Subcellulaire Patch-clamp opnamen in het somatodendritische Domein van nigrale Dopamine Neuronen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van de neurobiologie, zoals hoe individuele voltage-afhankelijke ionenkanalen bijdragen aan de functies van een specifiek neuron. Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de functie van ionenkanalen op subcellulair niveau in neuronen in kaart te brengen. Begin deze procedure door de hersenen op een 9 centimeter petrischaal te plaatsen met de bodem bedekt met een laag SiliGuard.

Omring vervolgens de hersenen met ijskou sucrose-ACSF. Om coronale plakken te maken, maak twee sneden om het cerebellum en het rostrale deel van de hersenen te verwijderen. Breng vervolgens cyanoacrylaatlijm aan op de monsterlade en lijm het hersenblok op de lade zodat het rostrale deel naar de snijfas gericht is.

Breng vervolgens een paar druppels sucrose-ACSF op de hersenen aan en dompel de lade langzaam onder in de snijkamer. Pas daarna de scheermesjes aan op een hoek van 15 graden ten opzichte van het horizontale vlak. Snijd coronale hersenplakken van ongeveer 500 micrometer in de richting van de Cottle-neus voordat u de substantia nigra bereikt.

Vervolgens past u de dikte aan om 300 micrometer plakken te snijden die het gebied van belang bevatten. Scheid de plakken van het weefselblok met een zeer dunne profusie-naald die aan een spuit is bevestigd, parallel aan de rand van het scheermesje. Breng vervolgens de plakken over naar de reservekamer bij 34 graden Celsius gedurende één uur.

In deze procedure brengt u een hersenplak over naar de opnamekamer. Bevestig de plak aan de bodem van de opnamekamer met een platina ring en zorg ervoor dat de plak van goede kwaliteit is met een glad, egaal oppervlak. Selecteer vervolgens een neuron met een dendriet die zich over een lange afstand in hetzelfde vlak uitstrekt en zorg ervoor dat de dendriet van belang tot een goed gedefinieerd soma kan worden gevolgd.

Vul vervolgens de patchpijp met elektrode-oplossing. Om de dendriet in cell-attached mode te patchen, identificeer en focus op een deel van de dendriet. Breng positieve druk op de pijp aan en laat deze zakken met behulp van de micro manipulator.

Positioneer vervolgens de pijp dicht bij het membraan en pas de druk aan om een kleine kuil te creëren. Laat vervolgens de druk op de pijptip los en patch de dendriet, terwijl u de weerstand van de pijp controleert. Probeer een verzegelingsweerstand groter dan één gigaohm te verkrijgen, het beste tussen drie en tien gigaohms, voor cell-attached opnames.

Trek vervolgens de pijp enkele micrometer van het membraan af om vervorming van de dendriet te voorkomen. De actiestromen die hier worden gezien, vertegenwoordigen de spontane actiepotentialen van nigrale neuronen. Om de actiestromen te onderdrukken, brengt u calcium- en natriumkanaalblokkers aan op ACSF.

Breng vervolgens een voltagestap van 90 millivolt aan, vanaf een houdpotentiaal van nul millivolt, om de hyperpolarisatie-geactiveerde kationenstroom op te roepen. Aan het einde van de opname scheurt u de patch om de whole cell-modus te bereiken. Daarna trekt u langzaam en voorzichtig de dendritische pijp uit de neuronale membraan om een outside-out patch te verkrijgen.

Om van het corresponderende soma in de whole-cell modus op te nemen, lokaliseert u het corresponderende soma van de dendriet. Laat een pijp met weerstand tussen vijf en tien megaohms met een kalium-gebaseerde intracellulaire oplossing zakken naar het cellichaam. Breng vervolgens een korte negatieve druk aan op de pijptip om het membraan te scheuren en zo de whole-cell modus te bereiken.

Controleer de identiteit van het neuron in de current-clamp modus door lange hyper- en depolariserende stroomstappen toe te passen, en laat biocytine uit de pijp diffunderen langs de dendrieten. Trek na 10 minuten de pijp terug om een outside-out patch te verkrijgen. Gebruik een reeks korte laterale opwaartse bewegingen om de goede sluiting van de celmembraan te bevorderen, zodra de pijp boven de plak is, om volledig uit de opnamekamer te komen.

Houd de plak nog eens 15 minuten in de opnamekamer in standaard ACSF om het evenwicht van de biocytine en het opgenomen neuron mogelijk te maken. Breng vervolgens de plak voorzichtig over in een 25 milliliter amberkleurige glazen fles met standaard ACSF voor histologie. In deze procedure lokaliseert u ruwweg het fluorescerend gelabelde neuron in de plak met epifluorescentie.

Onderzoek kort het dendritische arbor van neuronen en lokaliseer de axon en axonale blaasje met een 10X objectief. Schakel vervolgens over naar de confocale microscoop en selecteer de 488 nanometer laserdiode om het gelabelde neuron op te wekken. Volg de uitbreiding van de axon en dendrieten in de Z-as en neem opeenvolgende beelden op om een Z-stack voor de hele cel te verkrijgen.

Pas de resolutie van de Z-as aan en verzamel de confocale beelden van de cel bij een lage en hoge vergroting. Open aan het einde het beeldbestand van het neuron met een beeldverwerkingssoftware. Vergelijk de Z-projectie afbeelding met een IR-DGC afbeelding met het blote oog om de precieze positie van de patchpijp tijdens de elektrofysiologische opname te lokaliseren.

Hier is de IR-DGC afbeelding van een dopamine neuron en een pijp op de proximale dendriet. De stroomcurve toont de capaciteit van de EN lekkagestromen in reactie op een vijf millivolt voltage commando, in cell-attached configuratie, met een verzegelingsweerstand van vijf gigaohms. Hyperpolariserende voltagestap, vanaf een membraanpotentiaal van nul millivolt, induceerde een langzaam activerende hyperpolarisatie-geactiveerde kationenstroom.

De stroomcurve werd omgekeerd en voorzien van een enkele exponentiële functie, waardoor een tijdconstante van 632 milliseconden werd verkregen. Hier zijn de spanningsresponsen van het whole cell opgenomen soma naar een seconde hyper- en depolariserende stroomstoten in de aanwezigheid van voltage-afhankelijke natrium- en calciumstroomblokkers om actiepotentialen tijdens cell-attached opname te verwijderen. Zodra deze techniek is beheerst, kan deze in één dag worden uitgevoerd, als deze correct wordt uitgevoerd.