Met behulp van capillaire elektroforese te kwantificeren organische zuren uit Plant Tissue: A Case Test Onderzoeken

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van de hoeveelheden organische zuren in plantenweefsels. Deze methode kan worden gebruikt om vragen binnen de plantbiochemie en plantfysiologie te beantwoorden, zoals de impact van omgevingsstimuli op wortelgroei, gewasontwikkeling en de kwaliteit van voedingsmiddelen of dranken. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat de monstervoorbereiding minimaal is, de methode een hoge doorvoersnelheid heeft en capillaire elektroforese kosteneffectiever is dan massaspectrometrie.

Hoewel deze methode wordt gebruikt om plantenfysiologische reacties te verduidelijken, kan deze ook worden toegepast in de levensmiddelentechnologie en voedselkwaliteit, waar organische zuren een kritieke invloed hebben op smaak, veiligheid en stabiliteit. Begin met het verzamelen van monsters voor de extractie van kortketenige carbonzuren, of SCCA. Bereid telkens één gram koffiezaden voor om ervoor te zorgen dat er na verwerking voldoende monster overblijft.

Om een uniforme partikelgrootte te verkrijgen voor een maximale extractie-efficiëntie van SCCA, moet een vijzel en stamper eerst worden voorgekoeld met vloeibare stikstof. Voeg het monster toe aan een klein volume vloeibare stikstof in de vijzel. Gebruik een schep om voldoende vloeibare stikstof aan de vijzel toe te voegen zodat het monster volledig is ondergedompeld.

Voeg moeilijk te malen monsters, zoals rauwe koffiebonen, toe aan de vloeibare stikstof. Laat ze 10 tot 30 seconden bevriezen voordat u gaat malen. Breek het weefsel in kleinere fragmenten met een verticale verbrijzelende beweging.

Voltooi vervolgens het vermalen van het weefsel met een cirkelvormige maalslag. Herhaal de vries- en maalstappen nog twee keer, zodat de monsters in totaal drie keer zijn vermalen. Normaal gesproken zullen drie opeenvolgende ronden van malen de monsters reduceren tot een poeder met een bloemachtige consistentie.

Overbreng het poeder naar glazen vials of 1,5 ml microcentrifugebuisjes. Start de verdere verwerking onmiddellijk na het malen of bewaar de monsters bij 80 degrees Celsius tot de monsters klaar zijn voor extractie. Verzamel authentieke standaarden voor de relevante SCCA's om externe en interne standaardoplossingen te maken voor het bepalen van de SCCA-concentraties.

Voeg voor koffie monsters citroen-, appel-, azijn- en melkzuur toe als de relevante zuren, en adipinezuur als interne standaard. Maak een stockoplossing van 10 milligram per milliliter door 100 milligram standaard aan een maatkolf van 10 milliliter toe te voegen. Vul de maatkolf tot de 10 milliliter streep aan met ultrapuur water om het zuur op te lossen.

Overbreng elke voorraadoplossing naar een schone glazen buis van 15 milliliter, voorzien van een polytetrafluoroethyleen-gevoerde dop, en sluit deze af met plastic paraffinefolie. Voorraadoplossingen kunnen in afgesloten buizen gedurende één week worden bewaard bij vier graden Celsius. Bereid 50 milliliter van de SCCA-extractie-oplossing door de voorraadoplossing van de interne standaard te verdunnen tot 0,05 milligram per milliliter in ultrapuur water.

Doe dit door 250 µL van de voorraadoplossing van de interne standaard toe te voegen aan 49,75 mL water. Bereid vervolgens standaardcurvemonsters voor de relevante SCCA's. Gebruik minimaal vijf punten met concentraties in het lineaire responsbereik die de verwachte SCCA-concentraties in de monsters beslaan.

Verdun elke SCCA tot de bepaalde concentratie in nieuwe microcentrifugebuisjes met ultrapuur water tot een volume van één milliliter. Zorg ervoor dat elk concentratiepunt alle vier de zuurstandaarden en de interne standaard in de juiste concentratie bevat. Haal de te extraheren monsters uit de opslag en plaats deze op ijs.

Weeg 100 milligram monster af voor de SCCA-extractie. Meet een hoeveelheid monster af die zo dicht mogelijk bij de doelmassa ligt om de variabiliteit te verminderen. Breng het weefsel na het wegen van elk monster over naar een schoon microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter.

Houd de gemeten massa van elk monster bij, aangezien de gedetecteerde hoeveelheden SCCA's genormaliseerd zullen worden op basis van de monstermassa. Voeg na het wegen van alle monsters één milliliter extractie-oplossing toe aan elke monsterbuis. Houd de verhouding tussen de extractie-oplossing en de weefselmassa voor alle extracties gelijk.

Meng goed door 10 seconden te vortexen. Laat de monsters één uur lang bij kamertemperatuur staan. Meng gedurende dit uur elke buis elke 15 minuten door 10 seconden te vortexen.

Na één uur extractie worden de monsters voor de laatste keer gemengd en worden de monsterbuisjes overgebracht naar een microcentrifuge. Centrifugeer de monsters bij vier graden Celsius, 10.000 ×g gedurende 10 minuten, om het vaste materiaal neer te slaan. Bereid ter filtratie van de monsters spuitfilters met schijfjes voor, waarbij moet worden gecontroleerd of elk filter correct aan de spuit is bevestigd.

Bereid voor elk te analyseren monster, inclusief de monsters voor de standaardcurve, één spuit voor uitgerust met een schijfjesfilter. Filtreer de supernatanten direct in een schoon microcentrifugebuisje. Sluit na het filtreren het buisje met het filtraat en gooi de spuitfilterapparatuur weg.

Overbreng één milliliter monster naar elk capillair elektroforese- (of CE-) vial, waarbij u er zorg voor draagt dat het monster niet tegen de hals van het vial spat. Plaats na het overbrengen van het monster een CE-dop op elk vial. Stel de SCCA-detectierun in zoals beschreven in het tekstprotocol.

Plaats de vials met de punten voor de standaardcurve en de vials met de te analyseren monsters in de monsteropvangkamer, zoals beschreven in de instructies van de fabrikant. Noteer de positie van elke vial voor de programmering van de autosampler. Start, na de conditionering zoals beschreven in het tekstprotocol, de monsterscheiding door het Control-menu in de software te openen en Run Sequence te selecteren.

Houd de fotodiodedetector-array, of PDA-trays, in de gaten om een goede scheiding te waarborgen. Observeer het eerste chromatogram en controleer of dit een vlakke basislijn heeft en of de individuele zuurpieken duidelijk worden opgelost. Om de monsterpieken te integreren, opent u het eerste bestand en stelt u de automatische integratiestappen zo in dat de eerste drie minuten van de run worden uitgesloten.

Stel in hetzelfde menu de criteria voor piekselectie in op een minimale piekbreedte van 50 eenheden en een piekoppervlak van 100 eenheden, om een matig hoog niveau van selectiviteit te verkrijgen, waarbij zuurpieken worden gescheiden van de achtergrondruis in het spoor. Voer de gegevensanalyse uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier wordt een vergelijking van PDA-sporen getoond waarbij een overbeladen monster wordt geaccentueerd.

Naarmate de analytconcentratie toeneemt, kan de geometrie van individuele pieken asymmetrisch worden. Bij 0,05 mg/mL vertoont azijnzuur een goed gedefinieerde, bilateraal symmetrische piek. Wanneer de concentratie azijnzuur toeneemt tot 0,07 of 0,10 mg/mL, wordt de piek asymmetrisch en vormt zich een piekstaart.

Deze piekstaartvorming is een goede indicatie dat het monster overbelast is. Hier worden voorbeeld-PDA-sporen getoond waarin organische zuren in monsters van groene koffie zichtbaar zijn. De monsters van groene koffie werden 1:10 verdund vóór het overbrengen naar de CE-vials.

De zuren van belang zijn azijnzuur, citroenzuur, melkzuur, appelzuur en de interne standaard, adipinezuur. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om monsters te malen tot een uniforme consistentie en monsters zorgvuldig te pipetteren, om de reproduceerbaarheid te maximaliseren en experimentele fouten te minimaliseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe organische zuren in plantmonsters gekwantificeerd kunnen worden met behulp van capillaire elektroforese, of CE. U moet in staat zijn om plantmonsters te malen, organische zuren te extraheren en plantextracten voor te bereiden voor daaropvolgende CE-analyse.