Fenotypische karakterisering van macrofagen van Rat Kidney door flowcytometrie
18 oktober 2016
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor fenotypische en kwantitatieve analyse van de aldaar gevestigde macrofagen van rat nieren door middel van flowcytometrie. De resulterende gekleurde cellen kunnen ook worden gebruikt voor andere toepassingen, zoals celsortering, genexpressie analyse of functionele studies, aldus verkregen in het experimentele modelinformatie verhogen.
Het algemene doel van deze procedure is om residente macrofagen uit rattennieren te kwantificeren en te karakteriseren door middel van flowcytometrie.Deze methode kan een belangrijke vraag beantwoorden over de fluiditeit, zoals wat de bijdrage is van elke macrofaag van het type in nierbeschadiging.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de katheterisatie van de nier mogelijk maakt van verschillende eiwitmarkers.Daarmee beperkt het de cellulaire integriteit van. Het demonstreren van de procedure zullen Elena Olivares, A.P.A.S.D.-student van de Complutense Universiteit en Melania Guerrero, A.P.A.S.D.-student van zijn.Voor nierperfusie en extractie, begint u door een kleine vouw huid te knijpen om te bevestigen dat de rat het juiste niveau van sedatie heeft bereikt.En bedek de ogen met Vet-zalf.Plaats het dier op een operatietafel in de rugligging.En week de buik met 70%ethanol.Maak vervolgens een centrale insnijding door de buikhuid en het buikvlies van het schaambeen tot het ribbenkast om de pleura- en buikholte bloot te leggen.Gebruik het perfusiesysteem om 0,9%zoutoplossing in de aorta abdominalis te injecteren om de nieren te spoelen.Snij de aorta af bij de buik om de bloedafvoer te helpen.Wanneer al het bloed uit de nieren is verwijderd, snijdt u de nierinlet door.Druk vervolgens op de rand van elke nier om de organen voorzichtig te ontkapselen.En breng de geëxtraheerde nieren over in vers H.B.S.S.Om een enkele niercelsuspensie te genereren, gebruikt u schaar om de helft van een nier in kleine fragmenten te snijden.Breng de weefselstukken over in een buisje van 1,5 ml en voeg 1 ml vers bereid collageenase toe aan de buis voor een incubatie van 30 minuten bij 37
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor de fenotypische en kwantitatieve analyse van residente macrofagen uit ratnieren via flowcytometrie. De resulterende gekleurde cellen kunnen voor diverse toepassingen worden gebruikt, waardoor de informatie die uit het experimentele model wordt verkregen, wordt uitgebreid.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Macrofagen spelen een cruciale rol bij de gezondheid en ziekte van de nieren.
- Flowcytometrie maakt een gedetailleerde analyse van celpopulaties mogelijk.
- Inzicht in het gedrag van macrofagen kan therapeutische strategieën informeren.
- Ratmodellen worden veelvuldig gebruikt voor het bestuderen van nierfuncties.
Doel van de studie
- Om een protocol te ontwikkelen voor het isoleren en analyseren van niermacrofagen.
- Om verder onderzoek naar macrofaagfuncties in renale contexten te vergemakkelijken.
- Om een hulpmiddel te bieden voor onderzoekers in aanverwante vakgebieden.
Gebruikte methoden
- Flowcytometrie voor celanalyse.
- Kleuringstechnieken voor de identificatie van macrofagen.
- Protocollen voor cel sorteren en genexpressieanalyse.
- Functionele studies om de activiteit van macrofagen te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van residente macrofagen uit ratnieren.
- Gedetailleerde karakterisering van macrofaagfenotypen.
- Potentiële toepassingen in genexpressie- en functionele studies.
- Verbeterd inzicht in de rol van macrofagen bij de niergezondheid.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor de analyse van macrofagen.
- Resultaten kunnen toekomstige studies naar nierziekten informeren.
- Onderzoek kan worden uitgebreid naar andere toepassingen buiten flowcytometrie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Een nauwkeurige fenotypische karakterisering van macrofaag-subsets in modellen voor nierziekten is essentieel om de risico's bij de validatie van targets in ontsteking-gedreven nierpathologie te verminderen. Dit flowcytometrie-protocol maakt kwantitatieve discriminatie mogelijk van pro-inflammatoire (M1) en immunoregulerende (M2) macrofaag-fenotypen in rattennieren, wat bijdraagt aan mechanisch inzicht in fibrose en immuunmodulatie. Door een betrouwbare methode te bieden om de bijdrage van macrofagen aan nierschade te beoordelen, versterkt deze aanpak het voorspellend vertrouwen bij de preklinische selectie van targets en de analyse van signaalroutes.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door M1/M2-macrofaagratio's in nierschademodellen te kwantificeren.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van dubbele CD45/CD68-gating met CD86/CD163-oppervlaktekleuring om macrofaagfenotypes met een hoge specificiteit te definiëren.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het minimaliseren van risico's bij targets door macrofaagpolarisatietoestanden te koppelen aan fibrose en immunoregulerende pathways.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve flowcytometrie-outputs voor de frequentie van macrofagen en markerexpressie.
- Reproduceerbaarheid: Toont een lage cellulaire mortaliteit en behouden integriteit aan, waardoor consistente fenotypische resultaten over verschillende experimenten mogelijk zijn.
- Downstream bruikbaarheid: Geïsoleerde macrofagen blijven levensvatbaar voor cel sortering, mRNA- en proteïneanalyse, wat follow-up via multi-omics ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Direct toepasbaar op ontstekingsmodellen van nierziekten waarbij macrofaagfenotypes de pathogenese aansturen.
- Translationele continuïteit: Fenotypische gegevens van gesorteerde macrofagen kunnen bijdragen aan de ontdekking van biomarkers en functionele validatie in preklinische studies.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Maakt een objectieve beoordeling mogelijk van de effecten van immunomodulerende verbindingen op de polarisatie van macrofagen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinische evaluatie en biedt immunologische read-outs die bijdragen aan lead-optimalisatie en studies naar het werkingsmechanisme in niermodellen.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing van macrofaag-gestuurde paden bij nierletsel via fenotypische kwantificering.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve macrofaagegevens die geschikt zijn voor assay-validatie en compound-screeningcampagnes.
- Analytics: Levert multiparametrische flowcytometrie-readouts (CD45+/CD68+/CD86+ voor M1; CD45+/CD68+/CD163+ voor M2) die comparatieve groepanalyse mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt macrofaag-fenotypering met downstream functionele assays en genexpressieprofilering in ziekte-relevante systemen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerde immunofenotyperingsworkflow die toepasbaar is in meerdere modellen van nierziekten en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij macrophage-gemedieerde nierschade door nauwkeurige fenotypische discriminatie mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, laag-variabele macrophage-isolatie en kleuring die compatibel is met centrale flowcytometrie-faciliteiten.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door targetmodulatie te koppelen aan meetbare verschuivingen in macrophage-polarisatie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van immunomodulerende kandidaten op basis van macrophage-fenotypemodulatie in preklinische modellen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie-compensatie, gating-strategie en validatie van macrofaanmarkers.
- Afhankelijk van toegang tot apparatuur voor collagenase-digestie en een steriele infrastructuur voor celverwerking.
- Necessiteert standaardisatie van antilichaampanelen en fluorescentiecontroles tussen locaties voor reproduceerbare M1/M2-kwantificering.
- Aanpassing aan andere weefsels kan optimalisatie van dissociatie-enzymen en markerpanelen vereisen.
- Beperkt door de beschikbaarheid van rat-specifieke macrofaanmarkers (CD86, CD163) in vergelijking met de uitgebreidere muis-repertoires.
