figuur 1i). </li><li> Verzamel de protoplasten door centrifugatie bij 100 x g gedurende 3 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof met een pipet. Wees voorzichtig, omdat de pellet is erg los. </li><li> Resuspendeer de protoplasten tot een concentratie van 5 x 10 5 protoplasten / ml in MMG oplossing. </li></ol> 3. Protoplast Transfectie <ol><li> Voeg 10 ul reporterplasmide (2 ug / ul) in een 15 ml conische buis. </li><li> Voeg 400 ul protoplasten aan de buis. </li><li> Voeg een volume (410 pl) PEG-oplossing en meng door het buisje voorzichtig 12 keer tot de protoplasten transfecteren. </li><li> Na 8-15 min incubation bij kamertemperatuur, de protoplast-DNA-PEG mengsel met vier volumina (1640 ui) W5-oplossing en meng door voorzichtig zes keer. </li><li> Verzamel de getransfecteerde protoplasten door centrifugatie bij 100 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en de bovenstaande vloeistof met een pipet. Nogmaals, zorg, zoals de pellet is erg los. </li><li> Resuspendeer de protoplasten in 1250 pl weergaveoplossing. </li><li> Aliquot 200 ul in zes repliceren putjes van een 96-well plaat, vul alle lege putten met W5-oplossing, en sluit de plaat met een kleefmiddel duidelijke deksel geschikt voor lichtgevende beeldvorming. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Breng de plaat aan een lichtgevende beeldvorming setup geschikt voor installatie beeldvorming. Verander het kleefmiddel deksels op de platen 10-15 min na overdracht naar condensatie en drukverschillen tussen de putjes te voorkomen, start beeldvorming. Lees de plaat elk ~ 45 min (3 sec per putje) gedurende vijf dagen bij kamertemperatuur. Merk opfrequentie van de plaat leest en de leestijd per goed zou kunnen variëren afhankelijk van de beeldvorming setup. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Analyseer de luminescentie resultaten met behulp van een analysesoftware (bijvoorbeeld biologische ritmes Analysis Software System (messing) 22). Vergelijk de mutant lijn naar wild-type controles om circadiane gebreken onthullen. </li></ol>

<ol><li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+the+circadian+clock+and+innate+immunity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis.</a> PLoS Pathog. 9 (6), 1003370(2013).</li>
<li>Hevia, M. A., Canessa, P., Müller-Esparza, H., Larrondo, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circadian+oscillator+in+the+fungus+Botrytis+cinerea+regulates+virulence+when+infecting+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).</li>
<li>Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defence+responses+of+Arabidopsis+thaliana+to+infection+by+Pseudomonas+syringae+are+regulated+by+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock.</a> PLoS One. 6 (10), 26968(2011).</li>
<li>Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+carbohydrate+availability+for+growth+in+Arabidopsis+plants+at+night%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).</li>
<li>Dodd, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+circadian+clocks+increase+photosynthesis%2C+growth%2C+survival%2C+and+competitive+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage.</a> Science. 309 (5734), 630-633 (2005).</li>
<li>Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+transcriptome+analysis+reveals+circadian+regulation+of+key+pathways+in+plant+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development.</a> Genome Biol. 9 (8), 130(2008).</li>
<li>Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Circadian+Phosphoproteomic+Analysis+of+Arabidopsis+Reveals+Extensive+Clock+Control+of+Key+Components+in+Physiological%2C+Metabolic%2C+and+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).</li>
<li>Mizoguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LHY+and+CCA1+Are+Partially+Redundant+Genes+Required+to+Maintain+Circadian+Rhythms+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis.</a> Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).</li>
<li>Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELF4+is+a+phytochrome-regulated+component+of+a+negative-feedback+loop+involving+the+central+oscillator+components+CCA1+and+LHY%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY.</a> Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).</li>
<li>Lu, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCA1+and+ELF3+Interact+in+the+Control+of+Hypocotyl+Length+and+Flowering+Time+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).</li>
<li>Nakamichi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSEUDO-RESPONSE+REGULATORS+9%2C+7%2C+and+5+are+transcriptional+repressors+in+the+Arabidopsis+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock.</a> Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).</li>
<li>Dixon, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+repression+of+core+circadian+genes+is+mediated+through+EARLY+FLOWERING+3+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).</li>
<li>Gendron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+circadian+clock+protein%2C+TOC1%2C+is+a+DNA-binding+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).</li>
<li>Hsu, P. Y., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheels+within+wheels%3A+the+plant+circadian+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Wheels within wheels: the plant circadian system.</a> Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).</li>
<li>Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CK2+phosphorylation+of+CCA1+is+necessary+for+its+circadian+oscillator+function+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).</li>
<li>Portolés, S., Más, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+interplay+between+protein+kinase+CK2+and+CCA1+transcriptional+activity+is+essential+for+clock+temperature+compensation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001201(2010).</li>
<li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+regulation+of+the+Arabidopsis+circadian+clock+through+selective+proteolysis+and+phosphorylation+of+pseudo-response+regulator+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins.</a> J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).</li>
<li>Kim, J., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assessment+of+gene+function+in+the+circadian+clock+using+artificial+microRNA+in+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).</li>
<li>Wu, F. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 16(2009).</li>
<li>Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase%3A+the+structure+is+known%2C+but+the+mystery+remains%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains.</a> Structure. 4 (3), 223-228 (1996).</li>
<li>Edwards, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+regulatory+flexibility+under+changing+environmental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions.</a> Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424(2010).</li>
<li>Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZEITLUPE+Encodes+a+Novel+Clock-Associated+PAS+Protein+from+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis.</a> Cell. 101 (3), 319-329 (2000).</li>
<li>Wang, Z. -Y., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+Expression+of+the+CIRCADIAN+CLOCK+ASSOCIATED+1+%28CCA1%29+Gene+Disrupts+Circadian+Rhythms+and+Suppresses+Its+Own+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression.</a> Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).</li>
<li>Kim, W. -Y., Geng, R., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+phase-specific+degradation+of+the+F-box+protein+ZTL+is+mediated+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).</li>
<li>Zhai, Z., Jung, H. -I., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+protoplasts+from+tissues+of+14-day-old+seedlings+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+direct+gene+transfer+to+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+rice+green+tissue+protoplast+system+for+transient+gene+expression+and+studying+light%2Fchloroplast-related+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes.</a> Plant Methods. 7 (1), 30(2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een snelle bepaling om circadiane periode gebreken in Arabidopsis-lijnen, zoals protoplastisolatie, transfectie en luminecent afbeeldscherm. De circadiane periode in de wild-type Arabidopsis en de klok mutanten cca1 / Lhy, ZTL en CCA1 -Ox werd berekend uit metingen van luminescentie uit een CCA1pro: LUC reporter en vond in overeenstemming met gepubliceerde gegevens gegenereerd op basis van hele planten met behulp van meer tijd- te zijn consumeren transgene benaderingen (tabel 2). Met behulp van deze test om Arabidopsis mutanten screenen vermijdt de eerste vereiste om transgene lijnen luminescerende genereren, wat tijdrovend en kan alleen bekend dat er een bepaalde mutant vertoont wildtype ritmes. Een duidelijk voordeel van dit protocol is dat elke Arabidopsis lijn kan worden gescreend in korte tijd veranderde circadiane transcriptie ritmes, die de identificatie van meer genen die van invloed tijdwaarneming in planten zal helpen. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Isolatie van protoplasten kan omslachtig zijn, vooral als de mutant regel geeft een verkleinde fenotype. Eerder gemeld methoden voor het genereren van protoplasten betrekken snijden bladeren of zaailingen in dunne reepjes en vacuüm infiltreren in de strips met enzymoplossing zodat de enzymen om de celwanden 26,27 bereiken. De daaropvolgende digestie vereist ten minste 3 uur incubatie in het donker naar de protoplasten introductie in de enzymoplossing. Wanneer vacuüm infiltratie niet wordt toegepast, wordt incubatietijd tot 18 uur geadviseerd. In de hier gepresenteerde protocol, vacuüm infiltratie niet nodig omdat de epidermale cellaag ondoordringbaar voor de enzymen wordt verwijderd door de tape. Bij het genereren van protoplasten door snijden plantaardig materiaal moet worden gescheiden van protoplasten celwand puin na digestie; Dit wordt meestal gedaan door het filteren van de oplossing of het zuiveren van het op een helling suiker 27,26. Hier vindt elke onverteerd weefsel op de autoclaaf tape na blijvenspijsvertering, zodat filtratie en suiker gradiënt zuivering van de protoplasten kan worden weggelaten. Er is een kans dat de stress als gevolg van langdurige protoplasting procedures beïnvloedt levensvatbaarheid van de cellen en de circadiane klok. De tape-gebaseerde protoplasting methode 20 hier gevisualiseerd levert een groot aantal protoplasten; en gezien de levensvatbaarheid van cellen over een circadiane tijdreeks en de bijbehorende periodelengten protoplasten en gehele zaailingen (tabel 2), is de hier beschreven werkwijze de voorkeur boven andere methoden om protoplasten te genereren. De transfectie stap van het protocol is een cruciale stap dat de gevolgen voor de levensvatbaarheid van de protoplasten. De PEG-oplossing maakt het DNA te leveren in de cel, en beide incubatietijd in deze oplossing (stap 3,4) en het percentage van PEG moet empirisch worden bepaald. De standaardconcentratie is 20%, met lagere concentraties verminderen de transformatie-efficiëntie en hogereconcentraties verlagen de levensvatbaarheid 28. Incubatietijd zo kort vijf minuut efficiënte transfectie van de protoplasten 27 werd verkregen. De protoplasten kan worden afgebeeld op een luminescerend imaging platform. In deze video, hebben we een luminescentie plaatlezer uitgerust met externe verlichting gebruikt (rode en blauwe LED&#39;s 630 en 470 nm, respectievelijk, op een gecombineerde intensiteit van ~ 20 uE), die zorgt voor hoge doorvoer screening en frequente metingen. Andere beeldapparatuur die luminescentie gedetecteerd, zoals alternatieve plaatlezers of opstellingen rond een ladingsgekoppelde inrichting (CCD) camera, zou evengoed worden toegepast zolang verlichting beschikbaar is voor de fotosynthese. Het voordeel van een CCD camera gemonteerd op een bestuurbare kast wordt licht en temperatuur kunnen worden geprogrammeerd. Een nadeel is de langere opnametijdstip invoering langdurige duisternis die stress kan veroorzaken aan de protoplasten naast verstorening endogene tijdwaarneming. Ongeacht welke experimenteel platform wordt gekozen, aanpassing van instellingen waarschijnlijk noodzakelijk zijn in vergelijking met instellingen voor zaailingen of volgroeide planten. In onze ervaring, het verhogen van de concentraties van reporterplasmide tijdens transfectie en / of luciferine in de beeldvorming buffer kan eventuele onregelmatig of snel dempende ritmes die zich kunnen voordoen in de eerste experimenten op te lossen. In toekomstige experimenten, kan de hier beschreven methode worden toegepast om de circadiaanse fenotype van elke mutant Arabidopsis lijn bestuderen. Met kleine aanpassingen, kan het effect van bijvoorbeeld verschillende geneesmiddelen op tijdwaarneming worden bestudeerd in deze opstelling. Bovendien kan de transfectie worden gewijzigd om kunstmatige microRNA voor gen-silencing 19 omvatten verder uitbreiden van de veelzijdigheid van dit protocol. Protocollen bij rijstprotoplasten genereren zijn gerenommeerde 29 en de imaging protocol hier gepresenteerde kan evengoed worden toegepast op onze u verdernderstanding van de klok in economisch belangrijke monocotyle gewasplanten.

De meeste levende organismen hebben een endogene tijdwaarnemer efficiënte onderhandelingen over de dagelijkse veranderingen in de omgeving te helpen. Dit tijdwaarnemer, de circadiane klok, reguleert vele aspecten van het metabolisme en fysiologie van een organisme voorspelbare veranderingen in de externe omgeving te anticiperen. In planten bijvoorbeeld, vooruitlopend op tijdelijk voorspelbare pathogeen of herbivoor aanvallen vermindert sterk de algehele gevoeligheid 1-4. Zetmeel metabolisme wordt strak gereguleerd door de circadiane klok van vorig ervoor te zorgen dat zetmeel reserves tot het ochtendgloren of geteeld op lange of korte dag omstandigheden 5. Inderdaad, planten met circadiane klok die overeenkomen met de 24 hr milieu tonen verhoogde groeipercentages, koolstofbevestiging tarieven en overleving in vergelijking met planten runnen van een klok van mismatched periode van 6. De uitgebreide invloed van circadiane ritmes in al deze processen ontstaat grotendeels uit de ritmische regeling tot een derdevan de totale transcriptoom in Arabidopsis 7. Deze ritmische genproducten zijn betrokken bij een breed scala aan cellulaire processen waaronder metabole pathways, hormoon signalering en stressreacties 7. Op de top van dat, is de directe circadiane regulatie van eiwitfunctie vastgesteld bij circadiane regulatie van fosforylering 8 en waarschijnlijk andere post-translationele modificaties (PTMs). In het centrum van de circadiane klok die deze dagelijkse transcriptie herprogrammering drijft ligt een netwerk van transcriptionele / translationele feedback loops (TTFLs), met inbegrip van de ochtend uitgedrukte genen circadiane klok ASSOCIATED 1 (CCA1) en LATE VERLENGDE hypocotyl (LHY), die de expressie onderdrukken van de avond genen TIMING vAN CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) en de leden van de avond complex (EG); LUX ARRHYTHMO (LUX), vroegbloeiende 3 (ELF3) en ELF4 9-11. samen with de pseudo REACTIE REGELAAR-genen (PRR3, 5, 7 en 9), TOC1 onderdrukt CCA1 / LHY expressie, terwijl de EG fungeert als een positieve regulator 12-14. Extra naar terugkoppelingsmechanismen, post-transcriptionele en post-translationele regulering van de TTFL netwerkcomponenten speelt een belangrijke rol bij het afstemmen circadiane ritmes. Tot op heden de meest voorkomende PTM geïdentificeerd op circadiane klok eiwitten fosforylatie 15. De fosforylatie van CCA1 door Caseïne kinase 2 (CK2) beïnvloedt de binding aan promoters 16 gericht en is belangrijk voor temperatuurcompensatie van de circadiane klok 17. De PRR eiwitten worden gefosforyleerd differentieel over de circadiane cyclus, en fosforylering van TOC1 invloed op de interactie met zijn negatieve regulator, de avond gefaseerde klok component Zeitlupe (ZTL) 18. Deze voorbeelden illustreren hoe PTMs en eiwit-eiwit interacties tunen van de TTFL netwerk in een 24-uurstranscriptionele oscillator. Voor een nadere kennismaking met de transcriptie klok netwerk en de regulering, uitstekende recente beoordelingen beschikbaar zijn (bv referentie 15). Wat echter nog minder duidelijk is welke mate ritmisch gereguleerde processen en andere aspecten van cellulair metabolisme feedback voor de tijdwaarneming mechanisme zelf. Uitgebreide screening van Arabidopsis mutanten klok defecten kan verder begrip van welke mechanismen of signaal transductie in de generatie van 24 uur ritmes kunnen worden betrokken uit een TTFL netwerk. Daartoe Kim en Somers eerder gepubliceerde een doorbraak werkwijze voor de efficiënte en snelle analyse van klokfunctie enkele Arabidopsis lijn 19. Gebaseerd op het gebruik van tijdelijke expressie in protoplasten, overtreft deze methode de behoefte aan stabiele transgene lijnen of kruist luminescerende klok marker lijnen. Hier, visualiseren we een hoge opbrengst protoplast isolation methode 20 in combinatie met een geoptimaliseerd protocol circadiane gebreken door luminescerende beeldvorming van transiënt tot expressie klok markers screenen in een 96-well plaatlezer. We zullen vergelijken wild-type Samen- 0 Arabidopsis om goed gekarakteriseerd klok mutanten aan de hier beschreven met succes detecteert veranderde circadiaanse ritmes methodologie te bevestigen. Protoplasten afgeleid van deze lijnen worden getransfecteerd met een reporter construct dat vuurvliegluciferase van de circadiane CCA1 promotor uitdrukt; CCA1pro: LUC 19. Luciferase katalyseert de meerstaps reactie waarbij luciferine wordt omgezet in elektronische geëxciteerde oxyluciferin dat licht uitzendt 21, die is afgebeeld in de tijd om de periode, amplitude en fase van transcriptionele ritmes in deze protoplasten beoordelen. Het protocol bestaat uit drie grote delen; isoleren van de protoplasten, transfecteren van de protoplasten met het reporterplasmide, en luminescerend imveroudering. Deze drie onderdelen moeten altijd worden uitgevoerd op een enkele dag, met vers bereide buffers en reagentia. Plantengroei en zuivering van voldoende hoeveelheden reporterplasmide moet worden uitgevoerd op voorhand en zijn niet zichtbaar in dit protocol.

<table><tbody><tr><td>CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectinase R10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Acros Organics</td><td>327765000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>327300010</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fischer Scientific</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td><td>Acros Organics</td><td>434630010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Firefly</td><td>Biosynth AG</td><td>L-8200</td><td>Los op luciferinepoeder in 0,1 M trisfosfaatbuffer pH 8,0 tot een concentratie van 50 mM</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9618</td><td></td></tr><tr><td>Comply Steam Indicator Tape</td><td>3M</td><td>1222</td><td></td></tr><tr><td>Magic Tape</td><td>3M</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 96 well, flat bottom, white</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates</td><td>Perkin Elmer</td><td>6050195</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 10 ml, w/o needle</td><td>BD Plastipak</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.22 &micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td><td></td><td></td><td>Gratis te downloaden op amillar.org</td></tr><tr><td>QIAfilter Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12262</td><td></td></tr><tr><td>Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell</td><td>Hawksley</td><td>AC6000</td><td></td></tr><tr><td>Bright field microscope</td><td>Optika Microscopes</td><td>B-150POL-B</td><td></td></tr><tr><td>LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module</td><td>Berthold Technologies Ltd</td><td>57947/57948</td><td></td></tr></tbody></table>

snelle analyse van het circadiaans fenotypes in arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een lichtgevende klok reporter

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

De circadiane klok van planten maakt het mogelijk om dagelijkse veranderingen in de omgeving te anticiperen. Deze anticipatie helpt bij de reacties op tijdelijk voorspelbare biotische en abiotische stress. Omgekeerd leidt verstoring van circadiane tijdmeting ernstig tot een aantasting van de gezondheid van planten en vermindert de opbrengsten van landbouwgewassen. Het is daarom van cruciaal belang dat we de complexe regulatie van circadiane ritmen bij planten begrijpen, inclusief de factoren die van invloed zijn op de beweging van de transcriptionele klok zelf.
Het testen van circadiane defecten in de modelplant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) omvat traditioneel het kruisen van specifieke mutante lijnen met een lijn die ritmisch vuurvlieg-luciferase uitdrukt vanuit een promotor van een circadiane klokgen. Deze aanpak is arbeidsintensief, tijdrovend en kan vruchteloos zijn als een mutant geen circadiane fenotype heeft. De hier gepresenteerde methodologie maakt een snelle initiële beoordeling van circadiane fenotypes mogelijk. Protoplasten afgeleid van mutante en wild-type Arabidopsis worden geïsoleerd, getransfecteerd met een ritmisch uitgedrukte luminescente reporter en gedurende 5 dagen onder constante lichtcondities geïmaged. De luminescente sporen zullen direct laten zien of de vrijlopende periode van mutante planten anders is dan die van wild-type planten. Het voordeel van de methode is dat elke Arabidopsis-lijn efficiënt kan worden gescreend, zonder de noodzaak om een stabiel transgeen luminescente klok-markerlijn in die mutante achtergrond te genereren.

Protoplasten van wild-type Arabidopsis werden vergeleken met de bekende klok mutanten cca1 / Lhy (korte periode mutant 2), ZTL (lange periode mutant 23), en de overexpressie lijn CCA1 -Ox (aritmische 24). Allen werden tijdelijk met de CCA1pro: LUC reporter en afgebeeld in constant licht op een bord lezer over 5 dagen. Hier laten we zien dat in de cca1 / Lhy mutant, de free-running periode van circadiane-gecontroleerde genexpressie wordt verkort (figuur 2a), in lijn met de gepubliceerde periode van stabiele transgene expressie van lichtgevende klok markers 2,9 geanalyseerd. De periode van circadiane oscillaties in protoplasten van de ZTL mutant langer dan in wildtype (figuur 2b), in overeenstemming met eerder gepubliceerde resultaten van zaailingen, celsuspensie cultures en protoplasten 19,23,25. Overexpressie van CCA1 sloten de klok in de ochtend-fase en mondiale transcriptie wordt aritmische 24. Consequent, zagen we geen oscillaties in CCA1pro: LUC expressie in CCA1 -Ox protoplasten (figuur 2c). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> Figuur 2: Protoplast circadiaanse ritmes Protoplasten van Samen- 0, cca1 / Lhy, ZTL en CCA1 -Ox werden tijdelijk getransformeerd met de CCA1pro: LUC construct en circadiane ritmen bij luminescentie werden afgebeeld over 5 dagen (A - C). (D) circadiane periode schattingen op basis van luminescentie sporen in Col -0, cca1 / Lhy en ZTL (A - B). Meeen ± SEM, n = 3-5, t-test p-waarde zoals aangegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotype </td><td> Periode (protoplasten) </td><td> Periode (transgene) </td><td> Aangegeven door: </td><td> Referenties </td></tr><tr><td> collega 0 </td><td> 23,0 ± 0,21 </td><td> 24,4 ± 0,09 </td><td> pCCA1: LUC in Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> cca1 / Lhy </td><td> 20,6 ± 0,13 </td><td> 19,9 ± 0,11 </td><td> pCCA1: LUC in Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> RNA in L ER achtergrond </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25,1 ± 0,12 </td><td> 27,4 ± 0,5 </td><td> CAB2: LUC in C24 ecotype </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 -Ox </td><td> aritmische </td><td> aritmische </td><td> pCCA1: LUC (LD alleen gegevens) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> aritmische </td><td> RNA en eiwit in Col -0 achtergrond </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> Tabel 2: circadiane ritmes in protoplasten vergelijking met Transgene Zaailingen de circadiane periode pCCA1. LUC expressie in protoplasten opzichte van de periodelengten eerst gemeld voor de mutatie en, indien beschikbaar, met pCCA1: LUC expressie in Col -0.

De circadiane klok regelt ongeveer een derde van de Arabidopsis transcriptoom, maar het percentage van genen die te gebruiken bij tijdwaarneming blijft onbekend. Hier visualiseren we een methode om circadiane fenotypes snel te beoordelen in welke mutant lijn van Arabidopsis met behulp van lichtgevende beeldvorming van een circadiaan reporter tijdelijk tot expressie gebracht in protoplasten.

Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Het algemene doel van deze assay is om de circadiane periode in Arabidopsis-lijnen te bepalen door de luminescentie te meten die wordt uitgezonden door getransfecteerde protoplasten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de circadiane biologie, zoals welke genen terugkoppelen naar het tijdwaarnemingsmechanisme zelf. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snelle analyse mogelijk maakt van de circadiane periode van elke Arabidopsis-mutant zonder dat het nodig is om stabiele transgene lijnen te genereren.Om deze procedure te starten, labelt u een petrischaal en voegt u hieraan 10 milliliters gefilterde, gesteriliseerde enzymoplossing toe. Bevestig vier stroken autoclaaftape met de plakzijde naar boven op een schoon laboratoriumoppervlak en markeer de afmetingen van de petrischaal op de stroken. Haal de planten op uit de groeikamer.Snijd bladeren van vier weken oude planten af en druk de bovenste epidermis op de autoclaaftape, zodat het onderste epidermale oppervlak naar boven is gericht. Breng stroken magische plakband aan op het onderste epidermale oppervlak. Gebruik een conische buis van 15 milliliter om de stroken voorzichtig op de bladeren te drukken, waarbij u er op let dat het bladweefsel niet wordt geplet.Trek de tape voorzichtig los om de onderste epidermis te verwijderen en de mesofylcellen bloot te leggen. Knip vervolgens de autoclaaf-tape op de maat van de petrischaal, gebruik een pincet om de tape in de petrischaal te plaatsen en laat deze drijven op de enzymoplossing, met de bladeren naar beneden gericht. Roteer 60 minuten bij 60 RPM op een platformshaker, waarbij de protoplasten in de oplossing vrijkomen.Verwijder na 60 minuten de stroken autoclaaftape met een pincet en gooi deze weg. Pipetteer de oplossing met de protoplasten met behulp van een wide bore pipetpunt in een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer de protoplasten 3 minuten bij 100 gee bij 4 °C en verwijder voorzichtig het supernatant, aangezien de pellet zeer los is.Voeg 10 milliliters W5-oplossing toe aan de protoplasten en resuspendeer door de buis voorzichtig te wervelen. Neem een aliquot protoplasten af om deze te tellen. Laat de protoplasten 30 tot 60 minuten op ijs rusten.Terwijl de protoplasten op ijs staan, wordt de opbrengst beoordeeld door de protoplasten in een hemocytometer te tellen. Verzamel de protoplasten door centrifugatie bij 100 gee gedurende drie minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant voorzichtig, aangezien de pellet zeer los is.Resuspendeer tot slot de protoplasten in MMg-oplossing tot een concentratie van 500.000 protoplasten per milliliter. Begin de procedure voor protoplast-transfectie door tien microliter reporterplasmid toe te voegen aan een conische buis van 15 milliliter, gevolgd door 400 microliter protoplasten. Voeg één volume polyethyleenglycol, of PEG-oplossing, toe en meng door de buis voorzichtig 12 keer om te keren om de protoplasten te transfecteren.Incubeer gedurende acht tot 15 minuten bij kamertemperatuur. De protoplasten moeten lang genoeg worden geïncubeerd om een efficiënte transfectie te garanderen, maar niet te lang, aangezien dit hun levensvatbaarheid zal verminderen. Verdun vervolgens het mengsel van protoplasten, DNA en PEG met vier volumes W5-oplossing en meng door voorzichtig zes keer om te keren.Verzamel de getransfecteerde protoplasten door centrifugatie bij 100 gee gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant met een pipet, waarbij opnieuw grote zorgvuldigheid in acht moet worden genomen aangezien de pellet zeer los is. Resuspendeer de protoplasten in 1.250 microliters imaging-oplossing.De protoplasten zouden vrij gemakkelijk moeten resuspenderen, wat aangeeft dat ze intact zijn na transfectie. Verdeel aliquots van 200 microliters per putje over zes replica-putjes van een 96-well plaat, en vul eventuele lege putjes met W5-oplossing. Sluit de plaat af met een transparant plakdeksel dat geschikt is voor luminescentie-imaging.Om de protoplasten te beelden, brengt u de 96-wells plaat over naar een luminescentie-beeldingsopstelling die geschikt is voor planten. Vervang het kleefdeksel van de plaat 10 tot 15 minuten na de overdracht om condensatie en drukverschillen tussen de wells te voorkomen. Start de beeldvorming.Lees de plaat elke 45 minuten gedurende vijf dagen af bij kamertemperatuur. Analyseer vervolgens de luminescentieresultaten met behulp van een analyse-software, bijvoorbeeld het Biological Rhythms Analysis Software System. Mesofyl protoplasten geïsoleerd volgens dit protocol worden in deze afbeelding getoond bij een vergroting van 200 keer.Protoplasten van wild-type Arabidopsis en de cca1/lhy-mutant werden getransfecteerd en in constant licht gedurende vijf dagen afgebeeld met een plaatlezer. Zoals verwacht is de vrije-loopperiode van de klok-gestuurde genexpressie verkort bij deze mutant. In tegenstelling hiermee is de periode van circadiane oscillaties in protoplasten van de ztl-mutant verlengd.In protoplasten die CCA1 overexpresseren, waren er geen oscillaties in de expressie van het reporterconstruct, omdat overexpressie van CCA1 leidt tot aritmie. Dit staafdiagram toont de schattingen van de circadiane periode op basis van luminescentiesporen in wild-type en klok-mutante protoplasten. Deze circadiane perioden zijn consistent met gepubliceerde gegevens die zijn gegenereerd uit hele planten met behulp van tijdrovende transgene benaderingen.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gezonde planten te gebruiken en de protoplasten voorzichtig te behandelen, aangezien ze fragiel zijn. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in drie tot vier uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u Arabidopsis-protoplasten kunt isoleren, transfecteren en afbeelden.Deze technieken kunnen nu worden toegepast op elke mutantlijn, of zelfs worden aangepast om protoplasten van andere plantensoorten te visualiseren.

rapid-analysis-circadian-phenotypes-arabidopsis-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

Hier beschrijven we instellingen om parallel de circadiane bioluminescentie en de secretoire activiteit van humane eilandcellen en primaire myotubes te monitoren. Hiervoor gebruikten we lentivirale genoverdracht van een luciferase kernklok reporter, gevolgd door in vitro synchronisatie en het verzamelen van uitstroommedium door continue celperfusie.

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

Een in vitro bioluminescentie test om te bepalen van cellulaire circadiane ritme in de borstklier epitheliale cellen wordt gepresenteerd. Deze methode maakt gebruik van zoogdiercellen verslaggever plasmiden gedestabiliseerd luciferase onder de controle van de periode 2 gen promotor uitdrukken. Het kan worden aangepast aan andere celtypes te evalueren orgel-specifieke effecten op de circadiane ritme.

In Vitro Bioluminescentie Assay te karakteriseren Circadian Rhythm in borstklier epitheliale cellen

Genetisch gecodeerde luciferase is een populaire niet-invasieve verslaggever van genexpressie. Gebruik van een geautomatiseerde longitudinale luciferase imaging gas - en temperatuur-geoptimaliseerde recorder (ALLIGATOR) staat longitudinale opname van bioluminescente cellen onder een brede waaier van voorwaarden stelt. Hier laten we zien hoe ALLIGATOR kan worden gebruikt in het kader van circadiane ritmen onderzoek.

Flexibele meting van bioluminescente verslaggevers met behulp van een geautomatiseerde longitudinale Luciferase Imaging Gas - en temperatuur-geoptimaliseerde Recorder (ALLIGATOR)

Deze nieuw ontwikkelde fluorescentie gebaseerde technologie kan op lange termijn van de transcriptie van de circadiane klok genen in de suprachiasmatic kern (SCN) vrij bewegen muizen in real time en met een hoge temporele resolutie.

In Vivo Controle van de circadiane klok genexpressie in de muis Suprachiasmatic kern met behulp van fluorescentie verslaggevers

Het doel van dit protocol is om de ex vivo Drosophila larvale hersenen cultuur, geoptimaliseerd voor het controleren van de circadiane moleculaire ritmes met langdurige fluorescentie time-lapse beeldvorming. De toepassing van deze methode op farmacologische testen wordt ook besproken.

Eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van Drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur

Circadiane ritmes, die in de meeste organismen voorkomen, reguleren de tijdelijke organisatie van biologische processen. 3D-organoïden zijn onlangs naar voren gekomen als een fysiologisch relevant in vitromodel . Dit protocol beschrijft het gebruik van bioluminescente reporters om circadiane ritmes in organoïden te observeren, waardoor in vitro onderzoek naar circadiane ritmes in meercellige systemen mogelijk wordt.

Circadiane oscillaties monitoren met een bioluminescentiereporter in organoïden

Dit rapport beschrijft een methode met een R-script in de open-source software RStudio om grootschalige datasets te analyseren die zijn verkregen uit tijdreeksexperimenten.

Een gebruiksvriendelijke en krachtige R-analyse van grootschalige datasets

Deze video toont een procedure voor het isoleren van intacte protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis. Gezien het feit dat de geïsoleerde protoplasten intact blijven gedurende minstens 96 uur en worden geïsoleerd van zaailingen in plaats van een-maand-oude volwassen planten, deze procedure versnelt assays die intact protoplasten.

Isolatie van Protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis thaliana</em

Leer een snelle methode voor circadiaan-fenotypering in Arabidopsis-protoplasten met luminescente reporters. Deze techniek analyseert circadiane perioden zonder stabiele transgene lijnen te genereren.

Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter

Meer video's verkennen