Name: Subcellulaire Patch-clamp opnamen in het somatodendritische Domein van nigrale Dopamine Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Leer subcellulaire patch-clamp opnamen van dendrieten van dopamine neuronen in vitro. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van ionkanaalactiviteit mogelijk voor neurobiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ik dank Dr Vincent Seutin voor zijn voortdurende steun, Christelle Gillissen en Laurent Massotte voor een uitstekende technische bijstand, Drs Jean Defourny en Sandra Ormenese voor adviezen met de confocale microscoop, Dr Jacques Destiné voor de gave van de tweede Axopatch 200B versterker, de GIGA-Imaging platform voor het delen van de confocale microscoop en Imaris software en Dr Stephen Freeman voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Belgische FRS - FNRS (U.N002.13 en T.N0015.13) en gepubliceerd met de steun van de Belgische Universitaire Stichting (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

De auteur verklaart dat hij geen concurrerende financiële belangen.

Dit rapport beschrijft een stap-voor-stap protocol dual somatodendritische whole-cell opnames en lokale dendritische opnamen voeren. Het is nuttig voor het bepalen van de invloed van ionkanalen (dwz I h) op het tijdsverloop van postsynaptische potentialen en in kaart brengen van de verdeling van het ionkanaal (Ih) langs de somatodendritische domein van nigrale DA neuronen, respectievelijk. Resulterende elektrofysiologische metingen worden gecombineerd om hoc histochemie plaatsen op celmorfologie herstellen. De procedure werd gebruikt om DA neuronen in de substantia nigra onderzoeken, maar kan worden gegeneraliseerd naburige nigrale GABA neuronen, ventrale tegmentale gebied DA neuronen en andere neuronen van de middenhersenen. Alle stappen kunnen ook worden gevolgd om andere ionkanalen, uitgedrukt in dendrieten van nigrale neuronen zonder belangrijke wijzigingen te onderzoeken. Bericht hoc visualisatie is met name relevant voor de neuronen met axon-dragendedendrieten, zoals nigrale neuronen 25,26, hippocampus Oriens-Alveus interneuronen 21 of een CA1 piramidale neuronen 67. Interessant, neuronen het delen van deze functie lijkt vaker voor dan algemeen wordt gedacht 67 te zijn. Morfologische analyse toont ook de precieze positie van de elektroden en axon. De detectie van de laatste kan worden geoptimaliseerd door de etikettering van eiwitten tot expressie gebracht in de axon eerste segment (spanningsafhankelijke Na + kanalen of Ankyrin G) met behulp van immunohistochemie 68,69. De betrouwbaarheid van de gegevens verzameld met dendritische opnames en daaropvolgende neuronale labeling steeds afhankelijk van de kwaliteit segment. Maximale inspanningen moeten derhalve worden toegepast om de levensvatbaarheid van cellen in het weefsel te behouden. Dit wordt bereikt met zachte behandeling van gezonde dieren, kwalitatief hoogwaardige gereedschappen en reagentia, voldoende zuurstofvoorziening van het weefsel en ijskoude temperaturen gedurende de voorbereiding van de schijfjes. Stabiele opname-omstandigheden een beroep doen op de selectie van gezonde neuronen. In de hele-cel functie zou serieweerstand aanvankelijk zo laag mogelijk en constant gehouden gedurende het experiment. De stabiliteit van de opnames is verder afhankelijk van hoogwaardige manipulatoren verstoken van drift en trillingen. Deze verstoringen kunnen worden gereduceerd door het optimaliseren van de pipet stabiliteit: het controleren van de verbinding met pipet houder en headstage, beheersen die micromanipulator kabels slap vermijden plotselinge temperatuurschommelingen of podium beweging en controleren van het mechanisme van de manipulator. Voor dubbele opnamen is methylsulfaat 13,15,21 opgenomen in de intracellulaire oplossing, maar gluconaat 9,14,25 alternatief kan worden toegepast. Echter, de belangrijkste anion de membraanpotentiaal 70,71 en sommige spanningsafhankelijke stroom 72 te wijzigen. Intracellulaire oplossing kan worden aangevuld met ATP, GTP en fosfocreatine de physiolo behoudengische functies van neuronen. Bovendien, het toevoegen van een fluorescerende kleurstof in de pipetoplossing (bijvoorbeeld Alexa 594 of Sulforhodamine 101 41) aan de dendrieten visualiseren tijdens een somatische opname kan nuttig zijn om bijvoorbeeld een drukuitoefening plaatsen (figuur 7 in Ref. 41) of een elektrische stimulerende pipet. De pipet oplossing-cel aangesloten opnamen bevat een hoge concentratie K + en Na + geen grote Ih opnemen. Opmerkelijk de concentratieverhouding Na + / K + beïnvloedt de amplitude 10, de omkeringspotentiaal van de huidige 11 en de gating van I h 73. Als alternatief kan ik u ook worden opgenomen met behulp van buiten-outs 10. In deze opname configuratie zonder dat door de intracellulaire milieu in de nabijheid van de kanalen worden verstoord. Bijgevolg verschillen in voltage-afhankelijke activering van I &lt;sub&gt; h werden vergelijkbare stromen verkregen met cellen verbonden patches en buiten-outs 10. Zwelling van neuronen wordt soms aangetroffen in patch-clamp en ontstaat vaak door verschillende oorzaken, zoals de lage kwaliteit van het water, sterke onbalans in osmolariteit en pH tussen de intra- en extracellulaire oplossingen 39 of fouten in de samenstelling van oplossingen. De kwaliteit van elektrofysiologische opnames heeft een directe invloed op de kwaliteit van de morfologie van teruggewonnen neuronen. Hoge weerstand somatische pipetten worden gebruikt voor dubbele opnamen (6-10 MQ, zoals in referentie 6,11.) En één somatische opnamen na-cel verbonden opnamen op de verdunning van het intracellulaire milieu 14 minimaliseren. De hele cellen somatische opname na-cel aangesloten opname dus kort gehouden (&lt;10 min). Outside-out patches van zowel de somatische en dendritische pipetten zijn essentieel voor een goede afsluiting van het cell membraan en de daaropvolgende herstel van de cel morfologie. Naast de structuur van de cel, kan de neurochemische inhoud worden bepaald voor de opgenomen neuronen 59,74. Zo kan het intracellulaire tyrosine hydroxylase worden immunolabeled voor eenduidige identificatie van DA neuronen 13. DA neuronen worden voornamelijk in de SN pars compacta, met een veel lagere dichtheid in de SN pars reticulata, waar ze worden vermengd met een groter aantal GABA neuronen 75. Terwijl het cellichaam van DA neuronen vaak groter dan die van GABA neuronen, de visuele identificatie van deze cellen met IR-videomicroscopie onzeker en gedeeltelijk belemmerd door de dekking van de pars compacta. Om deze beperkingen te omzeilen, kan de voorselectie van DA neuronen worden vergemakkelijkt door het gebruik van transgene muizen die een fluorescente merker in een specifieke populatie van neuronen (TH 65 of DAT voor DA neuronen, GADvoor GABA neuronen) en epifluorescentie verlichting. Alternatief kan een fluorescerende kleurstof in de oplossing van de somatische elektrode worden opgenomen om de visualisatie van dendrieten vergemakkelijken. Hogere resolutie van de fluorescerende cel wordt aangeboden door Nipkow draaiende schijf confocale 14,22,30 of twee-foton microscopie 7 gecombineerd om IR-DGC 6. Verscheidene voordelen gerelateerd aan DGC vergeleken met DIC. Ten eerste, zoals DIC prisma&#39;s niet nodig zijn, imago van de IR-DGC kan worden bedekt met een afbeelding fluorescentie 49,52,53,76. Ten tweede kan DGC worden gecombineerd met fotostimulering en optogenetics 77. Een nadeel van slice voorbereiding is het behoud van de integriteit van neuronen. DA neuronen breiden hun dendrieten in de drie ruimtelijke vlakken 78,79 en derhalve afknotting van de dendritische compartiment kan niet volledig worden vermeden in plakken 80. De keuze van de oriëntatie van plakjes (coronale, horizontaal of parasagittale) is een trade-off. De oorsprong van de innervatie en de proefopzet moet worden geacht om de juiste oriëntatie van de plakken te selecteren. Direct dendritische patches is de techniek om de verdeling van functionele ionkanalen kaart in de verschillende compartimenten van cellen. Daarnaast biedt deze techniek de variabiliteit in functionele eigenschappen kanalen 20 bepalen. Als aanvulling van de locatie en de dichtheid van ionkanalen kan worden vastgesteld met behulp van immunohistochemie op het Licht en elektronen microscopie niveaus 17,23. Deze benadering biedt de mogelijkheid om het kanaal dichtheid in klein kaliber structuren die niet toegankelijk zijn patch pipetten bepalen. Maar deze kanalen kan in een afzonderlijke functionele toestand 24 of zelfs inactief ten opzichte van die zijn opgenomen met patch-clamp technieken. Beide technieken zijn daarom nodig om een ​​compleet beeld van de locatie en de eigenschappen van het verkrijgen vanionenkanalen in een specifieke cellulaire gebied 17. Met de ontwikkeling van spanningsgevoelige kleurstoffen, is spanning beeldvorming gebruikt om de verspreiding van AP&#39;s en EPSPS in neuronen op meerdere locaties 81 onderzocht. Als alternatief voor dubbele patch-clamp Deze benadering kan ook worden toegepast voor dunne dendrieten die niet toegankelijk patch pipetten maar vereisen nauwkeurige kalibratie van de signaal en middeling. Terwijl DA neuronen in de SN en ventrale tegmentale gebied op grote schaal onderzocht middels somatische opnamen in de fysiologische en pathofysiologische context, de functionele eigenschappen van de dendrieten nog zwaar in beide gevallen. Patchen van dendrieten is geïmplementeerd voor nigrale dopamine neuronen door verschillende groepen met succes 13,25,26 en blijft de methode bij uitstek om prikkelbaar eigenschappen van deze fijne subcellulaire structuren 8 ontleden. Dendritische opnames zorgen voor een verdere MOGELIJKHEDEschap om de efficiëntie en de plasticiteit van synaptische transmissie en de plasticiteit van dendritische prikkelbaarheid 82,83 onderzoeken.

Neuronen ontvangen synaptische informatie voornamelijk op hun dendrieten. Prikkelende en remmende synaptische signalen verspreiden van hun plaats van generatie op de integratie plaats waar actiepotentialen (AP) worden opgeroepen als het uitgangssignaal. Onderweg wordt synaptische potentialen zowel door de structuur van dendrieten en de interactie tussen passieve en actieve membraaneigenschappen. De combinatie van deze zeer variabele parameters verbreedt de rekenkracht van neuronen 1,2. De kleine diameter van dendrieten belemmert echter de studie van hun elektrische eigenschappen. De voortdurende ontwikkeling van de patch-clamp techniek 3, hebben de optiek 4 en verfijning van methoden voor slice voorbereiding 5 gedurende de laatste decennia opnames nodig van heel dun (0,7-3 um Ø) dendrieten 6,7. Deze methoden waren en zijn nog steeds voornamelijk gebruikt om de prikkelbaarheid van dendrieten onderzoeken verschillende of neuronen 8. Direct dendritische opnamen zijn essentieel voor de distributie 9-19 en verschillen in de functionele eigenschappen van 20-22 ionkanalen in neuronale afzonderlijke compartimenten bepalen. Deze gegevens zijn de noodzakelijke aanvulling van ionkanaal distributies gedetecteerd met immunohistochemie gecombineerd om licht en elektronenmicroscopie 23,24. Dual somatodendritisch opnamen zijn genomen om de verspreiding van actiepotentialen 9,13-15,21,22,25-27 en het verspreiden van synaptische potentials 13,16,18 langs de somatodendritische domein van neuronen te verkennen, het verkrijgen van gedetailleerde passieve kabel modellen 28- 30 en onderzoek naar de temporele resolutie van neuronale integratie 31. De substantia nigra (SN) is een regio gelegen in het betrokken bij verschillende functies, zoals de controle van de beweging, de codering van beloning en gewone gedrag middenhersenen. De afname van dopamine als gevolg van de specifiekeverlies van dopaminerge (DA) neuronen in de SN is gekoppeld aan de motorische stoornissen waargenomen bij patiënten met de ziekte 32 van Parkinson. De nigrale circuit bestaat uit twee celtypes: dopaminerge en GABA-erge neuronen. Interessant is dat deze neuronen aantal specifieke kenmerken die hen onderscheiden van andere neuronen. Het axon van een groot deel van DA neuronen en sommige GABA neuronen afkomstig van een dendritische plaats aangeeft dat de dendritische as heterogeen (axon-dragende en axon ontbreekt dendrieten) 25,26,33. De morfologie van deze neuronen contrast dan de typische organisatie van neuronen waarbij de informatieoverdracht volgt de wet van dynamische polarisatie uitgezonden door Cajal: vanaf dendrieten, tot soma en uiteindelijk Axon 34. DA neuronen is ook bekend dat dopamine ontheffen van hun dendrieten 35, genereren barsten activiteit 36 en NMDA-receptor 37 plasticiteit. de dissectie van deze verschijnselen is ongrijpbaar zonder direct opnamen van de plaats waar ze worden geïnitieerd. Om inzicht te krijgen in de relatie tussen de precieze locatie en functionele eigenschappen van ionkanalen en hun rol in de dendritische prikkelbaarheid en informatie-overdracht in nigrale neuronen, directe dendritische opnames zijn de methode van keuze. Dit rapport beschrijft een gedetailleerde procedure die kan worden gebruikt voor enkele en dubbele patch-clamp van dendrieten van nigrale neuronen en de overeenkomstige post hoc biocytine labeling verkrijgen. De uitgangspunten voor het patchen van de somatische en de dendritische membraan zijn zeer vergelijkbaar. Praktisch echter opnamen van dendritische plaatsen vereisen specifieke optimalisatie in relatie tot somatische opnamen. Succesvolle dendritische opnames afhankelijk van de kwaliteit van de plakjes, optimale instelling van de optica, zwakke benadering van de patch pipet en stabiliteit van de opnames.

<table><tbody><tr><td>Double-distillated water</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>Resistivity >14 M&Omega; cm, ideaal 18,2 M&Omega; cm bij 25&nbsp;&deg;C, gefilterd (0,22 &micro;m), https://www.merckmillipore.com/BE/nl/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>Microfilterkaarsen</td><td>Robu</td><td>Porositeit 3, 6 mm of 13 mm diameter</td><td></td></tr><tr><td>Weefselsnijder met vibroprobe</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>snijparameters: snelheid 0,07, amplitude 1,40</td></tr><tr><td>Weefselsnijder</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000</td><td>snijparameters: snelheid 4, frequentie 7</td></tr><tr><td>Vleesmesjes</td><td>Gilette</td><td>Super Silver</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie-instrumenten</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reservekamer</td><td></td><td></td><td>Op maat gemaakt</td></tr><tr><td>PP bekers</td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Spuitfilter</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0,22 &micro;m</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylaatlijm&nbsp;</td><td>UHU</td><td>"Sekunden Kleber"</td><td>vloeibare lijm</td></tr><tr><td>Opnamekamer&nbsp;</td><td>Luigs &amp; Neumann</td><td>Slice mini kamer</td><td></td></tr><tr><td>Horizontaal pipettrekker</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2 mm buitendiameter/1 mm binnendiameter glazen capillaire buisjes, uiteinden gebrand en gepolijst, gewassen</td></tr><tr><td>Tandartswas</td><td>Colt&egrave;ne/Whaledent</td><td></td><td>orthodontische schaal wax strips</td></tr><tr><td>Platinum rooster</td><td></td><td></td><td>om plakjes in de opnamekamer te verankeren, op maat gemaakt met een platina schijf</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>om pipetpunten te branden en te polijsten</td></tr><tr><td>Kaliummethylsulfaat</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>Biocytine</td><td>Molecular probes</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>Manometer</td><td>GREISINGER electronic</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt Gradient Contrast</td><td>Luigs &amp; Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulators</td><td>Luigs &amp; Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>Frame grabber</td><td>The Imaging Source</td><td>DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>Condensor</td><td>Zeiss</td><td></td><td>condensor met hoge numerieke apertuur werkend met olie</td></tr><tr><td>Objectief</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63X vergroting, lange afstand, hoog numeriek objectief met een apertuur van 1,0 water-immersie</td></tr><tr><td>Viervoudige wissel</td><td>Luigs &amp; Neumann</td><td></td><td>tussen de camera en de microscoop</td></tr><tr><td>Zwart &amp; witte videomonitor</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16-inch, 850 TV-lijnen, analoog</td></tr><tr><td>Monsterflessen, Amberglas, met Dop</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>om plakjes over te brengen van de setup naar de histologiekamer</td></tr><tr><td>The Axon Guide</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Boek</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>Analyse van elektrofysiologische data</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>zie VEUILIJKHEIDSDATABLAD en Richtlijn Gevaarlijke Stoffen (EU) voor gebruik</td></tr><tr><td>Welpencel kweekplaat</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>voor het kleuren van vaste plakjes</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>zie VEUILIJKHEIDSDATABLAD en Richtlijn Gevaarlijke Stoffen (EU) voor gebruik</td></tr><tr><td>muis anti-TH monoklonaal primair</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>werkconcentratie: 1/1.000</td></tr><tr><td>geit anti-muis secundair antilichaam - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>werkconcentratie: 1/500</td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade</td><td>Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceïne Avidine DCS</td><td>Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td><td>plugin voor ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>Reconstructie van biocytine gevulde neuronen</td></tr><tr><td>Neuromantic</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td><td>Reconstructie van biocytine gevulde neuronen</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>Analyse van elektrofysiologische data</td></tr></tbody></table>

subcellulaire patch-clamp opnamen in het somatodendritische domein van nigrale dopamine neuronen

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrieten van dopaminerge neuronen te ontvangen en over te brengen synaptische input, ondersteuning actiepotentiaal back-vermeerdering en neurotransmitter release. Inzicht in deze fundamentele functies zal licht werpen op de uitwisseling van informatie in deze neuronen. Dendritische patch-clamp opnamen bieden de mogelijkheid om de elektrische eigenschappen van dendrieten en de onderliggende voltage-gated ionkanalen direct te onderzoeken. Echter, deze fijne structuren zijn moeilijk toegankelijk voor patch pipetten vanwege hun kleine diameter. Dit rapport beschrijft een stap-voor-stap procedure voor stabiele en betrouwbare opnames van de dendrieten van dopaminerge neuronen in acute plakjes verzamelen. Elektrofysiologische metingen worden gecombineerd met post hoc herstel van de morfologie van de cel. Succesvolle experimenten afhankelijk betere voorbereiding van segmenten, oplossingen en pipetten, adequate aanpassing van de optica en stabiliteit van de pipet in contact met de structuur opgenomen. Standard beginselen van de somatic patch-clamp-opname worden toegepast op dendrieten, maar met een zachtere aanpak van de pipet. Deze veelzijdige technieken kunnen worden toegepast op verschillende vragen over de prikkelbaar eigenschappen van dendrieten aan te pakken.

De hierboven beschreven protocol is van plan om het verzamelen van gegevens met behulp van dendritische patch-clamp opnames te vergemakkelijken. Deze techniek, gecombineerd met een post hoc histochemie, helpt om inzicht te krijgen in de mechanismen van de vele elektrische signalen uit of zich naar dendrieten. Directe toegang tot dendrieten met patch pipetten is moeilijk, maar speciale aandacht voor een aantal methodologische aspecten zal het slagingspercentage van de opnames te verbeteren. Een onderzoeker voldoende ervaring in stabiele somatische opname kunnen verwachten dat een hoge weerstand (GQ) zegels en complete experimenten te verkrijgen over de meeste pogingen. Een tot twee hoogwaardige dendritische opnames kunnen worden verzameld per dissectie. De beschikbaarheid van hoogwaardige hersencoupes met gezond somata en dendrieten is vereist bij onderstaande structuren (Figuur 1). de -criteriaeen voor het selecteren van deze neuronen zijn een glad en homogeen oppervlak over de hele cel en een soma en dendrieten met weinig contrast wanneer waargenomen met optimale aangepast optiek (Figuur 1A en 1B). Het selecteren van neuronen te sterk algemeen contrast leidt tot onstabiele opnames (figuur 1C en 1C). Dus deze neuronen worden vermeden. In vergelijking met andere neuronen, nigrale DA neuronen Specifieke morfologische en elektrofysiologische kenmerken. Deze functies meestal gemeten met een somatische pipet kan ook worden waargenomen in dubbele somatische (figuur 2) en somatodendritische opnamen (figuur 3). Lange hyperpolarizing huidige injecties leiden tot een membraanpotentiaal rectificatie genaamd &#39;sag&#39; (Figuren 2B en 5D). Het axon oorsprong, in de meeste gevallen op een dendritische site geïdentificeerddie complementaire criteria 13,25,26, wat aangeeft dat de dendritische compartiment deze neuronen heterogeen (Figuur 3A - 3B). Bijgevolg, de ruimte waarin de eerste AP wordt waargenomen correspondeert met het compartiment waar de axon komt (Figuur 3C - 3D) 13,25,26. Het axon wordt doorgaans beëindigd door een axonaal bleb door een stek van de axon tijdens het snijden 64, maar deze structuur is niet systematisch gedetecteerd. De uitgesproken sag waargenomen in nigrale DA neuronen volgend op de activering van I h suggereert een hoge expressie van HCN subeenheden. Om de invloed van I h over de integratie van synaptische signalen te bepalen, werden synaptische-achtige stroom (EPSC) golfvormen gegenereerd en via de dendritische registratie-elektrode geïnjecteerd tijdens somatodendritisch dual-opnamen 55 (&lt;strong&gt; Figuur 4). De kinetiek van deze gesimuleerde EPSCs waren gebaseerd op de opkomst en verval tijd constanten van echte spontane EPSCs. Het verkregen aEPSP werd opgenomen met de somatische elektrode. Bath toepassing van de Ih blocker ZD 7288 vergroot de duur van de aEPSP, waarin de bijdrage van Ih het tijdsverloop van synaptische signalen (Figuur 4B). ZD 7288 afgeschaft eveneens de membraanpotentiaal rectificatie bevestigt dat de sag resultaten van de activering van I h (Figuur 4C). De met gesimuleerde EPSPS resultaten kunnen worden gecorreleerd met experimenten met elektrisch opgewekte EPSPS 65. De precieze verdeling van het kanaal in de somatodendritisch domein van DA neuronen in kaart werden cellen gevoegd opnamen uitgevoerd (figuur 5). Een hoge weerstand afdichting (&gt;&gt; 1 GQ) is een absolute noodzaak voor de cel bevestigd opnamen (Figuur 5B </strong&gt;). In dendrieten van de DA neuronen, ik h activeert langzaam met lange hyperpolarizing spanning stappen en de huidige steady-state wordt bereikt na honderden ms (figuur 5C), zoals eerder aangegeven 66. Deze waarneming geeft aan dat HCN kanalen uitgedrukt in dendrieten DA neuronen verschillende subeenheden in vergelijking met die in piramidale neuronen of andere celtypen 10,16,66. Aangezien de verdeling van het kanaal niet-homogene zou kunnen worden in de dendritische compartiment en zoals de dendritische compartiment is zelf heterogene, de identiteit van de dendriet (axon-dragende of nonaxon dragende dendrite) wordt onthuld door het IR-beeld-DGC te vergelijken met de confocale afbeelding na biocytine kleuring (Figuur 3A en B). Herstel van celmorfologie is daarom noodzakelijk voor zowel dual somatodendritisch opnames en voor cel bevestigd opnamen via latere somatische whole-cell opnames. Figuur 1. Het visualiseren van het Soma en proximale dendrieten van nigrale dopaminerge neuronen Met behulp van infrarood videomicroscopie. (A) IR-DGC beeld van een nigrale DA neuron die de soma en proximale dendrieten en zowel somatische en dendritische pipetten. Een dubbele somatodendritische opname werd succesvol uitgevoerd op deze gezonde neuron. Observeer de lage contrast en het gladde oppervlak hele somatodendritische domein van de cel. (B) Een ander voorbeeld van een gezonde DA neuron. (C) DA neuron met een ruwere en oneffen oppervlak en een groter contrast. Terwijl een dubbele opname is verkregen, de stabiliteit niet optimaal en de opnameduur was kort (~ 15 minuten) door een geleidelijke verhoging van de toegankelijkheid weerstand op beide pipetten. (D) Tweede voorbeeld van een DA neuron met een sterk contrast soma en proximale dendrite. In dit geval werd een sterke toename van de weerstand kort toegang waargenomen na de breuk in het whole-cell modus. Een poging om de toegang tot weerstand door negatieve druk te verlagen is mislukt. Neuronen in paneel C en D kunnen zijn beschadigd tijdens het snijden procedure en moet worden vermeden experimenten. (E) gelijktijdig dubbele somatische opname in een gezonde DA neuron aan het begin van de opname. (F) Hetzelfde neuron zoals in paneel E met een gezwollen cel lichaam na ~ 17 min. Let op de volledige afwezigheid van contrast, de bal-achtige uiterlijk van de soma en de aanwezigheid van de grote kern niet waarneembaar is bij gezonde neuronen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> Figuur 2. </strong&gt; Gelijktijdige Double Somatische Opnemen van een DA Neuron. (A) IR-DGC afbeelding tijdens dubbele somatische opname van een DA neuron. (B) hyperpolarizing en depolariserende 1 s lang lopende injecties (-160 tot 80 pA, verhogen 80 PA) en overeenkomstige spanning veranderingen gelijktijdig opgenomen met zowel een patch pipetten. Let op de aanwezigheid van de sag in de spanning spoor met de lange hyperpolarizing huidige stap en de grote na-hyperpolarisatie na de AP tijdens de depolariserende stroomstoot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> Figuur 3. Dual S omatodendritic Opname in een DA Neuron. (A) IR-DGC beeld van een DA neuron. De afstand tussen de dendritische en somatic pipet is 29 micrometer. (B) Confocale z-projectie beeld van het neuron in paneel A label met avidine geconjugeerd aan fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC). De neuron was gevuld met biocytine tijdens het opnemen. Het axon afkomstig van een proximaal dendriet dichtbij de soma zoals aangegeven door de pijl. (C) Gelijktijdige dual somatodendritische whole-cell voltage opname van de neuron in panel A. AP opgenomen in de soma (zwarte spanning sporen) en dendriet (rood spanning sporen) in reactie op een 1 s lang stroominjectie stap via de somatische (linker, zwarte bes sporen) en als alternatief dendritische pipet (rechts, rood huidige trace) (D) somatische en dendritische AP getoond uitgebreid tijdschaal.. Bij beide somatische of dendritische huidige injectie, de somatische AP (zwart) vooraf aan de dendritische AP (rood). De vertraging tussen AP&#39;s in deze neuron bedroeg 120 microseconden en 210 microseconden met somatische en dendritische huidige injectie, respectievelijk. vertragingenwerden gemeten bij AP halfmaximale amplitude tijdens de stijgende fase van het AP. De AP wordt eerst waargenomen in het compartiment in de buurt van waar de axon naar voren komt, wordt bevestigd eerdere opmerkingen 25,26. In dit geval wordt de dendritische opname gemaakt van een axon-dendriet ontbreekt. Een voorbeeld van een opname van een axon-dragende dendriet is in Ref. 13 (in de fig. 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> Figuur 4. Voortplanting van Kunstmatige EPSPS Langs de somatodendritische As van DA neuronen. (A) IR-DGC beeld van een DA neuron. De afstand tussen de dendritische en somatische pipet 45 urn. Beide patch pipetten zijn in de hele cel current-clamp opnamemodus. (B) Currentopgenomen met dendritische pipet huidige-clamp en gebruikt om de kunstmatige EPSP (boven) genereren. De stroom wordt verkregen door de injectie van een EPSC-achtige golfvorm (τ stijging = 0,6 ms verval τ = 3 ms; amplitude = 100 pA) via de dendritische opname pipet 55. Aan de onderkant, gepropageerd aEPSPs opgenomen in de soma onder controle omstandigheden (zwart) en na het bad toepassing van het I h blocker ZD7288 (30 micrometer; red trace). Elke spanning spoor is het gemiddelde van 40 enkele sweeps. Let op de grote toename van EPSP duur in aanwezigheid van ZD7288 met vermelding van de bijdrage van I h naar het tijdsverloop van EPSPS. (C) Spanning sporen opgenomen van de soma onder controle omstandigheden (zwart) en na het aanbrengen van 30 uM ZD 7288 ( rood) in antwoord op een lange (30 pA, 1 s) hyperpolarizing huidige stap. Let op de afwezigheid van de membraanpotentiaal rectificatie (sag) na de blokkering van I &lt;sub&gt; h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> Figuur 5. Aanwezigheid van I h in Dendrieten van DA Neuron. (A) IR-DGC beeld van een DA neuron en pipet op proximale dendriet. (B) en capacitieve lekstromen tijdens een 5 mV spanning commando in-cell bijgevoegde configuratie. De afdichting verzet 5 GQ in dit voorbeeld (C) hyperpolarisatie spanningsstap. (90 mV; top) van een membraan potentiaal van 0 mV induceerde een langzaam activerende I h. De huidige trace werd omgekeerd en uitgerust met een enkele exponentiële functie die een tijd constante van τ = 632 ms. (D) Spanningreacties van de hele-cel opgenomen soma (panel A) tot 1 s hyper- en depolariserende stroompulsen (-160 tot 120 pA, 40 pA increment). De somatische whole-cell opname werd uitgevoerd nadat de cellen gehecht opname. Let op de afwezigheid van AP door het extracellulaire toepassing van TTX en Cd2 + spontane vuren onderdrukken in cellen gevoegd opname. Deze spanningsafhankelijke Na + en Ca 2+ stroom blokkers werden toegevoegd aan actie stromen onderdrukken. Panelen A - D van dezelfde neuron (E) IR-DIC beeld van een DA neuron en een dendritische pipet (F) Spanningsafhankelijke stromen door een testpuls geactiveerd om 0 mV van een 50 ms prepulse bij -120 mV.. in een outside-out patch uitgesneden uit de proximale dendrieten van het neuron in paneel E. Holding potentieel -80 mV. Let op de tijdsafhankelijke inactivatie van de huidige. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere weergave</a>versie van deze figuur. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stof </td><td> g / mol </td><td> Concentratie </td><td> voor 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 125 mM </td><td> 7,305 g </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2.100 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,551 </td><td> 2,5 mM </td><td> 0,186 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137,99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,172 g </td></tr><tr><td> glucose </td><td> 198,17 </td><td> 25 mM </td><td> 4,95 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (oplossing) </td><td> 1 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (oplossing) </td><td> 2 mM </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolariteit: ~ 310 mOsmol / L (optimaal bereik: 314-325 mOsmol / l), pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stof </td><td> g / mol </td><td> Concentratie </td><td> voor 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 87 mM </td><td> 5,084 g </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2,1001 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 7,551 </td><td> 2,5 mM </td><td> 0,18637 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137,99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,17248 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (oplossing) </td><td> 7 mM </td><td> 7 mL </td></tr><tr><td> glucose </td><td> 198,17 </td><td> 10 mM </td><td> 1,9817 g &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> sucrose </td><td> 342,29 </td><td> 75 mM </td><td> 25,672 g </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (oplossing) </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolariteit: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabel 2: Sucrose-ACSF plakjes bereiden. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stof </td><td> g / mol </td><td> Concentratie </td><td> voor 100 ml </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150,2 </td><td> 120 mm </td><td> 1,8024 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 20 mM </td><td> 0,14912 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (oplossing) </td><td> 2 mM </td><td> 200 gl </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551.1 </td><td> 2 mM </td><td> 0,1102 g </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523,2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,02661 g </td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255.1 </td><td> 5 mM </td><td> 0,1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380,4 </td><td> 0,1 mM </td><td> 3,803 mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 g </td></tr><tr><td> biocytine </td><td> 1 mg / mL </td><td></td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolariteit: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7,2 ingesteld met KOH </td></tr></tbody></table> Tabel 3: Intracellulaire oplossing voor dubbele opnamen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stof </td><td> g / mol </td><td> Concentratie </td><td> voor 100mL </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 120 mm </td><td> 0,8947 g </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (oplossing) </td><td> 2 mM </td><td> 200 gl </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (oplossing) </td><td> 1 mM </td><td> 100 gl </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 </td></tr><tr><td> TEA-Cl </td><td> 165,7 </td><td> 20 mM </td><td> 0,3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94,11 </td><td> 5 mM </td><td> 0,04705 g </td></tr><tr><td> BaCl2 </td><td> 244,26 </td><td> 1 mM </td><td> 0,02443 g </td></tr><tr><td> CdCl2 </td><td> 183,32 </td><td> 0,02 mM </td><td> 0,3666 mg </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mM </td><td> 200 nM </td><td> 20 gl </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolariteit: ~ 290 mOsmol / L aanpast met D-glucose (Ref. 16); pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabel 4: Elektrode oplossing voor cel verbonden opnamen.

Subcellulaire patch-clamp opnames bieden de mogelijkheid om de functionele eigenschappen van dendrieten te onderzoeken. Deze fijne structuren zijn echter niet gemakkelijk toegankelijk vanwege hun kleine diameter. Het hier beschreven protocol is bedoeld om het verzamelen van stabiele en betrouwbare opnames van de dendrieten van dopamine neuronen in slicen in vitro te vergemakkelijken.

Subcellulaire Patch-clamp opnamen in het somatodendritische Domein van nigrale Dopamine Neuronen

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de neurobiologie, zoals de vraag hoe individuele spanningsafhankelijke ionkanalen bijdragen aan de functies van een specifiek neuron. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de functie van ionkanalen op subcellulair niveau in neuronen in kaart te brengen. Begin deze procedure door de hersenen te plaatsen op een petri dish van 9 centimeter waarvan de bodem is bedekt met een laag SiliGuard.Omring het brein vervolgens met ijskoud sucrose-ACSF. Maak voor het bereiden van coronale coupes twee sneden om het cerebellum en het rostrale deel van het brein te verwijderen. Breng daarna cyanoacrylaatlijm aan op de monsterhouder en lijm het breinblok aan de houder zodanig dat het rostrale deel naar het snijvlak is gericht.Breng vervolgens een paar druppels sucrose-ACSF aan op de hersenen en dompel de tray langzaam onder in de snijkamer. Stel daarna het scheermesblad in onder een hoek van 15 graden ten opzichte van het horizontale vlak. Snijd coronale hersensecties van ongeveer 500 micrometer in caudale neusrichting voordat de substantia nigra wordt bereikt.Pas vervolgens de dikte aan om plakjes van 300 micrometer te snijden die het interessegebied bevatten. Scheid de plakjes van het weefselblok met een zeer dunne perfusienaald die parallel aan de rand van het scheermes aan een spuit is bevestigd. Breng de plakjes daarna gedurende één uur over naar de reservekamer bij 34 graden Celsius.Breng bij deze procedure een hersensectie over naar de opnamekamer. Veranker de sectie op de bodem van de opnamekamer met een platinaring en zorg ervoor dat de sectie van goede kwaliteit is met een glad, gelijkmatig oppervlak. Selecteer vervolgens een neuron met een dendriet die zich over een lange afstand in hetzelfde vlak uitstrekt, en zorg dat de betreffende dendriet tot aan een duidelijk gedefinieerd soma kan worden gevolgd.Vul vervolgens de patchpipet met elektrodensolutie. Om de dendriet in cell-attached modus te patchen, identificeert u een deel van de dendriet en stelt u dit scherp. Oefen een positieve druk uit op de pipet en laat deze naar beneden zakken met behulp van de micromanipulator.Plaats vervolgens de pipet dicht bij het membraan en pas de druk aan om een kleine inkeping (dimple) te creëren. Laat daarna de druk op de pipetpunt los en maak een patch van de dendriet, terwijl de pipetweerstand wordt gecontroleerd. Probeer voor cell-attached opnames een sealweerstand van meer dan één gigaohm te verkrijgen, bij voorkeur tussen drie en tien gigaohms.Trek daarna de pipette een paar micrometer terug van het membraan om deformatie van de dendriet te voorkomen. De actiestromen die hier te zien zijn, vertegenwoordigen de spontane actiepotentialen van nigrale neuronen. Om de actiestromen te onderdrukken, voegt u calcium- en natriumkanaalblokkers toe aan de ACSF.Pas vervolgens een voltagesprong van 90 millivolt toe, vanaf een holdpotentiaal van nul millivolt, om de hyperpolarisatie-geactiveerde kationstroom op te wekken. Verbreek aan het einde van de registratie de patch om de whole-cell modus te bereiken. Trek daarna de dendritische pipet langzaam en voorzichtig uit het neuronale membraan om een outside-out patch te verkrijgen.Om in whole-cell modus op te nemen vanuit het overeenkomstige soma, lokaliseer dan het soma dat bij de dendriet hoort. Breng een pipet met een weerstand tussen de vijf en tien megaohm, gevuld met een kaliumgebaseerde intracellulaire oplossing, naar het cellichaam. Pas vervolgens een korte negatieve druk toe op de pipetpunt om het membraan te doorbreken en zo de whole-cell modus te bereiken.Controleer de identiteit van het neuron in current-clamp modus door lange hyperpolariserende en depolariserende stroomstappen toe te passen, en laat biocytine uit de pipet langs de dendrieten diffunderen. Trek na 10 minuten de pipet terug om een outside-out patch te verkrijgen. Gebruik een reeks korte zijwaartse opwaartse bewegingen zodra de pipet zich boven de slice bevindt, om een correcte sluiting van het celmembraan te bevorderen en de opnamekamer volledig te verlaten.Houd de slice nog 15 minuten in de opnamekamer in standaard ACSF om het biocytine en het geregistreerde neuron te laten equilibreren. Breng de slice vervolgens voorzichtig over naar een amberkleurige glazen fles van 25 milliliter met standaard ACSF voor histologie. Lokaliseer bij deze procedure het fluorescentie-gelabelde neuron in de slice ruwweg met epifluorescentie.bestudeer kort de dendritische arborisatie van neuronen en lokaliseer het axon en de axonale bleb met behulp van een 10X objectief. Schakel vervolgens over naar de confocale microscoop en selecteer de 488 nanometer laserdiode om het gelabelde neuron te exciteren. Volg de extensie van het axon en de dendrieten in de Z-as en neem opeenvolgende beelden op om een Z-stack van de gehele cel te verkrijgen.Pas de resolutie van de Z-as aan en verzamel de confocale beelden van de cel bij een lage en een hoge vergroting. Open aan het einde het beeldbestand van het neuron met een beeldbewerkingssoftware. Vergelijk de Z-projectieafbeelding visueel met een IR-DGC-afbeelding om de exacte positie van de patchpipet tijdens de elektrofysiologische registratie te bepalen.Hier wordt het IR-DGC-beeld van een dopamineneuron en een pipet op de proximale dendriet getoond. Het stroomspoor toont de capaciteit van de EN-lekkagesstroom in reactie op een spanningscommando van vijf millivolt, in een cell-attached configuratie, met een zegelweerstand van vijf gigaohm. Een hyperpolariserende spanningsstap, vanuit een membraanpotentiaal van nul millivolt, induceerde een langzaam activerende hyperpolarisatie-geactiveerde kationstroom.De huidige trace werd omgekeerd en gefit met een enkelvoudige exponentiële functie, wat een tijdconstante van 632 milliseconden opleverde. Hier zijn de spanningsresponsen van de hele cel geregistreerd in het soma op hyperpolariserende en depolariserende stroompulsen van één seconde, in aanwezigheid van spanningsafhankelijke natrium- en calciumstroomblokkers om actiepotentialen tijdens de cell-attached registratie te elimineren. Zodra men de techniek beheerst, kan dit in één dag worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gezond weefsel en stabiele registratiecondities te verkrijgen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunohistochemie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de identiteit van het geregistreerde neuron. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van de neurofysiologie om de functie, eigenschappen en rol van spanningsafhankelijke ionkanalen in prikkelbare cellen te onderzoeken.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de distributie van stromen die door voltage-afhankelijke ionkanalen in dendrieten vloeien, kunt registreren en onderzoeken.

subcellular-patch-clamp-recordings-from-somatodendritic-domain-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video laten we zien hoe een geleiding toe te passen in een dopaminerge neuron opgenomen in de whole cell configuratie in hersenen van de rat plakjes. Deze techniek heet de dynamische klem.

Toepassing van een NMDA-receptor Conductance in Rat middenhersenen dopaminerge neuronen Met behulp van de Dynamic clamp techniek

De amperometrische techniek meet dopamine afgifte van een enkele cel door het detecteren van de stroom die door oxidatieve spontane dopamine oxidatie. Gelijktijdig spanning klem en amperometrie methodologie onthullen de mechanistische relatie tussen de totale "activiteit" van dopamine transporter en de regulerende rol van deze activiteit op de achterzijde transport van dopamine.

Single Cell Meting van dopamine-afgifte met gelijktijdige Voltage-klem en amperometrie

This video demonstrates a technique for patch-clamp recording from the dendritic membrane surface. This helps to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels in dopaminergic neurons.

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

This video demonstrates the procedure for performing electrophysiological recordings in substantia gelatinosa (SG) neurons of spinal cord slices, using whole-cell patch-clamp techniques to analyze neuron firing patterns. This method allows the study of neural responses to stimuli in SG neurons of the spinal cord.

Whole-Cell Patch Clamp Recording in a Substantia Gelatinosa Neuron of a Spinal Cord Slice

This video demonstrates the examination of sensory neuron excitability in the dorsal root ganglia using the patch clamp technique to measure the rheobase and membrane potential, analyzing the neurons' responses to incremental current injections.

Whole-Cell Patch Clamp Recordings on Intact Rat Dorsal Root Ganglia

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Dit manuscript beschrijft hoe intacte dorsale wortelganglia voor patch clamp-opnames kunnen worden voorbereid. Deze voorbereiding behoudt de micro-omgeving voor neuronen en satellietgliacellen, waardoor de fenotypische en functionele veranderingen die worden gezien bij gebruik van gedissocieerde DRG-neuronen, worden vermeden.

Patch Clamp Recordings op intacte ganglia van volwassen ratten

Dit protocol laat zien hoe whole-cell patch clamp opname uit te voeren op het netvlies neuronen uit een flat-mount voorbereiding.

Patch Clamp Registratie van Starburst amacrine Cellen in een flat-mount voorbereiding van Deafferentated Mouse Retina

Dit protocol beschrijft de kritische stappen en voorzorgsmaatregelen moeten uitvoeren van eencellige multiplex omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie na patch-clamp. Deze techniek is een eenvoudige en effectieve methode voor het analyseren van het profiel van de expressie van een vooraf vastgesteld samenstel van genen van een enkele cel gekenmerkt door patch-clamp recordings.

Eencellige Multiplex omgekeerde transcriptie Polymerase-kettingreactie na Patch-clamp

Hier worden methoden gepresenteerd die gedetailleerde instructies geven voor het ontleden, dissociëren, kweken en patch-clamp-opname van vestibulaire ganglion- en spiraalvormige ganglionneuronen van het binnenoor.

Isoleren en kweken van vestibulaire en spiraalvormige ganglion somata van neonatale knaagdieren voor patch-clamp opnames

Leer subcellulaire patch-clamp opnamen van dendrieten van dopamine neuronen in vitro. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van ionkanaalactiviteit mogelijk voor neurobiologisch onderzoek.

Subcellulaire Patch-clamp opnamen in het somatodendritische Domein van nigrale Dopamine Neuronen

Meer video's verkennen