Name: Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Leer een protocol voor de isolatie en activering van muizenlymfocyten met magnetische microbeads voor immunologisch onderzoek. Deze methode minimaliseert manipulatie en stress op cellen tijdens zuivering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het onderzoek wordt ondersteund door het Ministerie van Onderwijs, Singapore (ACRF Tier1-RG40 / 13 en Tier2-MOE2013-T2-2-038). Het manuscript werd bewerkt door Amy Sullivan van Obrizus Communications.

Alle muizen worden gefokt en onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden onderhouden en alle muis protocollen worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Bereiding van Buffers en Reagentia <ol><li> Bereid volledige Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, penicilline (100 IU / ml) / streptomycine (100 ug / ml), 55 pM 2-mercaptoethanol ). </li><li> Bereid 20x gebalanceerde zoutoplossing (BSS) Stock 1 en Stock 2, afzonderlijk. <ol><li> Bereid 20x BSS voorraad 1 (111 mM dextrose, 8,8 mM kaliumfosfaat, 26,7 mmol dibasisch in 1 liter steriel water) en voeg 40 ml 0,5% Fenol Red 20x BSS voorraad 1 vóór de definitieve aanpassing van het volume. Steriel filter met 0,2 urn filter vóór opslag bij 4 ° C. </li><li> Bereid 20x BSS voorraad 2 (25,8 mmol calciumchloridedihydraat, 107 mM kaliumchloride, 2,73 M natrium chloride, 19,6 mM magnesiumchloride hexahydraat, 16,6 mM magnesiumsulfaat in 1 liter steriel water). Steriel filter met 0,2 urn filter vóór opslag bij 4 ° C. </li><li> Om 1x BSS voor te bereiden op experimenteel gebruik, verdunnen 50 ml BSS voorraad 1 en 50 ml BSS voorraad 2, afzonderlijk, in 400 ml steriel water elk. Combineer verdunde oplossingen op pH 7 en voeg 20 ml FBS (2%). Top tot 1 L met behulp van steriel water en steriel filter met behulp van 0,2 um filter. LET OP: BSS voorraad oplossingen moeten afzonderlijk worden opgesteld omdat de vermenging van geconcentreerde BSS voorraden direct kan leiden tot neerslag. </li></ol></li><li> Rode bloedcellen (RBC) Lysis Buffer <ol><li> RBC lysisbuffer bereiden, mengen 9 delen stock ammoniumchloride (155 mM ammoniumchloride in steriel water) tot 1 deel stock Tris-base (130 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethaan in steriel water, pH 7,65) vóór gebruik. OPMERKING: WINKEL steriele voorraadoplossingen ammoniumchloride Tris-base en bij 4 ° C. Bereid lysis bUffer verse efficiënte lysis van RBC te waarborgen. </li></ol></li></ol> 2. Genereren van lymfocyt Schorsing van Milt en lymfeknopen NB: Het is belangrijk om alle reagentia en de apparatuur die nodig is voor het experiment voordat muis euthanasie voor te bereiden en enkele cel suspensies van lymfocyten genereren zo snel mogelijk een hoge levensvatbaarheid van de cellen te handhaven. <ol><li> Euthanaseren experimentele muis door cervicale dislocatie of CO 2 stikken. LET OP: Vanaf deze stap verder, moeten alle experimentele procedures aseptisch worden uitgevoerd. </li><li> Dompel de hele muis in 70% ethanol alvorens incisies. Verwijder de milt en lymfeknopen aseptisch 8 en plaats ze in afzonderlijke 15 ml buisjes met 5 ml ijskoude RPMI / FBS (RPMI met 2% FBS) of BSS / FBS (uit stap 1.2.3). LET OP: Aangezien BSS voorkomt efficiënt RBC lysis, gebruiken RPMI voor de bereiding van de milt cel schorsing en over te schakelen naar BSS after RBC lysis. </li><li> Een enkele celsuspensie van de milt of lymfeknopen genereren, plaatst het orgaan (en) tussen twee stukken steriele 100 urn mesh zeef cel in een petrischaaltje met 2 ml ijskoude RPMI / FBS of BSS / FBS. Met behulp van de zuiger van een 1 ml spuit, mash het orgel (s) totdat het is in zeer fijne delen gescheurd. </li><li> Breng de celsuspensie om een ​​15 ml buis en was de cel zeef gaas met ijskoude RPMI / FBS of BSS / FBS. Verzamel de resterende celsuspensie toevoegen aan dezelfde 15 ml buis en spin neer op 453 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. LET OP: resuspendeer de gepelleteerde cellen door flicking de buis met de vingers voor het toevoegen van RBC lysis buffer of medium in de daaropvolgende stappen. </li><li> Bereid kamertemperatuur (KT) RBC lysis buffer tijdens het centrifugeren van de celsuspensie (zie stap 1.3.). Na het pelleteren van de cellen en het verwijderen van het supernatant, resuspendeer de cellen met 1 ml RBC lysis buffer voor elke 10 8 cellen. Incuverminder de lysis reactie bij kamertemperatuur gedurende 3-4 min. </li><li> Stop RBC lysis met 14 ml ijskoude BSS / FBS en spin neer op 453 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li></ol> 3. Zuivering van B en T-cellen <ol><li> Zuivering van B cellen <ol><li> Tel de cellen met een hemocytometer. Resuspendeer maximaal 10 8 miltcellen in 300 gl BSS / FBS en voeg 50 ul anti-CD43 magnetische microkralen 9,10. Om de dode cellen te verwijderen, voeg 30 ul Annexine V magnetische bolletjes. Incubeer de celsuspensie in een 4 ° C koelkast gedurende 30 minuten. </li></ol></li><li> Zuivering van T-cellen <ol><li> Tel de cellen met een hemocytometer. Resuspendeer maximaal 10 8 cellen in niet-T-cel depletie antilichaam cocktail (gebiotinyleerde antilichamen tegen CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, TER119 en CD4 of CD8 afhankelijk van de beoogde celpopulatie gezuiverd), verdund 1: 200 in 200 gl BSS / FBS 4,5. Incubeer de celsuspensie in een4 ° C koelkast gedurende 15 minuten. </li><li> Na incubatie, voeg 10 ml BSS / FBS aan de cellen te wassen en spin neer op 453 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 165 ul BSS / FBS met 30 ul streptavidine microkralen en 15 ui Annexine V magnetische korrels. Incubeer de celsuspensie in een 4 ° C koelkast gedurende 30 minuten. Opmerking: Om nog labelen met magnetische microkralen waarborgen Incubeer de cellen met microkralen voor 15 min en meng de celsuspensie voorzichtig door op de 15 ml buis en incubeer nog 15 min bij stap 3.1.1. of 3.2.2. </li></ol></li><li> Voorbereiding van de scheidingskolom voor mobiele Zuivering <ol><li> Bereid een ongebruikte scheidingskolom tijdens microbeads labeling van de cellen (stap 3.1.1. En 3.2.2.). Voorverwarmen BSS (zonder FBS) tot kamertemperatuur en gebruik 2 ml te wassen en equilibreren de kolom aseptisch. Na equilibratie met BSS, moet de kolom gewassen niet uitdrogen. LET OP: We gebruiken de LS column in plaats van de aanbevolen LD kolom toe te schrijven aan de herbruikbaarheid (zie stap 3.4.). </li><li> Na labeling met de magnetische korrels, voeg 14 ml BSS / FBS aan de cellen te wassen en spin neer op 453 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1-3 ml RT BSS. </li><li> Bevestig een steriele 21 G naald in het uiteinde van de kolom om de stroomsnelheid te verminderen tijdens het proces van zuivering. Laad de celsuspensie op de geëquilibreerde kolom en verzamel de stroming door met het gezuiverde doelcellen. OPMERKING: Vermijd het introduceren van bellen in de kolom tijdens het laden. </li><li> Was de kolom eenmaal met 1 ml BSS / FBS en laat de stroom door de met gezuiverde doelcellen. Reload de kolom met de stroom door nogmaals. Verzamel de stroom door naar de tweede in eenzelfde 15 ml buis. </li><li> Was de kolom 3 maal met 1 ml BSS / FBS en laat de stroom door de met gezuiverde doelcellen. Daarna, voeg 5 ml BSS / FBS aan The kolom en met een plunjer, spoel de magnetisch gemerkte cellen uit de kolom in een nieuwe 15 ml buis. </li><li> Controleer de zuiverheid van het door middel van flow cytometrie verzameld onder gebruikmaking van antilichamen die binden aan antigenen van gezuiverde B- of T-cellen 4,5 huidcellen. </li></ol></li><li> Hergebruik van de scheidingskolom OPMERKING: De LS kolom kan worden hergebruikt voor 4 keer zonder dat zuiveringsrendement. <ol><li> Was de kolom 3 maal met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 3 maal met 5 ml gedestilleerd water van bovenaf met de plunjer. </li><li> Was de kolom met 5 ml 70% ethanol en droog de kolom uitgebreid met behulp van een kraan lucht om de opbouw van roest in de kolom te voorkomen. </li><li> Om een ​​gebruikt LS kolom voor een afzonderlijk experiment zuivering bereiden, de kolom was van onderaf met 5 ml 70% ethanol met behulp van de injectiespuit adapter. Vervolgens was de kolom van onderaf tweemaal met 5 ml steriel PBS, gevolgd door 5 ml PBS keer vanaf de top van de kolom. Voeg 2RT ml BSS aan de kolom equilibreren en vervolgens overgaan tot het laden van de kolom met gelabelde cellen. </li></ol></li></ol> 4. CFSE Labeling en Stimulatie OPMERKING: Gezuiverde cellen kunnen worden onderworpen aan een verscheidenheid van in vitro en in vivo functionele bepalingen. We gebruiken hier gezuiverde T-cellen de T-cel stimulatie vermogen van APCs 5 bepalen. <ol><li> Voorverwarmen merkoplossing (0,1% FBS in PBS) tot 37 ° C voorafgaand aan CFSE laden. OPMERKING: Met een laag percentage FBS in PBS vermindert celdood bij CFSE laden en minimaliseert celverlies tijdens het centrifugeren. Echter, te veel FBS bemoeien met CFSE laden. </li><li> Was cellen tweemaal gezuiverd met etiketteeroplossing, vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 2 x 10 7 cellen / ml in voorverwarmde labeling oplossing in een 15 ml buis. </li><li> Bereid 10 uM CFSE-oplossing (1: 500 verdunning van 5 mM CFSE voorraadoplossing) in voorverwarmde labelingoplossing. CFSE oplossing moetworden vers bereid telkens optimale labeling bereiken. </li><li> Cellen met CFSE laden kan 1 deel celsuspensie tot 1 deel 10 uM CFSE oplossing in een 15 ml buis en incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Een eindconcentratie van 5 pM CFSE gebruikt labelen 1 x 10 7 cellen / ml. </li><li> Inverteer de buis elke 2 minuten om een ​​homogeen mengsel van cellen tijdens CFSE laden waarborgen. </li><li> Om de reactie te stoppen, voeg enkele volumes ijskoude RPMI compleet medium en spin neer op 453 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Na succesvolle CFSE lichaam, wordt de celpellet weergegeven geelachtig. </li><li> Wassen CFSE beladen cellen één keer met ijskoude RPMI compleet medium en spin neer op 453 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C voor gebruik in vitro kweken of in vivo stimulatie. </li></ol> 5. In vitro stimulatie <ol><li> Bereid een 2x voorraad oplossing van stimuli (2x stimuli stockoplossing) onmiddellijk voor het gebruik, zodat 100 gl 2x stimuli voorraadoplossing kan tot 100 gl cellen worden toegevoegd aan een eindvolume van 200 ui per putje in een 96-wells plaat. </li><li> Indien een plaat waarop stimuli (IgM of CD40 op B-cellen en CD3 en CD28 op T-cellen) nodig verdunnen stimuli in PBS en voorbekleding de kweekplaat bij 4 ° C overnacht. Als alternatief kan de kweek plaat worden bekleed bij 37 ° C gedurende 1 uur op de dag van het experiment. Was de gecoate plaat tweemaal met PBS (Sta niet toe dat de plaat uit te drogen op elk moment). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Voor de B-cellen </td><td></td></tr><tr><td> stimuli </td><td> eindconcentratie </td></tr><tr><td> F (ab &#39;) 2 geiten anti-muis IgM </td><td> 0,6-2,4 ug / ml </td></tr><tr><td> Anti-muis CD40 mAb </td><td> 0,5-2 ug / ml </td></tr><tr><td> recombinantmuizen IL-4 </td><td> 25 U / ml </td></tr><tr><td> lipopolysaccharide </td><td rowspan="2"> 0,1-10 ug / ml </td></tr><tr><td> (LPS) van E. coli serotype 055: B5 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Voor T-cellen </td><td></td></tr><tr><td> stimuli </td><td> eindconcentratie </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (plaat gecoat) </td><td> 2-10 ug / ml </td></tr><tr><td> (50 gl / putje voor coating) </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD28 (plaat gecoat) </td><td> 2 ug / ml </td></tr><tr><td> Recombinant IL-2 </td><td> 40 U / ml </td></tr><tr><td> PDBu (forbolester) </td><td> 5-50 ng / ml </td></tr><tr><td> A23187 (Calcium ionofoor) </td><td> 250 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Concentraties van stimuli gebruikt om lymfocyten in vitro in kweek te stimuleren.<ol start="3"><li> Voor CFSE-gelabelde B-cellen, resuspendeer tot 3 x 10 6 cellen / ml in compleet RPMI-medium en kweek in triplo met 3 x 10 5 cellen / putje in 96-well platbodem platen gedurende 72 uur. </li><li> Voor CFSE-gelabelde T-cellen, opnieuw op te schorten tot 0,5-3 x 10 6 cellen / ml in compleet RPMI-medium en cultuur in drievoud met 0,5-3 x 10 5 cellen / putje in 96-well ronde bodem platen voor 48 of 72 uur . </li></ol> 6. In vivo stimulatie <ol><li> Voor in vivo stimulatie, adoptief overdracht 4 x 10 6 CFSE-gelabelde T-cellen per muis (intraveneus (iv) in 200 gl PBS) in elk MHC-aangepaste ontvanger muis. LET OP: In dit protocol, kan CFSE-gelabelde T-cellen adoptief worden overgebracht met behulp van staartader of retro-orbitale injectie als deze cellen zal de thuisbasis van organen zoals de milt en de lymfeklieren lymfoïde. </li><li> Daag de ontvangende muizen één dag meer met het antigeen. NOTITIE:In dit voorbeeld gebruiken we ovalbumine (OVA-eiwit, 50 ug / muis) als antigeen omdat OVA-specifieke T-celreceptor (TCR) -transgenic T-cellen werden adoptief overgebracht in ontvangende muizen. Bereid OVA eiwit in steriele PBS en injecteer 100 ul van OVA-eiwit / PBS of PBS controle, via subcutane injectie (si), in elke ontvanger muis 5. </li><li> Oogsten en het genereren van suspensies van afzonderlijke cellen van lymfoïde organen (lymfeklieren en milt) van ontvangende muizen 3 dagen na immunisatie met OVA eiwit of PBS. Afzonderlijke lymfeknopen in proximale lymfeklieren (PLN), die axillaire, brachiale en oppervlakkige cervicale lymfeknopen) en distale lymfeknopen (DLN) omvat, die mesenterische, knieholte, lies, lumbale en caudale lymfeknopen omvat. Vlek cellen met de juiste antilichamen FACS controleren op T-celproliferatie. Opmerking: In dit CFSE cell tracking experiment CFSE-gelabelde T-cellen uit PBS-geïnjecteerde controlemuizen stellen een basislijn fluorescentie voor niet-dividing cellen. Celdelingen van prolifererende, worden antigeen gestimuleerd, CFSE-gelabelde cellen gevisualiseerd door het meten van de fluorescentie pieken 12,13. De PBS controle, het aantal celdelingen van prolifererende, CFSE-gelabelde T-cellen kan worden bepaald 12,13. </li><li> Analyseer de CFSE-gelabelde celproliferatie gegevens door vergelijking van het aantal celdelingen of pieken tussen monsters (figuren 1 en 2). Opmerking: Zo CFSE-gelabelde, OVA-specifieke T-cellen adoptief overgebracht in ontvangende muizen die OVA antigeen actieve proliferatie ondergaan in vergelijking met de PBS-geïnjecteerde controlemuizen 5,12. Verder zij erop gewezen op wijzen dat er veel manieren om CFSE celproliferatie te analyseren, zoals aangetoond door Hawkins en collega 14. </li></ol>

<ol><li>Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+important+facets+of+T-cell+repertoire+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The many important facets of T-cell repertoire diversity.</a> Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).</li>
<li>LeBien, T. W., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes%3A+how+they+develop+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li>
<li>Brownlie, R., Zamoyska, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+signaling+networks%3A+branched%2C+diversified+and+bound%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound.</a> Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).</li>
<li>Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-rel+regulates+ezh2+expression+in+activated+lymphocytes+and+malignant+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells.</a> J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).</li>
<li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li>
<li>Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+B+lymphocytes+undergo+homeostatic+proliferation+in+response+to+B+cell+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit.</a> J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Th17+differentiation+of+na%C3%AFve+CD4+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes.</a> J. Vis. Exp. (79), e50765(2013).</li>
<li>Su, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezh2+controls+B+cell+development+through+histone+h3+methylation+and+Igh+rearrangement%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement.</a> Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).</li>
<li>Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C%CE%B4+controls+self-antigen-induced+B-cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance.</a> Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).</li>
<li>Rush, J. S., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+activated+via+CD40+and+IL-4+undergo+a+division+burst+but+require+continued+stimulation+to+maintain+division%2C+survival+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation.</a> Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).</li>
<li>Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).</li>
<li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lymphocyte+proliferation%2C+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).</li>
<li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Terminology+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit protocol tonen we een werkwijze voor het zuiveren van lymfocyten uit lymfoïde organen. Cel zuivering gebruikmakend van magnetische bead sortering is een snelle en eenvoudige methode die levensvatbare, sterk gezuiverd doelwitcellen oplevert. Kritische stappen in het protocol Levensvatbaarheid van de cellen en de opbrengst cel Het handhaven van de levensvatbaarheid van hematopoietische afkomst cellen in vitro</...

Volwassen lymfocyten bestaan over het algemeen in de rusttoestand als er geen reeds bestaande infectie of ontsteking is bij het individu. Daarom is het belangrijk om de naïve status van lymfocyten te behouden tijdens het isolatieproces voordat in vitro of in vivo functionele assays worden uitgevoerd. De sleutel tot consistent en reproduceerbare resultaten is om onnodige manipulatie van de cellen te beperken.
Magneetcellensortering maakt gebruik van antilichamen en microbeads om cellen te labelen om de celpopulatie van belang te verrijken. Met deze aanpak zijn er twee zuiveringsstrategieën: positieve verrijking en negatieve depletie. Positieve verrijking verrijkt de celpopulatie van belang door gebruik van een antilichaam dat zich bindt aan de doelcellen. Negatieve depletie daarentegen vermindert niet-doelcellen, waardoor de celpopulatie van belang overblijft. In ons lab geven we de voorkeur aan negatieve depletie boven positieve verrijking omdat de binding van antilichamen aan de doelcellen mogelijk cellulaire kenmerken en gedrag kan veranderen. In feite zijn veel gevestigde celoppervlaktemarkers die geschikt zijn voor de isolatie van een specifieke celpopulatie ook functionele receptoren.
Magneetcellensortering levert niet alleen zeer pure populaties van levensvatbare doelcellen op, het is ook minder tijdrovend en vermijdt de cellulaire stress veroorzaakt door hogedrukstroming die wordt gebruikt bij fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Door de ongewenste celpopulaties te labelen en deze te verminderen met behulp van een magnetische scheidingskolom, kunnen we snelle celisolatie uitvoeren zonder de levensvatbaarheid van de doelcelpopulatie in gevaar te brengen. In dit protocol demonstreren we het gebruik van negatieve depletiestrategieën om naïve B-cellen of T-cellen te zuiveren.

<table><tbody><tr><td>Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (zonder L-Glutamine)</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td></td><td></td><td>Warmte geïnactiveerd&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140114</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD43 magnetische microkralen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-801</td><td>Goed mengen voor gebruik</td></tr><tr><td>Streptavidine microkralen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td>Goed mengen voor gebruik</td></tr><tr><td>Anti-Annexin V magnetische kralen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-201</td><td>Goed mengen voor gebruik</td></tr><tr><td>MACS LD&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bodem steriele kweekplaat</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>96-well F-bodem steriele kweekplaat</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m cel zeef</td><td></td><td></td><td>Steriliseren met UV straling voor gebruik</td></tr><tr><td>0.2 &mu;m&nbsp; steriele wegwerp filter units</td><td>Nalgene</td><td>567-0020</td><td>Kan worden vervangen door elk steriel filterapparaat</td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>CTV voor kort; alternatief voor CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Yellow</td><td>Invitrogen</td><td>C34567</td><td>CTY voor kort; alternatief voor CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td>CTFR voor kort; alternatief voor CFSE</td></tr><tr><td>Cel Proliferatie Dye eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840</td><td>CPD670 voor kort; alternatief voor CFSE</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td>PKH26, alternatief voor CFSE</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Chemische stoffen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Rood</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride dihydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Merck Millipore</td><td>S7653</td><td>Kan van andere bronnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>(5-(en 6-) carboxyfluorescein diacetaat succinimide ester (CFSE)</td><td>Molecular Probes</td><td>C-1157</td><td>Reconstituteer in DMSO</td></tr><tr><td>Phorbol 12,13-dibutyraat (PBDU, Phorbol ester)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1269</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (Calcium ionofoor)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7522</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Antilichamen en recombinante eiwitten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b biotin (clone m1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td>T-cel depletie cocktail</td></tr><tr><td>CD11c biotin (clone N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>T-cel depletie cocktail</td></tr><tr><td>Gr-1 biotin (clone RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td>T-cel depletie cocktail</td></tr><tr><td>Ter119 biotin (clone Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>T-cel depletie cocktail</td></tr><tr><td>TCR-&gamma;&delta; biotin (clone GL-3)</td><td>Biolegend</td><td>118103</td><td>T-cel depletie cocktail</td></tr><tr><td>CD19 biotin (clone 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>T-cel depletie cocktail</td></tr><tr><td>B220 biotin (clone RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td>T-cel depletie cocktail</td></tr><tr><td>CD49b biotin (clone DX5)</td><td>Biolegend</td><td>108904</td><td>T-cel depletie cocktail</td></tr><tr><td>CD4 biotin (clone GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100404</td><td>T-cel depletie cocktail</td></tr><tr><td>CD8 biotin (clone 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>T-cel depletie cocktail</td></tr><tr><td>F(ab&rsquo;)2 geiten anti-muis IgM (plaat gecoat)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>115-006-075</td><td>50 &micro;l/well voor coating (96-well)</td></tr><tr><td>Anti-muis CD40 mAb (plaat gecoat)</td><td>Pharmingen&nbsp;</td><td>553722</td><td>50 &micro;l/well voor coating (96-well)</td></tr><tr><td>Recombinant IL-4</td><td>ProSpec&nbsp;</td><td>Cyt-282</td><td></td></tr><tr><td>LPS van E. coli Serotype 055:B5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L-4005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plaat gecoat)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0037-85</td><td>50 &micro;l/well voor coating (96-well)</td></tr><tr><td>Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plaat gecoat)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0281-85</td><td>50 &micro;l/well voor coating (96-well)</td></tr><tr><td>Recombinant IL-2</td><td>ProSpec</td><td>Cyt-370</td><td></td></tr><tr><td>Albumine uit kippeneiwit, Ovalbumine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7641</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en activering van muizen lymfocyten

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B- en T-cellen, met hun uiterst diverse repertoires van antigeenreceptoren, hebben de capaciteit om specifieke immuunreacties op te zetten tegen vrijwel elk binnendringende pathogeen1,2. Het is begrijpelijk dat dergelijke complexe vermogens worden gecontroleerd door een groot aantal moleculen die betrokken zijn bij verschillende cellulaire processen om tijdige en ruimtelijk gereguleerde immuunreacties te garanderen3. Hier beschrijven we experimentele procedures die een snelle isolatie van hoog gezuiverde muislymfocyten mogelijk maken met behulp van magnetische celsorteertechnologie. De resulterende gezuiverde lymfocyten kunnen vervolgens worden onderworpen aan verschillende in vitro of in vivo functionele assays, zoals de bepaling van lymfocytsignaleringscapaciteit bij stimulatie door immunoblotting4 en de onderzoeking van proliferatieve vermogens door 3H-thymidine-incorporatie of carboxyfluorescein diacetaat succinimidyl ester (CFSE)-labeling5-7. Naast het vergelijken van de functionele capaciteiten van controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten, kunnen we ook de T-cel stimulatoire capaciteit van antigeen-presenterende cellen (APC's) in vivo bepalen, zoals getoond in onze representatieve resultaten met getransplanteerde CFSE-gelabelde OT-I T-cellen.

Magnetische cel zuivering van lymfocyten kunnen gebruikers een doelcelpopulatie zuiveren in een relatief korte tijd. Met onze uitputting protocol konden we het percentage van CD8 T-cellen (OT-I in recombinatie-activerende genen-1 (RAG-1) deficiënte muizen) stijgen van 72,8% (voor zuivering) tot 94,2% (na zuivering; Figuur 1A) 4,5. Deze gezuiverde lymfocyten kunnen vervolgens worden gebruikt voor downstream functionele testen om lymfocytproliferatie en signaalt...

Lymfocyten zijn de belangrijkste spelers in adaptieve immuunresponsen. Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van lymfocyten om de fysiologische functies van de gewenste moleculen bij lymfocytenactivatie in vitro en in vivo te bepalen. De beschreven experimentele procedures zijn geschikt voor het vergelijken van functionele capaciteiten tussen controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Het algemene doel van dit experiment is om de functionele capaciteiten van gezuiverde muizenlymfocyten te bestuderen met behulp van diverse in vitro en in vivo functionele assays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de immunologie en moleculaire biologie, zoals het onderzoeken van de functie van een specifiek eiwit in gendeficiënte lymfocyten.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om snel lymfocyten te zuiveren met minimale manipulatie en omgevingsstress. Om B-cellen te zuiveren, resuspendeert u maximaal 1 × 10⁸ erytrocyt-gelyseerde miltcellen in 300 µL gebalanceerde zoutoplossing (BSS) aangevuld met FBS. Voeg vervolgens 50 µL anti-CD43 magnetische micro-beads toe.Om de dode cellen te verwijderen, voegt u 30 µL Annexin five magnetische kralen toe gedurende 30 minuten bij 4 °C. Tik de celsuspensie elke 15 minuten aan om een gelijkmatige labeling van de cellen te garanderen. Was na afloop van de incubatie de gelabelde cellen met 14 mL BSS aangevuld met FBS.Verwijder na centrifugatie het supernatant, tik tegen de buis en resuspendeer de pellet in één tot drie milliliter BSS op kamertemperatuur aangevuld met FBS. Plaats

isolation-and-activation-of-murine-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Isolatie van lymfocyten met behulp van de Miltenyi MAC-kit is een betrouwbare manier om cellen van hele lymfeweefsel homogenaten te zuiveren. Cellen gezuiverd met behulp van de Miltenyi systeem zijn meestal ≥ 96% zuiver. Hier tonen we de stappen die zijn genomen om CD4 + T-cellen, een van de vele kits worden aangeboden door Miltenyi isoleren.

Isolatie van CD4 + T-cellen van de muis lymfeknopen Met behulp van Miltenyi MACS Zuivering

In deze video, tonen we de procedure van de CD40-activatie en expansie van B-cellen van muizen splenocyten van C57BL / 6 muizen, die gebruikt kan worden als een model antigeen-presenterende cel (APC), de inductie van immuniteit bestuderen.

Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen

We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale...

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

Een efficiënte manier om lymfocyten uit muizen genitaal isoleren beschreven. Deze methode maakt gebruik van enzymdigestie en Percoll gradiëntscheiding om efficiënte isolatie. Deze techniek is ook aangepast aan gebruik in andere...

Isolatie van Lymfocyten van Mouse geslachtsorganen Mucosa

Er is een toenemende belangstelling voor het begrijpen van de immunologische functies van specifieke subpopulaties van cellen in platen van Peyer (PP), de primaire inductieve plaatsen van darm-geassocieerd lymfeweefsel. Hier schetsen we parallel protocollen voor de voorbereiding van PP enkele cel voorbereidingen voor flowcytometrische analyse en PP cryocoupes voor immunokleuring.

Isoleren En Immunokleuring Lymfocyten en dendritische cellen uit Patches Murine Peyer

Hier beschrijven we een efficiënte methode voor isolatie, identificatie en zuivering van muizen thymus epitheelcellen (TEC). Het protocol kan worden gebruikt voor studies van thymus functie voor normale T-cel ontwikkeling, thymus en T cel reconstitutie.

Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

Isolatie van lymfeklieronstcellen is een meervoudige procedure die enzymatische vertering en mechanische disaggregatie omvat om fibroblastische reticulaire cellen, lymfatische en bloed-endotheelcellen te verkrijgen. In de beschreven procedure wordt een korte vertering gecombineerd met geautomatiseerde mechanische disaggregatie om de degradatie van oppervlaktemarkeringen van vitale lymfeklersonstcellen te minimaliseren.

Isolatie van muizen lymfkliertest stromale cellen

Monocyt-afgeleide DC (MoDC) kleine hoeveelheden gevaar-geassocieerde moleculen kunnen voelen en zijn daarom gemakkelijk primer. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de MoDC uit bloed, tumoren en hun activering met immuuncomplexen terwijl het benadrukken van belangrijke voorzorgsmaatregelen die moeten worden overwogen om te voorkomen dat hun voortijdige activering.

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

Dit artikel beschrijft een methode voor magnetische isolatie op basis van kralen van endotheelcellen van muizen uit dermale lymfatische capillairen. De geïsoleerde lymfatische endotheelcellen kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse in-vitro-experimenten en eiwitexpressie-analyse.

Isolatie van dermale lymfatische endotheelcellen bij muizen

De huidige studie toont protocollen voor het beoordelen van de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen en het manipuleren van genexpressie in deze cellen.

Toegang tot vroege differentiatie van virusspecifieke folliculaire helper CD4+ T-cel in acute LCMV-geïnfecteerde muizen

Leer een protocol voor de isolatie en activering van muizenlymfocyten met magnetische microbeads voor immunologisch onderzoek. Deze methode minimaliseert manipulatie en stress op cellen tijdens zuivering.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

Meer video's verkennen