Name: Een polyaniline gebaseerde sensor van nucleïnezuren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T10:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Ontdek een kosteneffectieve methode voor labelvrije detectie van nucleïnezuren met polyaniline. Deze techniek detecteert RNA en DNA zonder enzymatische manipulatie en onderscheidt enkelvoudige nucleotideverschillen voor diagnostische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben niets te onthullen.

1. verwerkbaar PANI Synthesis <ol><li> Oplossen aniline (1 ml, 11 mmol) volledig in 60 ml chloroform in een 250 ml rondbodemkolf. Roeren bij 600 rpm gedurende 5 minuten en koel af tot 0-5 ° C met ijs. Dit duurt meestal 15-20 min (Figuur 2A). </li><li> Voeg natriumdodecylbenzeensulfonaat (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) aan de aniline oplossing in een rondbodemkolf onder roeren bij 600 rpm. </li><li> Ontbinden ammoniumpersulfaat (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) in 20 ml water en voeg dit alles druppelsgewijs gedurende 30 min om te voorkomen dat oververhitting van de reactie. </li><li> Het uitvoeren van de reactie bij 0-5 ° C gedurende 24 uur, en laat het op kamertemperatuur komen voor nog eens 24 uur. </li><li> Observeer het reactiemengsel aanvankelijk melkwit worden na 15 min, vervolgens donkerbruin na 2 uur, en uiteindelijk tot donkergroen na 24 uur (Figuur 2B-F). </li><li> Filter de PANI-NaDBS oplossing met een Buchner trechter. Meng met 80 ml chloroform en 120 ml water in alseparation trechter (figuur 2G). </li><li> Incubeer de oplossing gedurende 24 uur bij kamertemperatuur en laat het donkergroene PANI de scheitrechter, waardoor ongereageerd NaDBS en APS in het waterige supernatant. </li></ol> 2. PANI-probe Mengen en UV-straling <ol><li> PANI verdunde oplossing 10x met chloroform-water (1: 3 v / v) en meng 200 pl verdund PANI met 6,4 pmol probe-DNA-oligonucleotiden door zachte schommelen gedurende 15 min in een microfugebuis. </li><li> Bestraal het PANI-DNA-oplossing met 1200 uJ / cm2 UV in een crosslinker gedurende 2 min. Het is essentieel dat UV-blootstelling is beperkt tot de aangegeven hoeveelheid. Langdurige blootstelling aan UV compromissen de fluorescentieverandering van PANI waarschijnlijk door covalente verknoping van PANI en DNA. </li><li> Pellet complexen door centrifugatie bij 17.000 xg gedurende 6 min, en wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Pellet opnieuw, en opnieuw te schorten in PBS. </li></ol> 3. Hybridization van PANI-probe <ol><li> Voeg 8 pi van 100 pM complementaire DNA-oligonucleotiden of doelnucleïnezuren aan 200 gl PANI-probe-complexen. </li><li> Uitvoeren hybridisatie door tuimelen oplossing mengsel gedurende 15 minuten bij 40 ° C. </li><li> Pellet de PANI complexen door centrifugatie bij 17.000 xg gedurende 6 min. Was met PBS en resuspendeer in water. </li></ol> 4. Emissie Steady State Fluorescence Measurement <ol><li> Voeg PANI van verschillende behandelingen in een 96 well microplaat en meet emissie fluorescentie in het 270-850 nm door excitatie bij 250 nm. Een emissie piek voor PANI moet worden opgemerkt ongeveer 500 nm. </li></ol> 5. fluorescentiemicroscopie Meting gehybridiseerde Duplex <ol><li> Drop laag PANI op een borosilicaat glazen dekglaasje en droog bij 40 ° C gedurende 48 uur. </li><li> Sonde (8 pi van 100 pM) toe te voegen op een gedroogde PANI film en bestralen met UV-licht (1200 uJ / cm2 </sup&gt;) gedurende 2 min. </li><li> Was de PANI-probe film met PBS en droog bij 40 ° C gedurende 48 uur. </li><li> Voeren hybridisatie gedurende 15 minuten door toevoeging van doelnucleïnezuren. Dit kan een biologisch monster of controle beoogd oligonucleotide (8 ui 100 uM) zijn. Volg met een PBS wassen. </li><li> Het verkrijgen van de fluorescerende beelden met 40x vergroting, met een 500 nm lange pass filter. </li></ol>

<ol><li>Hahm, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+polymers+in+protein+detection+platforms%3A+optical%2C+electrochemical%2C+electrical%2C+mass-sensitive%2C+and+magnetic+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors.</a> Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).</li>
<li>Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+DNA+hybridization+sensors+based+on+conducting+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers.</a> Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).</li>
<li>Sengupta, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Intrinsic+Properties+of+Polyaniline+to+Detect+Nucleic+Acid+Hybridization+through+UV-Enhanced+Electrostatic+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction.</a> Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).</li>
<li>Song, E., Choi, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conducting+Polyaniline+Nanowire+and+Its+Applications+in+Chemiresistive+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing.</a> Nanomaterials. 3 (3), 498(2013).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyaniline+nanofibres+for+fluorescent+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection.</a> Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).</li>
<li>Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+of+DNA+Immobilized+onto+a+Highly+Oriented+Pyrolytic+Graphite+Electrode+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface.</a> Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28m-Phenylenediamine%29+Nanospheres+and+Nanorods%3A+Selective+Synthesis+and+Their+Application+for+Multiplex+Nucleic+Acid+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection.</a> PLoS ONE. 6 (6), e20569(2011).</li>
<li>Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-chemical+structure+of+polyaniline+synthesized+by+self-stabilized+dispersion+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Res%22%5BJournal%5D)">Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization.</a> Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).</li>
<li>John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+solution+processable+conducting+polyaniline+by+inverted+emulsion+polymerization+using+didecyl+ester+of+4-sulfophthalic+acid+as+multifunctional+dopant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Polym+Sci+A%3A+Polym+Chem%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant.</a> J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).</li>
<li>El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+polyaniline+nanostructures+in+micellar+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions.</a> J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).</li>
<li>Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Investigations+of+Polyaniline+Prepared+in+the+Presence+of+Dodecylbenzenesulfonic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Therm+Anal+Calorim%22%5BJournal%5D)">Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid.</a> J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).</li>
<li>Jia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyaniline-DBSA%2Forganophilic+clay+nanocomposites%3A+synthesis+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+Met%22%5BJournal%5D)">Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization.</a> Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).</li>
<li>Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Polyaniline+Nanoparticles+in+Micellar+Solutions+as+Polymerization+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium.</a> Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).</li>
<li>Scales, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corona-Stabilized+Interpolyelectrolyte+Complexes+of+siRNA+with+Nonimmunogenic%2C+Hydrophilic%2FCationic+Block+Copolymers+Prepared+by+Aqueous+RAFT+Polymerization%E2%80%A0%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†.</a> Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).</li>
<li>Kadashchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+trions+in+conjugated+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+B%22%5BJournal%5D)">Localized trions in conjugated polymers.</a> Phys Rev B. 76 (23), 235205(2007).</li>
<li>Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+DNA+Biosensor+Based+on+Conducting+Polyaniline+nanotube+Array%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array.</a> Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).</li>
<li>Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemically+fabricated+polyaniline+nanowire-modified+electrode+for+voltammetric+detection+of+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Eletrochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization.</a> Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).</li>
</ol>

Het werk werd ondersteund door de University of Southern Mississippi College of Science and Technology en Mississippi College of Science and Technology en het Mississippi INBRE-programma (Award Nummer P204M103476 van het National Institute of General Medical Science).

Een PANI-gebaseerde sensor van nucleïnezuren vereist solubilisatie van het polymeer in water om te interageren met DNA en RNA. De dispersie van PANI in water wordt uitgevoerd onder toepassing van surfactanten micellen vormen zoals eerder gemeld 8. Naast de hier gebruikte NaDBS andere anionogene oppervlakteactieve stoffen als dodecyl ester van 4-sulfoftaalzuur, kunnen ionische surfactanten zoals nonylfenolethoxylaat of kationische surfactanten zoals cetyltrimethylammoniumbromide ook worden gebruikt voor de syn...

Geconjugeerde polymeren bieden veel opties voor moleculaire sensoren. Dit omvat fluorescentie, elektronische en colorimetrische reacties1. Er zijn veel inspanningen geweest om geconjugeerde polymeren in nucleïnezuursensoren te integreren. De meeste systemen vereisen echter secundaire detectie, wat de sensoropties beperkt2. Onlangs rapporteerden we een op geconjugeerde polymeren gebaseerde sensorplatform gebouwd op polyaniline (PANI) dat de eigenschappen van dit polymeer benut en een label-vrij systeem creëert3. PANI is een uitgebreid geconjugeerd elektro-actief polymeer met eigenschappen zoals fluorescentie en weerstand die geschikt zijn voor het meten van biologische systemen4. De excitonen binnen de structuur zijn niet gelokaliseerd, wat leidt tot mobiliteit van de positieve lading tussen monomere subeenheden. Dit biedt een flexibel skelet van positieve ladingen die kunnen interageren met de negatief geladen ruggengraat van DNA5,6. Belangrijk is dat elektrostatisch gehechte DNA zo is georiënteerd dat stikstofbasen kunnen deelnemen aan basenparing. Associatie met DNA verandert de elektronische eigenschappen van PANI, een effect dat kan worden versterkt door UV-bestraling (Figuur 1)3. Met behulp van dit systeem kunnen oligonucleotiden die complementair zijn aan doelnucleïnezuren worden geïmmobiliseerd op PANI. Meerdere studies hebben aangetoond dat bij hybridisatie elektrostatisch geadsorbeerde oligonucleotiden zich dissociëren van PANI of andere kationische matrices als gevolg van conformationele veranderingen veroorzaakt door de overgang naar een dubbelstrengs DNA-structuur3,5,7.
In een sensorsysteem waarbij sondevestiging geconjugeerde polymeereigenschappen moduleert, kunnen hybridisatie-evenementen worden omgezet zonder labels of enzymatische modificatie van sondes of doelnucleïnezuren. Geconjugeerde polymeren bieden grote flexibiliteit in detectiemethoden, waaronder fluorescentie. Door PANI-fluorescentie te monitoren, kunnen concentraties van doelnucleïnezuren zo laag als 10-11 M (10 pM) worden gedetecteerd3. De detectie is snel, binnen 15 minuten na hybridisatie, en specifiek waarbij een enkele mismatch in een doelmolecuul kan worden gedifferentieerd3.
Fabricage van PANI-sensoren is eenvoudig. Hoog moleculair gewicht PANI kan worden gegenereerd dat goed gedispergeerd is in water met behulp van standaard syntheseprocedures die anilinemonomeer, oppervlakteactieve stof en gecontroleerde toevoeging van een oxidator omvatten. Het rendement kan erg hoog zijn en ongereacteerde oxidator kan worden verwijderd door te wassen met water, waardoor geen verdere PANI-groei plaatsvindt. PANI-probe associatie vindt spontaan plaats bij menging, en complexvorming wordt verbeterd door milde UV-blootstelling. Hybridisatie kan onmiddellijk worden uitgevoerd en de veranderingen in PANI-fluorescentie worden geanalyseerd na een korte incubatie. De eenvoud van deze technologie maakt het zeer toegankelijk voor veel laboratoria.

<table><tbody><tr><td>Aniline&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A7401-500&nbsp;</td><td>ACS, liquid, gekoeld</td></tr><tr><td>Ammonium peroxydisulfaat</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A682-500&nbsp;</td><td>ACS, kristallijn</td></tr><tr><td>Natriumdodecylbenzeensulfonaat</td><td>Pfaltz & Bauer&nbsp;</td><td>D56340&nbsp;</td><td>95% vast</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>MCX 10601&nbsp;</td><td>Vloeibaar</td></tr><tr><td>DNA-primers</td><td>MWG operon</td><td>n/a</td><td>aangepaste DNA-sequentie ~20&nbsp;bps</td></tr><tr><td>Microplaat&nbsp;</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1402-9800&nbsp;</td><td>96 wellen, polypropyleen omdat het niet reageert op chloroform</td></tr><tr><td>Microplaat Adhesive Film</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>2920-0000&nbsp;</td><td>Vermindert verontreiniging van put tot put, monsterlekkage en verdamping</td></tr><tr><td>Microscoopdekglas</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-544-D&nbsp;</td><td>PANI-gecoat op UV-bestraald dekglas</td></tr><tr><td>UV-crosslinker&nbsp;</td><td>UVP&nbsp;</td><td>HL-2000&nbsp;</td><td>Energie: X100 &mu;J/cm2; Tijd: 2 min</td></tr><tr><td>Hybridisatieoven</td><td>VWR</td><td>01014705 T</td><td>Temperatuur: 400&nbsp;&#176;C; met schommelen gedurende 15 min</td></tr><tr><td>Glasapparatuur&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Driehalsige ronde bodemfles voor reactie; druppeltrechter, stoppen, condensor, scheidingslepel</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>Leica IMC S80</td><td>Vergroting 20X; Pseudokleur 536 nm; Blootstelling 86 msec; Versterking 1,0x; Gamma 1,6</td></tr><tr><td>Microplaatlezer</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>89429-536</td><td></td></tr></tbody></table>

een polyaniline gebaseerde sensor van nucleïnezuren

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

De detectie van nucleïnezuren staat centraal in diagnostische technologieën die worden gebruikt in onderzoek en de kliniek. Standaard benaderingen die in deze technologieën worden gebruikt, zijn gebaseerd op enzymatische modificatie die vooringenomenheid en artefacten kunnen introduceren. Een cruciaal element van detectieplatforms van de volgende generatie zal directe moleculaire detectie zijn, waardoor een behoefte aan amplificatie of labels wordt vermeden. Geavanceerde nanomaterialen kunnen de geschikte chemische modaliteiten bieden om labelvrije sensoren te realiseren. Geconjugeerde polymeren zijn ideaal voor biologische detectie, bezitten eigenschappen die compatibel zijn met biomoleculen en vertonen een hoge gevoeligheid voor gelokaliseerde veranderingen in de omgeving. In dit artikel wordt een methode gepresenteerd voor het detecteren van nucleïnezuren met behulp van het elektrogeleidende polymeer polyaniline. Eenvoudige DNA 'probe' oligonucleotiden die complementair zijn aan doelnucleïnezuren worden elektrostatisch aan het polymeer bevestigd, waardoor een sensorsysteem ontstaat dat enkele nucleotidenverschillen in doelmoleculen kan onderscheiden. Buiten de specifieke en onbevooroordeelde aard van deze technologie is deze zeer kosteneffectief.

Figuur 2A vangt de reactie opstart bij aanvang van de polymerisatie, dat wil zeggen, voor APS toevoeging. Micelvorming is de eerste stap in het reactieproces PANI-synthese optreedt bij micellaire interface. Figuur 2B toont een melkachtige oplossing na 5 min. 30 min na APS toegevoegd het reactiemengsel wordt een licht bruine kleur. Figuur 2C toont de kleurverandering geassocieerd met de vorming van oligomeren. Figuur 2D</...

Nucleinzuren zijn gebruikelijke analyten voor het beoordelen van biologische systemen; echter kan vooringenomenheid door enzymatische manipulatie zorgwekkend zijn. Hier wordt een methode beschreven voor label-vrije detectie van nucleic zuren met behulp van polyaniline. Deze gevoelige, kosteneffectieve sensortechnologie kan enkelvoudige nucleotidenverschillen tussen moleculen onderscheiden.

Een polyaniline gebaseerde sensor van nucleïnezuren

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Het algemene doel van deze procedure is het synthetiseren van in water gedispergeerd polyaniline dat gebruikt kan worden voor de labelvrije detectie van nucleïnezuren. Deze techniek is een kosteneffectieve methode voor het detecteren van nucleïnezuren. Laboratoria die deze methode toepassen, zullen merken dat deze eenvoudig, robuust en gevoelig is.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze labelvrij is en direct kan worden gebruikt voor het detecteren van RNA's en DNA's zonder dat enzymatische manipulatie nodig is. Deze techniek heeft potentieel voor nieuwe diagnostische technologieën en aangezien er geen label wordt gebruikt, kan deze worden toegepast voor het verwerken van patiëntenmonsters met minimale manipulatie. Een visuele demonstratie zal helpen om de werking van de sensor te verduidelijken.Dit platform omvat polymeerwetenschap en biologie, wat zeer exotisch lijkt maar in feite buitengewoon eenvoudig te implementeren is. Los aniline volledig op in 60 ml chloroform in een ronde bodemkolf van 250 ml. Na vijf minuten roeren bij 600 RPM, koelen met ijs tot nul tot vijf graden Celsius.Dit duurt gewoonlijk 15 tot 20 minuten. Voeg vervolgens natriumdodecylbenzeensulfonaat toe aan de aniline-oplossing in een rondbodemkolf onder roering bij 600 RPM. Los ammoniumpersulfaat op in 20 ml water en voeg dit gedurende 30 minuten druppelsgewijs toe om oververhitting van de reactie te voorkomen.Voer de reactie 24 uur lang uit bij nul tot vijf graden Celsius. Observeer dat het reactiemengsel na 15 minuten aanvankelijk melkwit wordt, na twee uur donkerbruin en uiteindelijk na 24 uur donkergroen. Laat het mengsel vervolgens gedurende nog eens 24 uur op kamertemperatuur komen.Filter de PANI-natriumdodecylbenzeensulfonaatoplossing met een Büchnertrechter. Meng het filtraat met 80 ml chloroform en 120 ml water in een scheidtrechter. Incubeer de oplossing 24 uur bij kamertemperatuur en verzamel vervolgens de donkergroene PANI uit de scheidtrechter, waarbij het ongereageerde natriumdodecylbenzeensulfonaat en APS in de waterige supernatant achterblijven.Verdun de PANI-oplossing 10 X met chloroformwater en meng vervolgens 200 µL van de verdunde PANI met 6,4 µmol probe DNA-oligonucleotiden door 15 minuten zachtjes te schudden in een microcentrifugebuisje. Bestraal de PANI DNA-oplossing gedurende twee minuten met 1200 µJ/cm² UV-licht in een crosslinker. Het is essentieel dat de UV-blootstelling beperkt blijft tot de aangegeven hoeveelheid.Langdurige blootstelling aan UV tast de fluorescentieverandering in PANI aan, waarschijnlijk door covalente cross-leaking van PANI en DNA. Pelleteer de complexen door centrifugatie bij 17, 000 x g gedurende zes minuten en was met phosphate buffered saline of PBS. Na een tweede pelletstap wordt het geheel opnieuw gesuspendeerd in PBS.Voeg 8 µL complementair DNA-oligonucleotiden of doelnucleïnezuren van 100 µM toe aan 200 µL PANI-sondecomplexen. Voer de hybridisatie uit door het oplossingsmengsel 15 minuten lang te schudden bij 40 °C. Nadat de PANI-complexen zijn gepelletteerd door centrifugatie bij 17.000 x g gedurende zes minuten, worden ze gewassen met PBS en opnieuw gesuspendeerd in water.Voeg PANI van verschillende behandelingen toe aan een 96-well microplaat en meet de emissiefluorescentie in het bereik van 270 tot 850 nanometer door excitatie bij 250 nanometers. Voor PANI moet een emissiepiek worden waargenomen rond de 500 nanometers. Om fluorescentiemicroscopie-metingen van de gehybridiseerde duplex uit te voeren, wordt PANI via drop-coating op een borosilicaatglazen dekglasje aangebracht en 48 uur gedroogd bij 40 graden Celsius.Voeg acht µL van 100 µM probe toe aan een gedroogde PANI-film en bestraal deze vervolgens twee minuten met UV-licht. Was na de bestraling de PANI-probefilm met PBS en droog deze 48 uur bij 40 °C. Voer de hybridisatie 15 minuten lang uit door de doelnucleïnezuren toe te voegen.Dit kan een biologisch monster zijn of een gecontroleerd doel-oligonucleotide. Volg dit met een PBS-wasbeurt. Neem de fluorescentiebeelden op bij een 40 x vergroting met een longpassfilter van 500 nanometer.Hier wordt de elektrostatische interactie van PANI en DNA-probes getoond, versterkt door UV-bestraling. Hybridisatie van het doelnucleïnezuur triggert de vorming van een duplex, waardoor de structurele conformatie verandert, wat resulteert in dissociatie van het probe-doelcomplex van het PANI-oppervlak. Deze figuur laat de verandering in PANI-fluorescentie zien in afwezigheid of aanwezigheid van de probe, zowel in oplossing als in een vast coatingsmedium.De toename in fluorescentie is het gevolg van elektronenstroom vanuit negatief geladen DNA, waardoor de elektronendichtheid van het polymeer toeneemt. Bij hybridisatie van complementaire doel-oligonucleotiden laten de probes los, wat leidt tot het herstel van de basisfluorescentie. Omgekeerd resulteert hybridisatie met enkele mismatchte doel-oligonucleotiden niet in dit herstel van de basisfluorescentie.De belangrijkste nieuwheid van deze techniek is dat er milde UV-straling wordt gebruikt voor een exacte interactie, wat helpt om onderscheid te maken tussen aspecifieke en lichtgeïnduceerde interacties. Eenmaal beheerst, kan deze techniek tot twee uur in beslag nemen, exclusief de incubatietijd en de droogtijd van de coatings. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat DNA oplost in water en dat de zure oplossing de elektronische eigenschap van PANI daadwerkelijk verandert.Na het bekijken van deze video zouden kijkers een goed begrip moeten hebben van hoe watergedispergeerde polyaniline te synthetiseren en hoe de fluorescentie-eigenschappen ervan kunnen worden gebruikt om nucleïnezuren te detecteren. Ze zullen in staat zijn om probe-DNA's te immobiliseren en hybridisatie uit te voeren om targets te detecteren. Bij het werken met het monomeer is het belangrijk om te onthouden dat deze synthese gevaarlijk is en in een zuurkast moet worden uitgevoerd met beschermingsmiddelen zoals een veiligheidsbril, handschoenen en laboratoriumjassen.

a-polyaniline-based-sensor-of-nucleic-acids

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

"E-DNA" sensoren, reagentless hebben elektrochemische biosensoren die goed presteren, zelfs wanneer direct uitgedaagd in het bloed en andere complexe matrices, aangepast aan de detectie van een breed scala van nucleïnezuur, eiwitten en kleine moleculen analyten. Hier presenteren we een algemene procedure voor de fabricage en het gebruik van dergelijke sensoren.

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

This video demonstrates a conductimetric biosensor assay to study the interaction of an antibody with a target antigen immobilized on a transducer chip. The biosensor is engineered to have a bifunctional chimeric protein — a β-lactamase enzyme with a functional catalytic site fused to a nanobody for binding to the immobilized target antigen. Upon binding, the catalytic hydrolysis of an antibiotic substrate by the β-lactamase enzyme generates an electrical signal — confirming the...

&beta;-Lactamase-Based Conductimetric Biosensor Assay for Protein-Protein Interactions

De synthese van asymmetrische soorten ferroceen is uitdagend met behulp van oplossingstechnieken. Dit rapport richt zich op de methoden die zijn uitgevoerd om een ferroceen-biotine bioconjugaat te produceren met behulp van eenvoudige en schone reacties die zijn uitgevoerd via vaste-fase synthese. Het is aangetoond dat de incorporatie van een thiolatgroep het vermogen geeft om te immobiliseren op goudoppervlakken.

Synthetische Methodologie voor Asymmetric Ferroceen Afgeleid Bio-conjugaat Systems via Solid Phase Resin-gebaseerde Methodologie

We beschrijven de belangrijkste stappen voor biosensing door gebruik te maken van polysilicon nanowire field-effect transistors, inclusief de voorbereiding van het apparaat en de immobilisatie en bevestiging van een DNA moleculaire sonde op het nanowire oppervlak, evenals de voorwaarden voor DNA sensing.

Bereiding van silicium Nanowire veldeffecttransistor voor chemische en biosensoren toepassingen

We presenteren een protocol voor het ontwerpen van de coronafase van nabij-infrarood fluorescente enkelwandige koolstofnanobuizen (SWNT's) met behulp van amfifiele polymeren en DNA om sensoren te ontwikkelen voor moleculaire doelen zonder bekende herkenningselementen.

Engineering Moleculaire herkenning met Bio-mimetische Polymers op enkelwandige koolstof nanobuisjes

In dit werk rapporteren we een nieuwe methode om te studeren met behulp van een conductimetric biosensor gebaseerd op de technologie van de β-lactamase hybride eiwit-eiwitinteractie. Deze methode is gebaseerd op de release van protonen op hydrolyse van β-lactamen.

Het gebruik van een β-lactamase gebaseerde Conductimetric Biosensor Assay voor het detecteren van biomoleculaire interacties

Een protocol voor de ontwikkeling van een elektrochemische DNA biosensor bestaat uit een polylactic acid-gestabiliseerde, gouden nanodeeltjes gemodificeerde, gezeefdrukt koolstof elektrode voor het detecteren van Vibrio parahaemolyticus wordt gepresenteerd.

Ontwikkeling van een elektrochemische DNA Biosensor te detecteren een Foodborne Pathogen

Dit protocol beschrijft de fabricage van een kleine, kant-en-klare cassette die kan worden toegepast voor visuele detectie van meerdere nucleic zuren in een enkele, test die is eenvoudig te bedienen. In deze benadering werd een capillaire matrix gebruikt voor multiplex en zeer efficiënte opsporing van GGO-doelstellingen.

Visuele detectie van meerdere Nucleic Acids in een capillaire matrix

Wij rapporteren hier, het protocol voor de fabricage van een Nafion-coating, polyaniline-matiemaatschappij, elektrochemisch verminderde grafeen oxide chemiresistive micro pH sensor. Deze chemiresistor gebaseerde, solid-state micro pH sensor kan detecteren pH veranderingen in real-time tijdens een fermentatieproces Lactococcus lactis .

Productie van een Nafion-coating, verminderd grafeen Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor op een pH van de Monitor in Real-time tijdens microbiële gisting

Hier beschrijven we een protocol om discrete en nauwkeurige anorganische nanostructuren op substraten te maken met behulp van DNA-origami vormen als leidende templates. De methode wordt aangetoond door het creëren van plasmonic gouden bowtie-vormige antennes op een transparante ondergrond (Sapphire).

DNA origami-gemedieerde substraat nano-Atterning van anorganische structuren voor sensing toepassingen

De op DNAzyme gebaseerde nanomachines kunnen worden gebruikt voor zeer selectieve en gevoelige detectie van nucleïnezuren. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het ontwerp van op DNA gebaseerde nanomachines met een 10-23-kern met behulp van gratis software en hun toepassing bij de detectie van een Epstein-Barr-virusfragment als voorbeeld.

DNAzyme 10-23 - Op basis van nanomachines voor nucleïnezuurherkenning

Ontdek een kosteneffectieve methode voor labelvrije detectie van nucleïnezuren met polyaniline. Deze techniek detecteert RNA en DNA zonder enzymatische manipulatie en onderscheidt enkelvoudige nucleotideverschillen voor diagnostische toepassingen.

Een polyaniline gebaseerde sensor van nucleïnezuren

Meer video's verkennen