Een polyaniline gebaseerde sensor van nucleïnezuren

Het algemene doel van deze procedure is om watergedispergeerd polyaniline te synthetiseren dat kan worden gebruikt om nucleïnezuren op een label-vrije manier te detecteren. Deze techniek is een kosteneffectieve methode voor het detecteren van nucleïnezuren. Labs die het toepassen, zullen het eenvoudig, robuust en gevoelig vinden.

Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat het label-vrij is en kan worden gebruikt om RNA's en DNA's direct te detecteren zonder dat enzymatische manipulatie nodig is. Deze techniek heeft potentieel voor nieuwe diagnostische technologieën en aangezien het geen label gebruikt, kan het worden gebruikt voor het verwerken van monsters van patiënten met weinig manipulatie. Visuele demonstratie zal helpen om de sensor te onthullen.

Dit platform omvat polymeerwetenschap en biologie, die erg exotisch lijken, maar in feite buitengewoon eenvoudig te implementeren zijn. Los aniline volledig op in 60 ml chloroform in een ronde bodemfles van 250 ml. Roer gedurende vijf minuten met 600 RPM en koel vervolgens af tot nul tot vijf graden Celsius met ijs.

Dit duurt meestal 15 tot 20 minuten. Voeg vervolgens natriumdodecylbenzeensulfonaat toe aan de aniline-oplossing in een ronde bodemfles terwijl u roert met 600 RPM. Los ammoniumpersulfaat op in 20 ml water en voeg het druppelsgewijs toe over 30 minuten om oververhitting van de reactie te voorkomen.

Voer de reactie gedurende 24 uur uit bij nul tot vijf graden Celsius. Observeer dat het reactiemengsel aanvankelijk na 15 minuten melkachtig wit wordt, dan donkerbruin na twee uur en uiteindelijk donkergroen na 24 uur. Laat het vervolgens nog eens 24 uur op kamertemperatuur komen.

Filter de PANI-natriumdodecylbenzeensulfonaat-oplossing met een Büchner-trechter. Meng het filtraat met 80 ml chloroform en 120 ml water in een afscheidingsfles. Incubeer de oplossing gedurende 24 uur bij kamertemperatuur en verzamel vervolgens het donkergroene PANI uit de afscheidingsfles, waarbij ongereageerd natriumdodecylbenzeensulfonaat en APS in de aqueuze supernatant achterblijven.

Verdun PANI-oplossing 10 keer met chloroformwater en meng vervolgens 200 microliters verdunde PANI met 6,4 micromolen sonde DNA-oligonucleotiden door 15 minuten zachtjes te schudden in een microcentrifugebuis. Bestraal de PANI DNA-oplossing met 1200 microjoules per vierkante centimeter UV in een crosslinker gedurende twee minuten. Het is van cruciaal belang dat de blootstelling aan UV beperkt blijft tot het aangegeven bedrag.

Langdurige blootstelling aan UV brengt de fluorescentie verandering in PANI in gevaar, waarschijnlijk als gevolg van covalente cross-lekkage van PANI en DNA. Bepaal complexen door centrifugatie bij 17.000 x g gedurende zes minuten en was met fosfaat gebufferd zout of PBS. Na het bepalen van een tweede keer, resuspendeer in PBS.

Voeg acht microliters van 100 micromoler complementair DNA-oligonucleotiden of doelnucleïnezuren toe aan 200 microliters van PANI sondecomplexen. Voer hybridisatie uit door de oplossingsmix gedurende 15 minuten op 40 graden Celsius te schudden. Na het bepalen van de PANI complexen door centrifugatie bij 17.000 x g gedurende zes minuten, was met PBS en resuspendeer in water.

Voeg PANI van verschillende behandelingen toe aan een 96-wells microplaat en meet emissiefluorescentie in het bereik van 270 tot 850 nanometer door te exciteren bij 250 nanometer. Er moet een emissiepiek voor PANI worden waargenomen rond de 500 nanometer. Om fluorescentiemicroscopie meting van het hyberdized duplex uit te voeren, draagt u PANI op een borosilicaat glasdeksel en droogt u het gedurende 48 uur bij 40 graden Celsius.

Voeg acht microliters van 100 micromoler sonde toe op een gedroogd PANI-film en bestraal het vervolgens met UV-licht gedurende twee minuten. Na de bestraling, was de PANI sonde film met PBS en droog het gedurende 48 uur bij 40 graden Celsius. Voer hybridisatie gedurende 15 minuten uit door doelnucleïnezuren toe te voegen.

Dit kan een biologisch monster of een gecontroleerd doel oligonucleotide zijn. Volg met een PBS-was. Verkrijg de fluorescente beelden bij 40 x vergroting met een 500 nanometer lang passeerfilter.

Hier getoond is de elektrostatische interactie van PANI en DNA sondes verbeterd door UV-bestraling. Hybridisatie van de doel nucleïnezuur triggert dubbele vorming, verandering van structurele bevestiging, wat resulteert in dissociatie van de sonde doel van het PANI oppervlak. Deze figuur toont de verandering in PANI-fluorescentie in de afwezigheid of aanwezigheid van sonde, zowel in oplossing als in vast coating medium.

De toename in fluorescentie is te wijten aan elektronenstroom van negatief geladen DNA, die de elektronen dichtheid van het polymeer verhoogt. Bij hybridisatie van complementaire doel oligonucleotiden, losmaken sondes zich, wat leidt tot de herstel van basilische fluorescentie. Omgekeerd, hybridisatie met enkele mismatch target oligonucleotiden resulteert niet in deze herstel van basilische fluorescentie.

De belangrijkste nieuwheid van deze techniek is dat het milde UV gebruikt voor een exacte interactie en dat het daadwerkelijk helpt om niet-specifieke en lichte interactie te onderscheiden. Eenmaal beheerst, kan deze techniek tot twee uur duren, exclusief de gevoeligheidstijd en de droogtijd van de coatings. Tijdens het uitvoeren van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat het DNA zich oplost in water en dat het zure thee de elektronische eigenschap van het PANI daadwerkelijk verandert.

Na het bekijken van deze video, zouden kijkers een goed begrip moeten hebben van hoe watergedispergeerd polyaniline wordt gesynthetiseerd en hoe de fluorescentie-eigenschappen ervan worden gebruikt om nucleïnezuren te detecteren. Ze zullen in staat zijn om sonde DNA's te immobiliseren en hybridisatie uit te voeren om doelen te detecteren. Bij het werken met de monomeer, is het belangrijk om te onthouden dat deze synthese gevaarlijk is en dat het in een afzuigkap moet worden uitgevoerd met de beschermende uitrustingen zoals v