Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van vesiculaire transportgebeurtenissen in de endocytische route van levende cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van vesiculair transport, zoals de wijze waarop mutaties of veranderingen in eiwitexpressie de snelheid en efficiëntie van transportgebeurtenissen beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het directe kwantificering van endocytisch transport in levende cellen mogelijk maakt door de intensiteit van fluorescentie-gelabelde vruchteiwitten te meten.

Nadat de oplossingen en media volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, inoculeer je twee tot drie kolonies gistcellen in vijf milliliter YNB-medium, zonder aanvullende nutriënten om de plasmidselectie te handhaven. Kweek de culturen 16 tot 24 uur bij 30 graden Celsius onder schudcondities. Meet ongeveer drie uur voor de beeldvorming de OD 600 van elke overnight-cultuur.

Bereid vervolgens verdunningen van vijf milliliter voor bij een OD 600 van 0,35 tot 0,4 in YNB-medium, zonder aanvullende nutriënten voor plasmidenonderhoud, en kweek deze drie uur lang bij 30 graden Celsius onder schudcondities. Tijdens de incubatie wordt de environmental chamber van de microscopen of de verwarmde tafel voorverwarmd tot 30 graden Celsius. Nadat een behandelde acht-wells glazen pot en een chamber slide voor beeldvorming zijn voorbereid volgens het tekstprotocol, worden 200 microliters YNB-medium zonder aanvullende nutriënten voor plasmaselectie aan elke well toegevoegd.

Wanneer de culturen klaar zijn, brengt u één milliliter over naar een microcentrifugebuis en pellet u de cellen bij 8.000 RPM gedurende twee minuten. Verwijder vervolgens 975 microliter van het supernatant. Resuspendeer de celpellet in het resterende supernatant.

Breng vervolgens 2,5 µL van de celsuspensie aan in het midden van elke put van de plaat met acht putten. Pipetteer meerdere keren op en neer om de cellen te verspreiden en laat de cellen vijf tot 10 minuten bezinken. Plaats het chamber-preparaat op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is geëquilibreerd op 30 °C.

Gebruik vervolgens helderveldverlichting om een veld met cellen te lokaliseren. Voeg 50 µL voorverwarmd YNB-medium met een methionineconcentratie van 100 µg/mL toe aan de 200 µL medium in de put om een uiteindelijke methionineconcentratie van 20 µg/mL te verkrijgen. Laat de cellen twee minuten equilibreren voordat u begint met het maken van beelden.

Stel de microscoop vervolgens direct voor het beeldvormen in op het gewenste brandvlak. Neem gedurende 45 tot 60 minuten elke 5 minuten GFP-opnamen op in brightfield of DIC. Gebruik voor alle beelden binnen een tijdserie identieke acquisitieparameters.

Raadpleeg het tekstprotocol voor aanvullende details. Kwantificeer de fluorescentie-intensiteit van individuele cellen op elk tijdstip en druk de waarden uit als een percentage van de initiële intensiteit van de eerste afbeelding. Open na het exporteren van de afbeeldingen volgens het tekstprotocol in ImageJ de bestanden via het bestandsmenu met de optie Openen.

Gebruik de fluorescentieafbeelding voor kwantificering en de brightfield- of DIC-afbeelding als referentie om de locatie van de cellen te identificeren. Sluit dode cellen uit die donkerder lijken dan levende cellen bij DIC-observatie en autofluoresceren onder het GFP-kanaal. Kies bij afbeeldingen met een ongelijkmatige achtergrond in het Process-menu het algoritme voor achtergrondsubtractie en selecteer de standaardinstelling.

Zodra de beelden zijn verkregen, is het belangrijk om achtergrondsubtractie uit te voeren voordat men overgaat tot de kwantificatieprocedure. Deze stap is bijzonder belangrijk omdat het achtergrondsignaal anders verschillen tussen monsters zou kunnen maskeren of dempen. Omtrek een cel met behulp van de vrije selectietool, waarbij u ervoor zorgt dat de gehele cel wordt opgenomen en zo min mogelijk gebied buiten de cel.

Gebruik vervolgens onder het menu Analyze de functie set measurements om het oppervlak, de geïntegreerde densiteit en de gemiddelde grijswaarde te meten. Open de ROI Manager door op Analyze en vervolgens op Tools te klikken. Klik in het venster van de ROI Manager op de knop Add om het gemarkeerde gebied als een nieuwe ROI toe te voegen.

Herhaal het omlijnen en het vastleggen van de metingen voor de resterende cellen in de afbeelding, met uitzondering van dode cellen of cellen die de rand van de afbeelding raken. Sla de geselecteerde ROI's op als zip-bestand door op de meetknop te klikken, waardoor de gemeten waarden in een nieuw venster worden weergegeven. Klik vervolgens op de knop 'meer' en exporteer alle metingen naar een spreadsheet of statistische analysesoftware.

Inoculeer twee tot drie kolonies gistcellen in 0,5 milliliter YNB-medium, zonder extra voedingsstoffen voor het behoud van plasmidselectie. Kweek de cellen op een rotatietrommel bij 30 graden Celsius gedurende 16 tot 24 uur. Voeg één milliliter YNB-medium toe zonder extra voedingsstoffen voor plasmidonderhoud en kweek nog eens drie uur.

Breng vervolgens één milliliter cellen over naar elk van twee ronde bodembuisjes van vijf milliliter. Voeg daarna 0,25 milliliter YNB Met-medium toe aan het eerste buisje en 0,25 milliliter YNB-medium met 100 microgram per milliliter methionine aan het tweede buisje voor een eindconcentratie van 20 microgram per milliliter. Verspreid bij een groot aantal monsters de toevoeging van methionine om voldoende tijd te creëren voor de analyse van de feiten.

Onze flowcytometer kan tot 40 monsters per run meten. We voegen methionine in batches toe. Acht monsters elke vijf minuten.

Dit zorgt ervoor dat alle monsters tussen 45 en 50 minuten na de toevoeging van methionine worden gemeten. Incubeer de cellen gedurende 45 minuten. Analyseer vervolgens de cellen via flowcytometrie, waarbij forward scatter (FS) wordt gekozen als maat voor de celgrootte en een flowfluorescentie-intensiteit van een FITC-filter wordt gebruikt als maat voor de internalisering van de vracht.

Gebruik tijdens de incubatie van 45 minuten de schuifknoppen om de spanning van de FS- en FITC-kanalen aan te passen, zodat de detectie wordt geoptimaliseerd voor het groottebereik en de fluorescentie-intensiteit van de gebruikte gistcellen. Meet de FS en fluorescentie-intensiteit voor 10.000 cellen van elke conditie. Genereer met de instelling voor een hoge stroomsnelheid een scatterplot van FS tegenover de fluorescentie-intensiteit door op 'grafiek toevoegen' te klikken.

Select vervolgens FITC voor de x-as en FS voor de y-as en zet 1000 punten uit in de grafiek. Gebruik de gate-functie en de wildtype Met-conditie om een verticale gate in te stellen, zodanig dat ongeveer 5% van de helderste cellen rechts van de gate vallen. Gebruik deze gating voor alle andere condities in het experiment.

Zoals hier wordt getoond, werd time-lapse beeldvorming van cellen uitgevoerd met intervallen van vijf minuten in afwezigheid of aanwezigheid van methionine om de internalisering van GFP- of fluorine-getagd Mup1 en veranderingen in fluorescentie te monitoren. Zoals verwacht bleef GFP- en fluorine-getagd Mup1 bij afwezigheid van methionine aan het plasmamembraan. In contrast hiermee vertoonden cellen die in aanwezigheid van methionine werden afgebeeld een progressieve afname van het fluorescentiesignaal van het celoppervlak, wat consistent is met de internalisering van cargo.

De kinetiek van het fluorescentieverlies in aanwezigheid van methionine was echter vertraagd in de Mup1 GFP-cellen vergeleken met de pHlourin Mup1-cellen. Deze scatterplots vergelijken de fluorescentie-intensiteit van wild-type of vier delta ENTH1-cellen in aanwezigheid of afwezigheid van methionine na het toepassen van een verticale gate. 4% van de wild-type Met-cellen bevond zich aan de rechterkant van de gate, wat overeenkomt met de helderste cellen in de populatie, terwijl 65% van de onbehandelde wild-type cellen zich in de gate bevond.

In tegenstelling hiermee vertoonden de vier delta ENTH1-cellen geen verschil in de distributie van heldere versus zwakke cellen, wat consistent is met een defect in endocytose. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in drie tot vier uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de starttijden van gelijktijdige experimenten te spreiden, zodat de eindpuntgegevens voor alle monsters na dezelfde behandeltijd kunnen worden verzameld.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals florale genetische screens, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke nieuwe factoren bijdragen aan vesiculair transport. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van vesiculair transport om aspecten van endosoom-afbraak te onderzoeken, evenals een nieuw ontdekt clathrine-onafhankelijk en zuur pad in bud-gist. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe florent-type cargo's kunnen worden gebruikt om endocytische gebeurtenissen in levende cellen te kwantificeren.