Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

Het algemene doel van deze procedure is om vesiculaire verkeersstromen in de endocytische route van levende cellen te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van vesiculaire verkeersstromen, zoals hoe mutatie of veranderingen in eiwitexpressie de snelheid en efficiëntie van verkeersstromen beïnvloeden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het directe kwantificering van endocytische verkeersstromen en levende cellen mogelijk maakt door het meten van de intensiteit van fluorescent gelabelde ladingseiwitten.

Na het bereiden van oplossingen en media volgens het tekstprotocol, inoculeer twee tot drie kolonies gistcellen in vijf milliliter YNB-medium, zonder extra voedingsstoffen voor het onderhouden van plasmide selectie. Laat de culturen groeien op 30 graden Celsius met schudden gedurende 16 tot 24 uur. Ongeveer drie uur voorafgaand aan beeldvorming, meet de OD 600 van elke overnachtcultuur.

Bereid vervolgens vijf milliliter verdunning bij een OD 600 van 0,35 tot 0,4 in YNB-medium, zonder extra voedingsstoffen voor plasmide onderhoud en laat het groeien op 30 graden Celsius met schudden gedurende drie uur. Tijdens de incubatie, voorverwarm de omgevingskamer of verwarmde stage van de microscoop tot 30 graden Celsius. Na het bereiden van een glas pot met acht putjes en kamerglijmiddel voor beeldvorming volgens het tekstprotocol, voeg 200 microliters YNB-medium toe zonder extra voedingsstoffen voor plasmaselectie in elke put.

Wanneer de culturen klaar zijn, breng een milliliter over naar een microfridgebuis en pellet de cellen bij 8.000 RPM gedurende twee minuten. Verwijder vervolgens 975 microliters van het supernatant. Resuspendeer het cellenpellet in het resterende supernatant.

Laat vervolgens 2,5 microliters van de celsuspensie vallen in het midden van elke put van de acht-puttenplaat. Pipet op en neer om de cellen te verspreiden en laat de cellen gedurende vijf tot 10 minuten bezinken. Plaats het kamerglijk op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop geëquilibreerd op 30 graden Celsius.

Gebruik vervolgens helder veldverlichting om een veld cellen te lokaliseren. Voeg 50 microliters voorverwarmd YNB-medium toe met 100 microgram per milliliter methionine aan de 200 microliters medium in de put om een ​​uiteindelijke methionineconcentratie van 20 microgram per milliliter te verkrijgen. Laat de cellen twee minuten gelijkwaardig worden voordat u begint met beeldvorming.

Pas onmiddellijk voorafgaand aan de beeldvorming de microscoop aan op het gewenste brandpunt. Verwerf GFP in helder veld of DIC-beelden met tussenpozen van 5 minuten gedurende 45 tot 60 minuten. Gebruik identieke acquisitieparameters voor alle afbeeldingen binnen een tijdsreeks.

Raadpleeg het tekstprotocol voor aanvullende details. Kwantificeer de fluorescentie-intensiteit van individuele cellen op elk tijdstip en drukt waarden uit als een percentage van de initiële intensiteit van de eerste afbeelding. Na het exporteren van afbeeldingen volgens het tekstprotocol in image j, open de bestanden in het bestandsmenu met behulp van de optie Openen.

Gebruik de fluorescentie-afbeelding voor kwantificering en de helder veld- of DIC-afbeelding als referentie om de locatie van cellen te identificeren. Sluit dode cellen uit die aanwezig zijn, die donkerder lijken dan levende cellen wanneer bekeken door DIC en autofluoresceren onder het GFP-kanaal. Voor afbeeldingen met een ongelijkmatige achtergrond in het Procesmenu, kies de achtergrondsubtraheeralgoritme en kies de standaardinstelling.

Zodra afbeeldingen zijn verkregen, is het belangrijk om achtergrondsubtractie uit te voeren voordat u doorgaat met de kwantificeringsprocedure. Deze stap is bijzonder belangrijk omdat achtergrondsignaal anders verschillen tussen monsters kan maskeren of dempen. Gebruik het freehand selectiegereedschap om een cel te omlijnen, zorg ervoor dat u de hele cel opneemt, maar zo min mogelijk gebied buiten de cel.

Vervolgens gebruikt u onder het Analysemenu de set metingsfunctie om het gebied, de geïntegreerde dichtheid en de gemiddelde grijze waarde te meten. Open de ROI Manager door op Analyse te klikken, vervolgens op Gereedschappen. In het ROI Manager-venster, klikt u op de knop Toevoegen om de gemarkeerde regio als een nieuwe ROI in te voeren.

Herhaal het omlijnen en meten voor de resterende cellen in de afbeelding, met uitzondering van dode cellen of cellen die de rand van de afbeelding raken. Sla de geselecteerde ROI's op als zip-bestand door op de meetknop te klikken die de gemeten waarden in een nieuw venster weergeeft. Klik vervolgens op de knop Meer en exporteer alle metingen naar een spreadsheet of statistische analysesoftware.

Inoculeer twee tot drie kolonies gistcellen en 0,5 milliliters YNB-medium, zonder extra voedingsstoffen voor het onderhouden van plasmide selectie. Laat cellen groeien op een roltrommel bij 30 graden Celsius gedurende 16 tot 24 uur. Voeg een milliliter YNB-medium toe zonder extra voedingsstoffen voor plasmide onderhoud en laat het groeien voor een extra drie uur.

Breng vervolgens een milliliter cellen over naar elk van de twee vijf-milliliter ronde bodembuizen. Voeg vervolgens 0,25 milliliters YNB Met-medium toe aan de eerste buis en 0,25 milliliters YNB-medium met 100 microgram per milliliter methionine aan de tweede buis voor een uiteindelijke concentratie van 20 microgram per milliliter. Voor een groot aantal monsters, schakel de toevoeging van methionine om tijd te maken voor feitenanalyse.

Onze flowcytometer kan maximaal 40 monsters per run meten. We voegen methionine toe in batches. Acht monsters elke vijf minuten.

Dit zorgt ervoor dat alle monsters worden gemeten tussen 45 en 50 minuten na toevoeging van methionine. Incubeer de cellen gedurende 45 minuten. Analyseer vervolgens de cellen door middel van flowcytometrie, selecteer voorwaartse verstrooiing of FS als maatstaf voor celgrootte en kaart een stromende fluorescentie-intensiteit van een FITC-filter als maatstaf voor ladinginternalisatie.