Geautomatiseerde Robotic Dispensing Techniek voor Surface Oriëntatie- en Bioprinting van Cellen
18 november 2016
Dit protocol beschrijft een bioprinting-methodologie met behulp van een geautomatiseerd robotsysteem voor het afzetten dat geëtste topografische geleidingssignalen combineert met de nauwkeurige afzetting van een hydrogel bio-inkt dat cellen bevat. De gedrukte cellen worden direct afgeleverd bij de geëtste kenmerken en kunnen deze waarnemen en er zich op oriënteren.
Het algemene doel van deze geautomatiseerde robotische dispensertechniek is om een oppervlak te creëren voor topografische celgeleiding en vervolgens cellen af te leveren naar deze functies volgens een geprogrammeerd patroon, waardoor er controle mogelijk is over celgedrag en -verdeling. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van biomedische techniek te beantwoorden, zoals hoe oppervlaktetopologieën het celgedrag kunnen beïnvloeden, zowel in monocultuur als in co-cultuur. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het minder tijdrovend is om het patroon voor celgeleiding te programmeren en af te drukken in vergelijking met meer gevestigde methoden.
Het omvat ook de stap voor gecontroleerde celdispensering. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we ons realiseerden dat 2D-patronen van cellen die in hydrogels waren afgezet, baat zouden hebben bij oppervlaktegeleiding. Daarom ontwikkelden we deze techniek om hydrogels op een manier af te drukken die overeenkwam met de oppervlaktekenmerken.
Dit protocol beschrijft het gebruik van een robotisch dispensersysteem met terugdrukondersteuning als een oppervlakte-ets- en extrusiegebaseerde bioprinter. Om een polystyreen oppervlak voor het etsen en afdrukken voor te bereiden, selecteert u een polystyreen plaat van één millimeter dik. Dikkere platen zullen meer doorbuigen.
Behandel vervolgens de plaat met zuurstofplasma. Stel de zuurstofgasregelaar in op twee bars. Schakel vervolgens de plasmamachine in en zet de vacuümpomp aan.
Programmeer de machine vervolgens voor 150 watt en 30 standaard kubieke centimeter per minuut zuurstofgasstroom en stel de plaat bloot aan deze omstandigheden gedurende 10 minuten. Evacueer vervolgens de kamer en verzegel de deur en start de cyclus. Dompel vervolgens de behandelde plaat in zuiver foetaal bovien serum en incubeer deze gedurende twee uur op 37 graden Celsius met agitatie.
Na de serumbehandeling, was de plaat drie keer met 1X PBS en steriliseer de plaat. Laat de plaat na de laatste wasbeurt een nacht over ongeveer 12 uur drogen in een oven van 37 graden Celsius. Bereid eerst een afdrukpen voor etswerk.
Met grote zorgvuldigheid, steekt u een textielnaald met een diameter van 1,5 millimeter in de mond van een afdrukspuit totdat deze vast komt te zitten en beveiligd is. Wanneer u voor het eerst probeert een biogeprint arrangement te creëren, schetst u het gewenste patroon op grafiekpapier met genummerde assen om de x, y-coördinaten te genereren. Voer vervolgens de coördinaten van het patroon in een spreadsheet in.
Selecteer vervolgens in de afdruksoftware Programma, Programma toevoegen, gevolgd door Bewerken, Punt toevoegen om het programma vast te leggen. Kopieer vervolgens de x- en y-coördinaatwaarden uit de spreadsheet naar de afdrukdispensersoftware. Voor elke run kalibreert u de z-hoogte van de robot om de contactpositie van de pen in te stellen.
Selecteer eerst de Robot-optie. Klik vervolgens op Wijzig modus en schakel de Leermodus-optie in. Dit schakelt de JOG-functie van de robot in.
Om de robot te JOG, brengt u de robot eerst in zijn standaardpositie door Robot, Meca Initialize te selecteren. Vervolgens Robot, JOG. Voer vervolgens in de x- en y-slots de afstand in millimeters in die nodig is om de pen precies op de oorsprong van het patroon te plaatsen.
Voer vervolgens ook in millimeters een numerieke waarde in de z-slot in om de pen of de mondstuk in contact te brengen met het oppervlak zonder het oppervlak te buigen of te deuken. Dit wordt aangeduid als de startwaarde van z. De diepte van elke groef kan worden gevarieerd met behulp van de z-hoogte.
De gesneden groeven kunnen bijvoorbeeld 40, 80 of 170 micron diep zijn. Het vergt concentratie en nauwlettend toezicht om een contactpunt te vinden waardoor de pen niet buigt of er een merkbare deuk op het oppervlak is. Om succes te garanderen, raden we aan om meerdere platen voor te bereiden en het programma op verschillende z-hoogtes uit te voeren om de ideale startpositie te vinden.
De volgende stap is om de afdrukinstructie voor elk van de coördinaatpunten te definiëren. Gebruik Start of Line Dispense om het eerste punt en afdrukinitiatie te definiëren. Gebruik Line Passing om de tussenliggende punten aan te duiden en gebruik ten slotte End of Line Dispense om de robot te signaleren de afdrukrun te beëindigen.
Selecteer Robot, C&T-gegevens verzenden om het programma aan de robot door te geven. Start vervolgens de run door Robot, Wijzig modus, Schakel uitvoermodus te selecteren en de instelling in te stellen op Uitvoeren. Start tenslotte het afdrukken.
Om de bio-inkt te maken, lost u 2% gelatine op in Alpha MEM aangevuld met 10% FBS en 2% antibioticum antimycoticum. Plaats het medium gedurende twee uur op 60 graden Celsius om de gelatine in het medium te laten oplossen. Kweek de cellen voor de bio-inkt tot 70% confluentie in 10-centimeter schalen.
Alle cellen die reageren op oppervlaktegeleidingsfuncties kunnen worden gebruikt en ze moeten een fluorescerend label uitdrukken zodat ze tijdens het inbeddingsproces kunnen worden gezien. Laat de aangehechte cellen vrij in de suspensie door het medium te verwijderen, de cellen te wassen met PBS en de cellen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius te coaten met een 1X Trypsin-EDTA-oplossing. Na neutralisatie van het Trypsin met medium, verzamel de cellen in een suspensie en pellet ze gedurende vijf minuten bij 1.000 g.
Beschrijf het supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in 0,5 milliliter medium. Na het meten van de celdichtheid, meng de suspensie in de gekoelde bio-inktoplossing om een oplossing met vijf miljoen cellen per millimeter te maken. Giet vervolgens de celdragende bio-inkt in een voorbereide afdrukspuit die is geblokkeerd door een aasdop.
Koel de geladen spuit af tot vier graden Celsius om een bedrukbare viscositeit te verkrijgen. Neem vervolgens de geladen en gekoelde spuit eruit, verwijder de spuitdop en bevestig de afdrukmondstuk. Bevestig vervolgens de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een geautomatiseerde robotische doseertechniek voor bioprinten die topografische sturingssignalen integreert met een precieze celtoediening. De methode maakt een gecontroleerd celgedrag en een gecontroleerde distributie mogelijk, wat het begrip van hoe oppervlaktetopografieën cellulaire interacties beïnvloeden, vergroot.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biomedische Techniek
- Celbiologie
- Bioprinttechnologie
Achtergrond
- Oppervlaktetopologieën kunnen het celgedrag aanzienlijk beïnvloeden.
- Bestaande methoden voor celpatronering zijn vaak tijdrovend.
- Hydrogels kunnen profiteren van nauwkeurige oppervlaktesturing.
- Geautomatiseerde technieken kunnen het bioprintproces stroomlijnen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor precieze celgeleiding met behulp van bioprinten.
- Het onderzoeken van de effecten van topografische kenmerken op het celgedrag.
- Het verbeteren van de efficiëntie bij het programmeren en printen van celpatronen.
Gebruikte methoden
- Geautomatiseerd robotisch doseersysteem.
- Geëtste topografische geleidingssignalen.
- Depositie van celhoudende hydrogel-bio-inkt.
- Gecontroleerde dosering van cellen om aan te sluiten bij oppervlaktekenmerken.
Belangrijkste resultaten
- Cellen zijn succesvol afgeleverd op de geëtste structuren.
- Het celgedrag werd beïnvloed door de topografische aanwijzingen.
- De methode bleek minder tijdrovend te zijn dan traditionele technieken.
- Aangetoond potentieel voor toepassingen in zowel monocultuur- als cocultuurstudies.
Conclusies
- De geautomatiseerde techniek verbetert de controle over de celdistributie.
- Oppervlaktetopologieën spelen een cruciale rol bij het sturen van het celgedrag.
- Deze methode zou het onderzoek in de biomedische techniek kunnen bevorderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze geautomatiseerde robotische doseertechniek maakt nauwkeurige topografische celgeleiding en gecontroleerde bioprinting mogelijk, waarmee wordt ingespeeld op de behoefte aan reproduceerbare modellen van cel-oppervlakinteracties in biomedisch onderzoek in een vroeg stadium. Door oppervlaksetsing te integreren met celdepositie op basis van hydrogels, ondersteunt de methode het mechanische risicobeheer (de-risking) van biomateriaalontwerpen en voorspellingen van cellulaire responsen. Het biedt een schaalbare workflow om te onderzoeken hoe topografische signalen de celuitlijning, morfologie en het gedrag beïnvloeden—cruciale factoren bij de validatie van doelen in weefselengineering en regeneratieve geneeskunde.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe fysieke topografieën de oriëntatie en elongatie van mesenchymale stamcellen beïnvloeden, wat bijdraagt aan de functionele targetvalidatie in mechanobiologische pathways.
- Operationele waarde: Vermindert de tijd die nodig is voor het programmeren en printen van geleidingspatronen in vergelijking met gevestigde methoden, waardoor cycli voor hypothesetoetsing worden versneld.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gestandaardiseerde, kwantificeerbare topografische kenmerken (bijv. groefdiepte, oriëntatie) die dienen als consistente inputs voor celgebaseerde assays.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van dispensing met tegendruk om een reproduceerbare depositie van bio-inkt te waarborgen, wat de betrouwbaarheid van de assay over replicates verbetert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert celdetectie en -respons op geëtste structuren in bio-inkten op basis van gelatine, wat een ziekterellevant systeem biedt voor het bestuderen van interacties tussen stromaal weefsel.
- Operationele waarde: Ondersteunt de continuïteit van fundamenteel onderzoek naar preklinisch werk door een gecontroleerde celdistributie in 3D-hydrogelomgevingen mogelijk te maken.
Pipeline- en workflowintegratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van target-hypotheses tot de identificatie van lead-verbindingen, in het bijzonder wanneer celpositionering en anisotropie kritieke uitreadouts zijn.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanische risicoreductie door het effect van topografische variabelen op het celgedrag te isoleren via programmeerbare oppervlaktepatronering.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via precieze, reproduceerbare depositie van celhoudende bio-inkt op vooraf gedefinieerde geleidingskenmerken.
- Analytics: Genereert kwantitatieve outputs zoals de celuitlijningshoek en de elongatieratio, wat comparatieve analyse tussen verschillende condities faciliteert.
- Translationeel Onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit door te modelleren hoe cellen fysieke signalen in biomimetische hydrogels waarnemen en hierop reageren.
- Enterprise Hergebruik: Het robotische doseersysteem kan worden hergebruikt voor zowel oppervlakte-etsen als bioprinten, waardoor de platformbenutting over verschillende projecten wordt verhoogd.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het voorspellend vertrouwen in studies naar cel-materiaalinteractie door variabiliteit bij de fabricage van patronen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid door programmeerbare controle op micrometerniveau in de X-, Y- en Z-assen.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen bij de ontwikkeling van biomaterialen door vroege beoordeling van de effectiviteit van topografische begeleiding mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van hydrogelformuleringen op basis van hun vermogen om celdetectie van geprinte kenmerken te ondersteunen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in robotprogrammering, oppervlaktebehandeling (bijv. zuurstofplasma) en de bereiding van hydrogel-bio-inkt.
- Afhankelijk van een precieze kalibratie van de z-hoogte van de stylus en de tegendruk van de dispenser om oppervlaktebuiging of inconsistente etsing te voorkomen.
- Maakt standaardisatie van celmarkering- en suspensieprotocollen noodzakelijk om traceerbaarheid en reproduceerbaarheid te waarborgen.
- Er moet rekening worden gehouden met veranderingen in de viscositeit van de bio-inkt tijdens het koelen en laden om de printgetrouwheid te behouden.
- Beperkt tot substraten die compatibel zijn met etsing en hydrogel-adhesie, zoals plasmabehandeld polystyreen.
Veelgestelde vragen over biofarma
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Modifying a Polystyrene Surface for Printing
2:29
Etching Patterns into the Polystyrene Sheet
5:48
Preparing and Printing Cell-containing Gelatin Bioink into the Etched Patterns
8:50
Results: Constraint of Printed Stem Cells
9:29
Conclusion
