Methodologieën voor het bestuderen B. subtilis Biofilms als een model voor het karakteriseren van Small Molecule biofilminhibitoren

Bacteriele biofilms zijn belangrijk voor de menselijke gezondheid, omdat ze hun bacteriële bewoners beschermen tegen omgevingsschade en antimicrobiële middelen. Het doel van deze procedure was om een modelsysteem te ontwikkelen om de effecten van kleine molecuulremmers op biofilmvorming te evalueren. Deze methoden kunnen helpen om een set tools te ontwikkelen die essentieel is voor het biofilmveld om kleine molecuulremmers te selecteren die specifiek gericht zijn op biofilmvorming.

Het grote voordeel van deze methodologieën is dat ze starten vanuit een consistente, robuuste experimentele framework, en kwantitatieve en kwalitatieve inzichten geven in de werkingsmechanisme van biofilm-specifieke remmers. Hoewel deze methoden inzicht kunnen geven in Bacillus subtilis biofilms, kunnen ze ook worden toegepast op andere biofilm-vormende bacteriën, zoals Pseudomonas aeruginosa of de plantenpathogeen Xanthomonas citri. Scanning elektronenmicroscopie kan essentieel zijn om het effect van kleine moleculen op biofilmvorming te analyseren, omdat het observatie van de extracellulaire matrix mogelijk maakt en enkelcelresolutie biedt.

Om te beginnen, selecteer eerst een geschikte enkele kolonie en breng deze over in drie milliliter LB-bouillon. Plaats deze starterscultuur in een schuddende incubator gedurende vier uur bij 37 graden Celsius. Na incubatie, neem 1,5 milliliter van de starterscultuur en centrifugeer gedurende vier minuten.

Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer vervolgens het pellet in 1,5 milliliter MSgg-medium. Om pellicles te laten groeien, bereid een 12-wells celcultuurplaat voor door drie milliliter MSgg toe te voegen aan elke well. Aan sommige van deze wells, voeg MSgg toe met een kleine molecuulremmer in een concentratiebereik, verdeel de locatie van verschillende concentraties rond de schotel om randeffecten te voorkomen.

Meet de optische dichtheid bij 600 nanometer van de resuspendeerde starterscultuur. De cultuur moet tussen 0,6 en een liggen. Dit is cruciaal voor de robuustheid van het systeem.

Inoculeer elke well van de cultuurplaat met 3 microliters van de resuspendeerde starterscultuur. Bewaar vervolgens de plaat gedurende drie dagen onder statische omstandigheden in een incubator bij 23 graden Celsius. Verwijder daarna de plaat uit de incubator en observeer de pellicles.

Om biofilms te laten groeien, gebruik een sjabloon en breng symmetrisch vier afzonderlijke druppels van 1,5 microliters onbehandelde starterscultuur aan op een 8,5 centimeter gedroogd 1,5% Agar MSgg-plaat. Laat de druppels absorberen in het medium voordat u de plaat verplaatst. Bewaar de platen gedurende drie dagen bij 30 graden Celsius.

Gebruik een binoculaire microscoop met gelijkmatige lichtexpositie om te controleren of biofilmkolonies zich hebben ontwikkeld en een driedimensionale gerimpelde structuur hebben gevormd. Neem eerst een schone scheermes en snijd de biofilmkolonies in twee gelijke delen met behulp van de sjabloon. Til voorzichtig een half deel van de kolonie op met een schone spatel en breng het over naar een 1,5-milliliter microcentrifugebuisje, dat 500 microliters PBS bevat.

Neem het tweede helft van de kolonie en breng het over naar een microcentrifugebuisje dat 500 microliters 50% ethanol bevat. Deze zullen worden gebruikt om de resistentie tegen steriliserende middelen te beoordelen. Vervolgens, neem op een vergelijkbare manier het eerste helft van de met D-lysine behandelde kolonie en plaats het in PBS.

Neem vervolgens het tweede helft van deze kolonie en breng het over naar ethanol. Bewaar alle buisjes met de biofilmhelften gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. En centrifugeer ze vervolgens gedurende vijf minuten bij 18.000 keer g.

Gebruik een pipet om voorzichtig het supernatant te verwijderen. Voeg 300 microliters PBS toe en soniceer vervolgens de cellen op een lage instelling met een microtip sonicator. Voeg een extra 700 microliters PBS toe voor een eindvolume van een milliliter.

Voer vervolgens een seriële verdunning uit van 10 tot de negatieve zeven in PBS. Neem 100 microliters van een van de verdunningen en inoculeer een 1,5% Agar LB-plaat. Herhaal deze stap voor twee andere verdunningen per monster.

Spreid het inocculum uit met glaskralen en bewaar vervolgens de platen een nacht bij 30 graden Celsius. Onderzoek de platen en tel de kolonievormingseenheden, of CFU. Na het berekenen van de CFU per milliliter waarde, bereken het percentage overlevenden in de PBS versus ethanol behandelingen.

Om met de bemonstering te beginnen, bereid eerst voldoende verse fixeervloeistof voor voor het gewenste aantal biofilmkolonies. Voeg voorzichtig vijf milliliter fixeervloeistof toe aan elke petrischaal en vermijd direct pipetteren op kolonies. Kolonies zullen beginnen los te komen van de Agar en drijven.

Zorg ervoor dat de platen goed worden afgesloten met parafilm en incubeer ze gedurende twee uur op een draaiende schaker op kamertemperatuur. Breng de platen over naar een opslag van vier graden Celsius voor een nacht. Verwijder voorzichtig de fixeervloeistof met een Pasteurpipet, verbonden aan een vacuüm.

Voeg 10 milliliter 100 nanomolair natriumcacodylaat, vijf millimolair calciumchloridebuffer toe om de biofilm te wassen en incubeer gedurende vijf minuten. Ontkoppel voorzichtig het centrum van de biofilmkolonie van de Agarplaat met een Pasteurpipet. Om kolonies te laten drogen, snijdt u cellulosafilterpapier in vieren en dompelt u vervolgens een sectie onder in 100% ethanol.

Breng voorzichtig een drijvende biofilmkolonie over op het papier. Plaats het papier in een petrischaal gevuld met droog filterpapier. Dek vervolgens de schaal af en laat het overnacht drogen in een chemische kap.

Om de morfologie van de biofilmkolonie te behouden, is het belangrijk om de drijvende biofilm volledig te onderleggen met het cellulosapapier. Eenmaal op het papier, kan de biofilm niet meer worden aangepast. Bedek een elektronenmicroscoopstub met koolstoftape en gebruik vervolgens een pincet om de biofilmkolonies voorzichtig over te brengen naar de stub.

Nadat elke kolonie aan de stub is verbonden door een dunne brug van koolstoftape toe te voegen, bewaar de stubs gedurende 24 uur of tot ze nodig zijn