Name: Fenotypische karakterisering van macrofagen van Rat Kidney door flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Leer fenotypische karakterisering van macrofagen uit rattennieren door flowcytometrie. Dit protocol kwantificeert en analyseert residente macrofagen voor nieronderzoek en ondersteunt toekomstige studies naar nierziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van FIS/FEDER (Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 en PI14/00883), de Spaanse Vereniging voor Atherosclerose, de Spaanse Vereniging voor Nefrologie en Fundación Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) aan Juan Antonio Moreno. FIS/FEDER fondsen PI14/00386 en Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica aan Jesús Egido. Fundación Conchita Rabago aan Melania Guerrero Hue. Fundación Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) aan Alfonso Rubio Navarro.

Dit protocol werd goedgekeurd door de lokale Institutional Animal Care en gebruik commissies naar aanleiding van de Richtlijn 2010/63 / EU van het Europees Parlement en de National Guideline 53/2013. 1. Voorbereiding van de reagentia en oplossingen <ol><li> Bereid alle reagentia en oplossingen onder steriele omstandigheden en gebruiken onder een laminaire stroming kap. Een oplossing bij 4 ° C. </li><li> Bereid vlekken buffer (2% foetaal runderserum (FBS) in 1 x Dulbecco&#39;s PBS). </li><li> Bereid collagenase door toevoeging van 0,5 mg collagenase elk ml zoutoplossing. </li><li> Bereid anesthesie oplossing van ketamine / xylazine (2: 1 v / v). </li></ol> 2. Nier Perfusie en Extraction <ol><li> Verdoven ratten door intraperitoneale injectie van ketamine / xylazine (75 mg / 12 mg / kg gewicht). knijpen voorzichtig een kleine huidplooi, om te controleren of het dier voldoende is verdoofd. Vervolgens bedekken ogen dierenarts zalf tot droog voorkomen terwijl onder verdoving. Let op: 4-month oude Wistar ratten werden gebruikt in deze test. </li><li> Zodra de rat volledig verdoofd, leg het op een chirurgische tafel in een liggende positie. </li><li> Toepassen 70% ethanol aan de buik. </li><li> Maak een centrale incisie door de buikhuid en het buikvlies, van het schaambeen aan de ribbenkast, aan de pleura en de buikholte bloot te leggen. </li><li> Injecteer zoutoplossing (0,9%) in de abdominale aorta nieren via perfusie systeem totdat al het bloed uit de nieren wordt verwijderd perfuseren. Snijd de aorta in de buik niveau te helpen het bloed vrij te geven. </li><li> Verwijder beide nieren van de rat door het snijden van de renale hilus (renale ader, slagader en urineleider). Om de nier decapsulate, drukt u op de rand van de nier met de vingers voorzichtig scheiden van de capsule 11. </li><li> Plaats de nier in Hanks &#39;gebalanceerde zoutoplossing. </li></ol> 3. Nier Spijsvertering en Cell Suspension <ol><li> Snijd de helft van een nier met een schaar in kleine stukjes en zet destukjes in een 1,5 ml buis. Opmerking: Alle volgende concentraties worden berekend voor 1 monster (nier 1/2 rat). </li><li> Voeg 1 ml van de collagenase-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Meng door inversie om de 5 minuten om ervoor te zorgen dat de collagenase oplossing toegang tot de hele weefsel. </li><li> Verzamel de oplossing en doorgeven door een zeef (40 um) met behulp van een plunjer en resuspendeer in 10 ml vlekken buffer. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 15 min. </li><li> Resuspendeer de pellet in 1 ml ACK (ammonium-chloride-Kalium) lysisbuffer. Na 1 min 30 sec bij kamertemperatuur, voeg 10 ml vlekken buffer om de reactie te stoppen. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min. </li><li> Resuspendeer de pellet in een toereikend volume kleuring buffer (1 ml) en filtreer de celsuspensie met behulp van een zeef (30 um). </li><li> Tel het aantal cellen met behulp van trypan blauw exclusie op een hemocytometer en voeg 2 miljoen cellen een 1,5 ml buis staining. </li></ol> 4. cel kleuring en Flowcytometrieanalyse <ol><li> Centrifugeer cellen bij 100 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de pellet in 100 ul rattenserum (verdund 1: 100) gedurende 10 min bij 4 ° C aan Fc-receptoren te blokkeren. </li><li> Wassen door toevoeging van 1 ml vlekken buffer en centrifugeer 100 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Meng de antilichamen voor celoppervlak kleuring in 100 pl buffer kleuring voor elke conditie: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) en oplossingen voor levende cellen (: 1000 3) detecteren. </li><li> Resuspendeer de celpellet in het antilichaam mix gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker. </li><li> Wassen door toevoeging van 1 ml vlekken buffer en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap. </li><li> Voeg 600 ul van fixatie / permeabilisatie oplossing gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker. </li><li> Was 2 maal met 1 ml permeabilisatie / Wash buffer en centrifugeer bij 170 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg de CD68 FITC antilichaam (35: 1000) voor Intracellaire kleuring met 100 gl permeabilisatie / Wash buffer voor elke conditie. </li><li> Resuspendeer de pellet in de CD68-antilichaamoplossing en incubeer 50 minuten bij 4 ° C in het donker. </li><li> Wassen met 1 ml permeabilisatie / Wash buffer en centrifugeer bij 170 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de pellet in 100 pl permeabilisatie / Wash buffer, voeg CD86PE antilichaam (35: 1000) en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker. </li><li> Wassen door toevoeging van 1 ml permeabilisatie / Wash buffer en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de pellet in 100 ui van Permeabilisatie / Wash buffer en door te geven aan een flowcytometrie buis. </li><li> Analyseer monsters door middel van flowcytometrie. Bepaal CD45 kleuring in levende cellen gated in-Side verstrooide licht / forward-verstrooid licht (/ FSC SSC) venster. In een tweede stap, analyseren CD86 en CD163 expressie in CD68 + cellen. </li></ol>

<ol><li>Gansevoort, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+kidney+disease+and+cardiovascular+risk%3A+epidemiology%2C+mechanisms%2C+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention.</a> Lancet. 382, 339-352 (2013).</li>
<li>Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+in+chronic+kidney+disease%3A+the+role+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages.</a> Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+depletion+ameliorates+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Exp.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice.</a> Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).</li>
<li>Belliere, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+macrophage+subtypes+influence+the+progression+of+rhabdomyolysis-induced+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).</li>
<li>Kinsey, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+dynamics+in+AKI+to+CKD+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophage dynamics in AKI to CKD progression.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).</li>
<li>Lech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+phenotype+controls+long-term+AKI+outcomes--kidney+regeneration+versus+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41, 14-20 (2014).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).</li>
<li>Ortiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+value+of+animal+models+of+kidney+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Translational value of animal models of kidney failure.</a> Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).</li>
<li>Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+double+negative+alphabeta+T+cells+from+the%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of double negative alphabeta T cells from the.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li>
<li>Martin-Fernandez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldosterone+Induces+Renal+Fibrosis+and+Inflammatory+M1-Macrophage+Subtype+via+Mineralocorticoid+Receptor+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats.</a> PLoS. One. 11, e0145946(2016).</li>
<li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> J. Vis. Exp. (e52749), (2015).</li>
<li>Komohara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+infiltration+and+its+prognostic+relevance+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma.</a> Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).</li>
<li>Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+macrophages+in+the+fibrotic+phase+of+rat+crescentic+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis.</a> Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).</li>
<li>Ndisang, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+heme+oxygenase-adiponectin-atrial+natriuretic+peptide+axis+in+renal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function.</a> Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).</li>
<li>Blackbeard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+rat+spinal+microglial+response+to+peripheral+nerve+injury+as+revealed+by+immunohistochemical+image+analysis+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry.</a> J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).</li>
<li>Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+intracellular+CD68+molecule+expression+in+normal+and+malignant+haemopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis.</a> Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Macrofagen heterogene cellen die een belangrijke rol spelen in verschillende ontstekingsziekten, waaronder renale stoornissen. Er is steeds meer belangstelling voor het karakteriseren van macrofagen subsets bij nierziekte omdat elke subpopulatie macrofaag draagt op een andere manier om de ontwikkeling van nierschade, zoals in glomerulonefritis, diabetische nefropathie en nierkanker 14-16. In de vroege stadia van acute nierschade, is een overwicht van M1 macrofagen waargenomen, bevordering tubulaire necrose en...

Nieraandoening is een wereldwijd gezondheidsprobleem, met een verhoogde prevalentie, en geassocieerd met verhoogde morbiditeit en mortaliteit1. Een van de belangrijkste mechanismen die betrokken zijn bij de progressie en ontwikkeling van nierbeschadiging is ontsteking, voornamelijk veroorzaakt door macrofagen. Macrofagen spelen een cruciale rol in veel ontstekingsziekten, inclusief nierziekten2. Zo is een verhoogde aanwezigheid van infiltrerende macrofagen gemeld in biopsieën van patiënten met acute nierbeschadiging (AKI) of chronische nierziekte (CKD)3,4. Recente studies suggereren dat het langetermijnresultaat van nierziekte kan worden gecontroleerd door macrofagen5,6. In reactie op de lokale micro-omgeving kunnen macrofagen differentiëren in verschillende fenotypes die diverse biologische functies spelen7. Twee goed gedifferentieerde macrofagenfenotypes zijn vastgesteld: klassiek geactiveerde macrofagen (M1 macrofagen) en alternatief geactiveerde macrofagen (M2)8. M1 macrofagen bevorderen ontsteking, terwijl M2 macrofagen een ontstekingsremmende rol hebben en betrokken zijn bij weefselreparatie9. Daarom is een betere kennis van macrofagenheterogeniteit noodzakelijk om hun regulatie en bijdrage aan nierpathologie te begrijpen en nieuwe therapeutische benaderingen te ontwikkelen.
Zowel muis- als rattenmodellen zijn veel gebruikt om de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij nierbeschadiging te begrijpen10. Er zijn echter aanzienlijke verschillen in de verschillende markers die worden gebruikt om macrofagenfenotypes te identificeren tussen deze knaagdieren. Daarom worden verschillende muismarkers, zoals F4/80 of Ly6C, niet gebruikt bij ratten, waardoor de extrapolatie van bevindingen tussen deze soorten wordt beperkt. Bovendien is er een beperkt aantal markers dat macrofagenfenotypes bij ratten beschrijft, wat verklaart waarom er weinig studies zijn die macrofagenheterogeniteit bij deze dieren analyseren in vergelijking met muizen. Daarom zijn nieuwe strategieën voor de karakterisering van macrofagensubsets noodzakelijk om de rol van macrofagen in nierziektemodellen bij ratten te begrijpen.
Dit manuscript beschrijft een protocol voor de fenotypische en kwantitatieve analyse van macrofagen uit rattennieren door middel van flowcytometrie. Deze techniek kan verder worden gevolgd door verschillende assays, inclusief celsortering en mRNA of eiwitexpressiestudies om een diepgaande karakterisering van de rol van macrofagen bij nierziekte mogelijk te maken.

<table><tbody><tr><td>Laminar flow hood</td><td>Faster</td><td></td><td>Of gelijkwaardige apparatuur</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettich</td><td></td><td>Of gelijkwaardige apparatuur</td></tr><tr><td>Flow cytometer (FACSAria)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>BioWest</td><td>S1820-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>LONZA</td><td>BE17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12/1/9001</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry strainers</td><td>BD Biosciences</td><td>340626</td><td></td></tr><tr><td>Falcon cell strainers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry tubes</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes</td><td>Corning centristar</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Memmert GmbH + Co. KG</td><td>WNE 7</td><td>37 &#176;C</td></tr><tr><td>Fixatie/Permeabilisatie oplossing of Permeabilisatie/Was Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Rompum (Xylazine)</td><td>Bayer</td><td></td><td>Of gelijkwaardige</td></tr><tr><td>Ketalar (Ketamine)</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Of gelijkwaardige</td></tr><tr><td>Hanks&rsquo; balanced salt solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Saline solution</td><td>Braun</td><td>622415</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>202216</td><td>Verdund 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD68 (clone: ED1) FITC</td><td>Bio-RAD</td><td>MCA341F</td><td>Verdund 35:1,000</td></tr><tr><td>anti-CD86 (clone: 24F) PE</td><td>Biolegend</td><td>200307</td><td>Verdund 35:1,000</td></tr><tr><td>anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647</td><td>Bio-RAD</td><td>MCA342R</td><td>Verdund 4:100</td></tr><tr><td>Live/dead stain&nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>L34955</td><td>Verdund 3:1,000</td></tr></tbody></table>

fenotypische karakterisering van macrofagen van rat kidney door flowcytometrie

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Er zijn steeds meer aanwijzingen die wijzen op de belangrijke rol van ontsteking en, daardoor, macrofagen in de ontwikkeling en progressie van nierziekten. Macrofagen zijn heterogene cellen die betrokken zijn geweest bij nierbeschadiging. Macrofagen kunnen worden ingedeeld in twee verschillende fenotypes: klassiek geactiveerde macrofagen (M1-macrofagen), die pro-inflammatoire cytokinen afgeven en fibrose bevorderen; en alternatief geactiveerde macrofagen (M2-macrofagen) die geassocieerd zijn met immunoregulerende en weefsel-remodelleringsfuncties. Deze macrofagenfenotypes moeten worden onderscheiden en geanalyseerd om hun bijdrage aan nierbeschadiging te bepalen. Er zijn echter schaarse studies die consistente fenotypische en functionele informatie rapporteren over macrofagensubtypen in inflammatoire nierziektemodellen, vooral bij ratten. Dit feit kan verband houden met de beperkte macrofagenmarkers die bij ratten worden gebruikt, in tegenstelling tot muizen. Daarom zijn nieuwe strategieën noodzakelijk om de nierinhoud van deze infiltrerende cellen op een betrouwbare manier te kwantificeren en te karakteriseren. Dit manuscript beschrijft een protocol voor nierdigestie en verdere fenotypische en kwantitatieve analyse van macrofagen uit rattennieren door middel van flowcytometrie. In het kort werden nieren geïncubeerd met collagenase en totale macrofagen werden geïdentificeerd op basis van de dubbele aanwezigheid van CD45 (leukocyten gemeenschappelijk antigeen) en CD68 (PAN-macrofaagmarker) in levende cellen. Dit werd gevolgd door oppervlaktekleuring van CD86 (M1-marker) en CD163 (M2-marker). Peritoneale macrofagen van ratten werden gebruikt als positieve controle voor macrofaagmarkerdetectie door middel van flowcytometrie. Ons protocol resulteerde in een lage cellulaire mortaliteit en maakte karakterisering van verschillende intracellulaire en oppervlakte-eiwitmarkers mogelijk, waardoor het verlies van cellulaire integriteit dat in andere protocollen werd waargenomen, werd beperkt. Bovendien maakt deze procedure het gebruik van macrofagen mogelijk voor verdere technieken, waaronder celsortering en mRNA- of eiwitexpressiestudies, onder andere.

We analyseerden macrofaag heterogeniteit in een experimenteel model van inflammatoire nierschade geassocieerd met verhoogde aanwezigheid van infiltrerende macrofagen in de nier. In dit model, werd nierschade geïnduceerd door toediening van aldosteron (1 mg kg -1 -1 dag) plus zout (NaCl 1%) in drinkwater gedurende 3 weken in Wistar ratten, zoals eerder vermeld 12. Het schema van onze experimente...

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor fenotypische en kwantitatieve analyse van de aldaar gevestigde macrofagen van rat nieren door middel van flowcytometrie. De resulterende gekleurde cellen kunnen ook worden gebruikt voor andere toepassingen, zoals celsortering, genexpressie analyse of functionele studies, aldus verkregen in het experimentele modelinformatie verhogen.

Fenotypische karakterisering van macrofagen van Rat Kidney door flowcytometrie

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Het algemene doel van deze procedure is om residente macrofagen uit rattennieren te kwantificeren en te karakteriseren middels flowcytometrie. Deze methode kan antwoord bieden op cruciale vragen over de vloeibaarheid, zoals wat de bijdrage is van elk type macrofaag bij nierschade. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de karakterisering van nieren met verschillende eiwitmarkers mogelijk maakt, waardoor de cellulaire integriteit behouden blijft. De procedure zal worden gedemonstreerd door Elena Olivares, A.P.A.S.D.-student aan de Complutense Universiteit en Melania Guerrero, A.P.A.S.D.-student. Begin voor de nierperfusie en extractie met het knijpen in een kleine huidplooi om te bevestigen dat de rat het juiste sedatieniveau heeft bereikt. Smeer vervolgens vetafgifte-zalf op de ogen. Plaats het dier in rugligging op een operatietafel en reinig de buik met 70% ethanol. Maak vervolgens een centrale incisie door de buikhuid en het peritoneum vanaf het schaambeen tot aan de ribbenkast om de pleurale en abdominale holtes bloot te leggen. Gebruik het perfusiesysteem om 0,9% zoutoplossing in de abdominale aorta te injecteren om de nieren door te spoelen. Snijd de aorta in

phenotypic-characterization-macrophages-from-rat-kidney-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een nieuwe methode om macrofagen te verkrijgen van de primaire cultuur van de levercellen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van de proliferatie van macrofagen in de cultuur, gevolgd door het schudden van de cultuur kolven en zuivering door middel van selectieve gehechtheid aan plastic schaaltjes. Deze techniek biedt een efficiënte lever macrofagen, zonder ingewikkelde apparatuur en vaardigheden.

Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen

Hierin beschrijven we protocollen voor het oogsten van muizen-alveolaire macrofagen, die aangeboren immuunsysteem cellen woonachtig zijn in de longen, en de behandeling van hun activering in reactie op de co-cultuur met polyanhydride nanodeeltjes.

Oogsten Murine alveolaire macrofagen en evalueren van cellulaire activatie geïnduceerd door polyanhydride Nanodeeltjes

Macrofagen zijn plastic cellen van het hematopoietische systeem die een cruciale rol spelen in beschermende immuniteit en homeostase. In dit rapport beschrijven we geoptimaliseerde in vitro technieken voor het fenotypisch en functioneel karakteriseren van transplantatie-infiltrerende regulerende macrofagen die zich in het getransplanteerde orgaan verzamelen onder tolerogene omstandigheden.

Functionele karakterisering van regulerende macrofagen die de transplantaatreactieve immuniteit verhinderen

Technieken die betrouwbaar en efficiënt zijn voor het isoleren van immuuncellen in de nieren zijn nodig voor downstream-toepassingen. Dit vereist oppervlakte-antilichaammarkering van een klein aantal immuuncellen in de nieren. Hierin beschrijven we een beknopte methode voor het isoleren van immuuncellen in de nieren die schijnbaar dit doel bereikt.

Betrouwbaar en High Efficiency Winning van Kidney immuuncellen

Dit protocol geeft een analyse van de macrofage subpopulaties in het centraal zenuwstelsel van het volwassen muis door middel van flowcytometrie en is nuttig voor het bestuderen van meerdere markers die door deze cellen worden uitgedrukt.

Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry

Dit artikel beschrijft een methode voor het analyseren van immuun celinhoud van adipeus weefsel door isolatie van immuuncellen uit vetweefsel en latere analyse met behulp van stroom cytometry.

Karakterisering van Immune cellen in menselijke adipeus weefsel met behulp van Stroom Cytometry

Deze studie toont aan dat het gebruik van stroom cytometry te detecteren van reactieve zuurstof soorten (ROS) productie als gevolg van de activering van de FcγR. Deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen van veranderingen in de antimicrobiële en redox signaalfunctie van fagocyten in reactie op immuuncomplexen, opsonized micro-organismen of directe FcγR dwarsbinding.

Cytometrische Stroommeting van ROS productie In macrofagen In reactie op FcγR dwarsbinding

Dit protocol biedt een efficiënte collagenase-verteringsmethode voor isolatie van levensvatbare adipocyten en stromale vasculaire fractie-SVF-cellen uit menselijk visceraal vet in één enkel proces, inclusief methodologie om hoogwaardig RNA uit adipocyten te verkrijgen en fenotypificatie van SVF-macrofagen door kleuring van meerdere membraangebonden markers voor analyse door middel van flowcytometrie.

Isolatie van levensvatbare vetcellen en stromale vasculaire fractie uit menselijk visceraal vetweefsel geschikt voor RNA-analyse en macrofaagfenotypering

Hier wordt een protocol gerapporteerd voor de selectieve ablatie van renale macrofagen om hun regeneratie te bestuderen met behulp van de menselijke CD59/intermedialysine-celablatietool. Deze methode is ook toepasbaar voor het bestuderen van de functie en regeneratie van de andere celpopulaties in de nieren, lever en vetweefsel.

Snelle uitputting van niermacrofagen met behulp van menselijke CD59/Intermedilysin Cell Ablation Tool

Dit werk beschrijft een gestandaardiseerd in vitro protocol om de fagocytosepercentages van xenogene (humane) en allogene (ratten) rode bloedcellen te kwantificeren en te vergelijken door geïsoleerde macrofagen van ratten.

Een kwantitatieve beoordeling van de fagocytose van allogene en xenogene erytrocyten door macrofagen van ratten in vitro

Leer fenotypische karakterisering van macrofagen uit rattennieren door flowcytometrie. Dit protocol kwantificeert en analyseert residente macrofagen voor nieronderzoek en ondersteunt toekomstige studies naar nierziekten.

Fenotypische karakterisering van macrofagen van Rat Kidney door flowcytometrie

Meer video's verkennen