Name: Het definiëren van de ondergrond hebben voor lipase en fosfolipase Kandidaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Verken een methode om lipase- en fosfolipase-activiteit te optimaliseren en hun natuurlijke substraten te identificeren met behulp van celvrije eiwitextracten. Deze techniek versnelt het onderzoek naar enzymfuncties in lipide-metabolisme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-Mexico) (82.614, 153.998, 253.549 en 178.359 in Investigación Científica Básica evenals 118 in Investigación en Fronteras de la Ciencia) en vanaf Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (DGAPA-UNAM; PAPIIT IN202616, IN203612).

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger%2C+Principles+of+Biochemistry%22">Lehninger, Principles of Biochemistry</a>. , W. H. Freeman and Company. New York. (2013).</li>
<li>Jaeger, K. E., Eggert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipases+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lipases for biotechnology.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).</li>
<li>Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDowhan%2C+W+%22Biochemistry+of+Lipids%2C+Lipoproteins+and+Membranes%22">Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes</a>. , 5th, Elsevier. Amsterdam, The Netherlands. 1-37 (2008).</li>
<li>Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+membrane+phospholipid+diversity%3A+why+are+there+so+many+lipids%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?</a> Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).</li>
<li>De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+meliloti+mutants+deficient+in+phospholipid+N-methyltransferase+still+contain+phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine.</a> J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).</li>
<li>Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulator+gene+phoB+mediates+phosphate+stress-controlled+synthesis+of+the+membrane+lipid+diacylglyceryl-N%2CN%2CN-trimethylhomoserine+in+Rhizobium+%28Sinorhizobium%29+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti.</a> Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).</li>
<li>Klug, R. M., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+enzymes+of+diacylglyceryl-O-4%27-%28N%2CN%2CN%2C-trimethyl%29homoserine+biosynthesis+are+encoded+by+btaA+and+btaB+in+the+purple+bacterium+Rhodobacter+sphaeroides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Two enzymes of diacylglyceryl-O-4'-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).</li>
<li>Zavaleta-Pastor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinorhizobium+meliloti+phospholipase+C+required+for+lipid+remodeling+duringphosphorus+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).</li>
<li>Pech-Canul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FadD+is+required+for+utilization+of+endogenous+fatty+acids+released+from+membrane+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids.</a> J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).</li>
<li>Banerji, S., Flieger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patatin-like+proteins%3A+a+new+family+of+lipolytic+enzymes+present+in+bacteria%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?</a> Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).</li>
<li>Sahonero-Canavesi, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-releasing+activities+in+Sinorhizobium+meliloti+include+unusual+diacylglycerol+lipase%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase.</a> Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).</li>
<li>Fischer, M., Pleiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lipase+Engineering+Database%3A+a+navigation+and+analysis+tool+for+protein+families%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acid.+Res%22%5BJournal%5D)">The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families.</a> Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).</li>
<li>Sigrist, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+continuing+developments+at+PROSITE%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New and continuing developments at PROSITE.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+-+new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3 - new capabilities and interfaces.</a> Nucl. Acids Res. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li>
<li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+JH+%22Experiments+in+Molecular+Genetics%22">Experiments in Molecular Genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY, USA. (1972).</li>
<li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), e1610(2009).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
<li>Molecular Dynamics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Phosphorimager+SI+User%C2%B4s+Guide%22">Phosphorimager SI User´s Guide</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www.camd.lsu.edu/SAXS/Files/PIManual.pdf">http://www.camd.lsu.edu/SAXS/Files/PIManual.pdf</a> (1994).</li>
<li>Dixon, M., Webb, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDixon%2C+M+%22Enzymes%3A+Third+Edition%22">Enzymes: Third Edition</a>. , Longman, USA. (1979).</li>
<li>Rudolph, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+characterization%2C+and+mutagenesis+of+the+Yersinia+pestis+murine+toxin%2C+a+phospholipase+D+superfamily+member%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member.</a> J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).</li>
<li>Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+a+novel+lipolytic+enzyme+YvdO+from+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).</li>
<li>Peppelenbosch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica+%28Cairo%29%22%5BJournal%5D)">Kinome profiling.</a> Scientifica (Cairo). , Article ID 306798 (2012).</li>
<li>Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+and+chromogenic+substrates+used+in+bacterial+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics.</a> Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).</li>
<li>Kuznetsova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+genomics%3A+Application+of+general+enzymatic+screens+to+discover+new+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes.</a> FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).</li>
<li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScopes%2C+RK+%22Protein+Purification%2C+Principles+and+Practice%22">Protein Purification, Principles and Practice</a>. , Springer. New York. (2010).</li>
<li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In de afgelopen 20 jaar hebben genomen van vele organismen gesequenced en hoewel een schat aan genoomsequentie gegevens zijn gegenereerd, wordt de functionele interpretatie achterstand en belemmert daardoor ons begrip van de werking van het genoom. Genfuncties in het genoom worden vaak toegewezen op basis van similariteit met genen van bekende functie of voorkomen van geconserveerde motieven. De precieze functie van een bepaald gen vaak niet bekend. Vooral voorspelde structurele genen voor enzymen kunnen gemakkelijk met...

-Glycerol gebaseerde lipiden zoals triacylglycerolen en (glycero) fosfolipiden zijn belangrijke en waarschijnlijk de meest bekende lipide-klassen 1. Triacylglycerolen (TAGs) zijn vetten en oliën, die gewoonlijk fungeren als opslag lipiden en derhalve potentiële energie en koolstofbronnen. TAGs kan worden afgebroken door lipasen die vaak worden uitgescheiden door het producerende organisme externe TAGs verteren en beschikbaar als koolstofbronnen. Ook lipasen zijn uitgebreid bestudeerd in de jaren vanwege hun belangrijke biotechnologische toepassingen 2. Door hun amfifiele aard en hun bijna-cilindrische vorm, (glycero) fosfolipiden vertonen membraanvormende eigenschappen en meestal vormen de belangrijkste lipide componenten van een dubbellaag membraan 3. In eenvoudige organismen zoals de bacterie Escherichia coli, slechts drie grote kopgroep varianten, fosfatidylglycerol (PG), cardiolipine (CL) en phosphatidylethanolamine (PE) worden aangetroffen, hoewel men dient te beseffen dat elk daarvan kan worden gesubstitueerd met een groot aantal verschillende vetacylketens op de sn-1 of sn-2 positie waardoor een groot aantal verschillende moleculaire species 4 . Andere bacteriën kunnen andere fosfolipiden, naast of in plaats daarvan. Bijvoorbeeld, Sinorhizobium meliloti, een bodem bacterie, die in staat is een stikstoffixerende wortel knobbel symbiose met de peulvruchten alfalfa (Medicago sativa) vormen, bevat naast een tweede zwitterionisch fosfolipide, fosfatidylcholine (PC) PE 5. Ook lipiden zonder fosfor of glycerol kunnen amfifiele en deel uitmaken van de cellulaire membraan. Bijvoorbeeld upon fosfor beperkende groeiomstandigheden, S. meliloti, (glycero) fosfolipiden grotendeels vervangen door membraanlipiden die geen fosfor bevatten, dat wil zeggen, sulfolipiden, ornithine lipiden en diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. In bacteriën wordt DGTS gevormd van diacylglycerol (DAG) in een tweestaps route 7 maar de bron voor DAG generatie was niet duidelijk. Pulse-chase experimenten gesuggereerd dat PC een voorloper voor DGTS 8 zou kunnen zijn en het gebruik van de in dit manuscript konden we een fosfolipase C (PLCP, SMc00171) identificeren beschreven methodologie die in het kader van fosfor randvoorwaarden wordt gevormd en welke pc kan omzetten in DAG en fosfocholine 8. In een afzonderlijke studie, ontdekten we dat een acyl-CoA synthetase (FADD) deficiënte mutant van S. meliloti of Escherichia coli geaccumuleerde vrije vetzuren bij het invoeren van stationaire fase van 9 groei. Hoewel deze vetzuren leek te worden afgeleid van membraanlipiden, werden de precieze bron van de vrije vetzuren of de enzym (en) men ze niet bekend. Nogmaals, in dienst van de strategie die in dit manuscript, twee patatine-achtige 10 (fosfo) lipasen (SMc00930 en SMc01003) die hebben bijgedragen aan de vorming van vrije vetzuren in S. meliloti 11 voorspeld. Verrassenderwijs SMc01003 DAG gebruikt als substraat converteren naar monoacylglycerol en tenslotte glycerol en vrije vetzuren 11. Daarom SMc01003 een DAG lipase (DGLA). Hoewel een aantal algoritmes aanwezig voor het voorspellen van mogelijke (fosfo) lipasen 12,13, de exacte functie en fysiologische rol meestal niet bekend. Hier schetsen we een protocol, te klonen en overexpressie voorspelde of potentiële (fosfo) lipasen. Dit manuscript uitgelegd hoe enzymbepalingen kunnen worden ontwikkeld en geoptimaliseerd voor de overexpressie (fosfo) lipase met kunstmatige chromogene substraten. We geven voorbeelden hoe met een geoptimaliseerde enzym assay de echte (fosfo) lipase substraat kan worden opgetreden en hoe deze bevindingen ons begrip van microbiële fysiologie zou kunnen verrijken.

<table><tbody><tr><td>Chloroform</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td>TLC-analyse &amp; Lipid extractie</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-03</td><td>TLC-analyse &amp; Lipid extractie</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>JT Baker</td><td>9507-05</td><td>TLC-analyse &amp; Lipid extractie</td></tr><tr><td>Hexanen</td><td>JT Baker</td><td>9309-02</td><td>TLC-analyse &amp; Lipid extractie</td></tr><tr><td>Di-ethylether</td><td>Sigma</td><td>32203</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>bidistilleerd water</td><td>&nbsp;ELK</td><td>&nbsp;NIET VAN TOEPASSING</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Baker</td><td>9535-02</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker</td><td>3624-01</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>LB-bouillon</td><td>ELK</td><td>NIET VAN TOEPASSING</td><td>Bacteriegroei, 10 g tryptone + 5 g gistextract + 10 g NaCl per liter bidistilleerd water</td></tr><tr><td>tryptone</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>211705</td><td>Bacteriegroei</td></tr><tr><td>gistextract</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>Bacteriegroei</td></tr><tr><td>TY-bouillon</td><td>ELK</td><td>NIET VAN TOEPASSING</td><td>Bacteriegroei, 8 g tryptone + 3 g gistextract + 66 mg CaCl2&#183;2H2O per liter bidistilleerd water</td></tr><tr><td>CaCl2&#183;2H2O</td><td>Baker</td><td>1332-01</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>isopropyl-&beta;-D-thiogalactoside (IPTG)</td><td>Invitrogen</td><td>15529-019</td><td>Bacteriegroei</td></tr><tr><td>Diethanolamine</td><td>Sigma</td><td>D-8885</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>Phospholipase A2 slangengif</td><td>Sigma</td><td>P0790</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>Phospholipase C Clostridium perfringens</td><td>Sigma</td><td>P7633</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>Bis-p-nitrofenylfosfaat</td><td>Sigma</td><td>07422AH</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>p-nitrofenyl stearaat</td><td>Sigma</td><td>N3627</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>p-nitrofenyl dodecanoaat</td><td>Sigma</td><td>61716</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>p-nitrofenyl decanoaat</td><td>Sigma</td><td>N0252</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>p-nitrofenyl palmitaat</td><td>Sigma</td><td>N2752</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>p-nitrofenyl butyraat</td><td>Sigma</td><td>N9876</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>p-nitrofenyl octanoaat</td><td>Sigma</td><td>21742</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>Azijnzuur, natriumzout [1-14C]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC084</td><td>Bacteriegroei</td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>JT Baker</td><td>9224-01</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>Aluminium HPTLC silicagel 60 platen. Silicagel HPTLC platen formaat 20 x 20 cm, 25 vellen.</td><td>Merck</td><td>105547</td><td>TLC-analyse &amp; Lipid extractie</td></tr><tr><td>Spectrometer UV/VIS Lambda 35</td><td>Perkin Elmer</td><td>NIET VAN TOEPASSING</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>Storm 820 Phosphorimager</td><td>Molecular Dynamics</td><td>NIET VAN TOEPASSING</td><td>Photostimulable luminescentiescanner&nbsp;</td></tr><tr><td>Multifunctionele scintillatieteller</td><td>Beckman Coulter</td><td>NIET VAN TOEPASSING</td><td>Radioactiviteitskwantificering</td></tr><tr><td>Franse drukcellen</td><td>ThermoSpectronic</td><td>NIET VAN TOEPASSING&nbsp;</td><td>Celbreuk</td></tr><tr><td>chromatografiepapier 3MM Chr</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>TLC-analyse</td></tr><tr><td>Sinorhizobium meliloti 1021our</td><td>referentie 11</td><td></td><td>onderzochte stam</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competente cellen</td><td>Novagen</td><td>69451</td><td>eiwitexpressiestam</td></tr><tr><td>pET9a-vector</td><td>Novagen</td><td>69431</td><td>eiwitexpressievector</td></tr><tr><td>pET17b-vector</td><td>Novagen</td><td>69663</td><td>eiwitexpressievector</td></tr><tr><td>steriele polystyreen buis met ronde bodem (14 ml) Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>352057</td><td>radiolabeling van bacterieculturen</td></tr><tr><td>polypropyleen microcentrifugebuisjes (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td>Enzymatische assays</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol</td><td>Sigma</td><td>D9135</td><td>lipid standaard</td></tr><tr><td>L-&alpha;-fosfatidylcholine, dipalmitoyl</td><td>Sigma</td><td>P6267</td><td>lipid standaard</td></tr><tr><td>DL-&alpha;-monopalmitine</td><td>Sigma</td><td>M1640</td><td>lipid standaard</td></tr><tr><td>palmitinezuur</td><td>Sigma</td><td>P0500</td><td>lipid standaard</td></tr></tbody></table>

het definiëren van de ondergrond hebben voor lipase en fosfolipase kandidaten

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Micro-organismen produceren een breed scala aan (fosfo) lipasen die worden afgescheiden teneinde externe beschikbare substraten voor het organisme maken. Ook kunnen andere (fosfo) lipasen fysiek gekoppeld aan het producerende organisme veroorzaakt een omzet van intrinsieke lipiden en vaak aanleiding geeft tot een hermodellering van de celmembranen. Hoewel potentiaal (fosfo) lipase kan worden voorspeld met een aantal algoritmen wanneer het gen / eiwitsequentie beschikbaar, experimenteel bewijs van de enzymactiviteiten, substraatspecificiteiten en mogelijke fysiologische functies is vaak niet verkregen. Dit manuscript beschrijft de optimalisatie van testcondities voor potentiële (fosfo) lipasen met onbekende substraatspecificiteiten en hoe deze geoptimaliseerde omstandigheden te gebruiken in de zoektocht naar het natuurlijke substraat van een respectievelijke (fosfo) lipase. Met behulp van kunstmatige chromogene substraten, zoals p-nitrofenyl derivaten kunnen helpen in geringe sporenenzymatische activiteit een voorspeld (fosfo) lipase onder standaardomstandigheden. Hebben ondervonden dergelijke kleine enzymatische activiteit kunnen de verschillende parameters van een enzym assay worden gevarieerd teneinde een efficiëntere hydrolyse van het kunstmatige substraat te verkrijgen. Na de voorwaarden waaronder een enzym werkt goed hebben vastgesteld, moet een groot aantal potentiële natuurlijke substraten worden getest op hun degradatie, een proces dat gevolgd kan worden in dienst verschillende chromatografische methoden. De definitie van substraatspecificiteiten voor nieuwe enzymen, vormt vaak hypothesen voor een mogelijke fysiologische rol van deze enzymen, die vervolgens experimenteel getest worden. Door deze richtlijnen, konden we een fosfolipase C (SMc00171) die fosfatidylcholine aan fosfocholine en diacylglycerol, een cruciale stap voor de verbouwing van membranen in de bacterie Sinorhizobium meliloti upon fosfor randvoorwaarden groei degradeert identificeren. Voor twee voorspelde patatin-zoals fosfolipasen (SMc00930 en SMc01003) van hetzelfde organisme, konden we hun substraat specificiteiten opnieuw te definiëren en te verduidelijken dat SMc01003 is een diacylglycerol lipase.

Activiteit van PC-specifieke fosfolipase C SMc00171 met Bis- p nitrofenylfosfaat Celvrije extracten verkregen van E. coli BL21 (DE3) pLysS x, die moest smc00171 expressie werden onderzocht op hun vermogen om bis-p-nitrofenylfosfaat esters hydrolyseren, onder toepassing van een spectrofotometrische enzymatische test, meten blz -NP ge...

Veel voorspelde (fosfo)lipasen zijn slecht gekarakteriseerd met betrekking tot hun substraatspecificiteit en fysiologische functies. Hier bieden we een protocol om enzymactiviteiten te optimaliseren, naar natuurlijke substraten te zoeken en fysiologische functies voor deze enzymen voor te stellen.

Het definiëren van de ondergrond hebben voor lipase en fosfolipase Kandidaten

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Het algemene doel van deze procedure is om de detectie van fysiologische substraten voor potentiële lipasen en fosfolipasen te versnellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de entomologie, zoals de wijze waarop fosfolipasen bijdragen aan lipideremodellering in biologische membranen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de optimalisatie van de enzymatische activiteit en de zoektocht naar het natuurlijke substraat voor het enzym onafhankelijk van elkaar kunnen worden uitgevoerd.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de substraatspecificiteit van bacteriële lipasen en fosfolipasen, kan ze ook worden aangepast om hydrolasen van andere modelorganismen te bestuderen. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we zochten naar een enzymactiviteit die het intrinsieke membraanlipid fosfatidylcholine in Rhizobium meliloti kon afbreken. Ontdooi bacteriële cel-suspensies en bewaar deze op ijs om celvrije eiwitextracten voor te bereiden.Druk vervolgens de celsuspensies drie keer door een koude drukcel bij 20.000 pounds per square inch. Verwijder de intacte cellen en celresten door centrifugatie bij 5.000 ×g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Bereid na centrifugatie aliquoten van 100 en 500 µL van het supernatant voor verdere analyse.Stel de eerder geoptimaliseerde enzymassay in volgens de in het tekstprotocol getabuleerde pipetteerschema's. Gebruik voor een initiële dekking van verschillende enzymactiviteiten kunstmatige substraten die bij hydrolyse een gekleurd product opleveren, zoals para-nitrophenol of PNP-derivaten. Volg het tijdverloop van de toename van de absorbantie bij 405 nanometers, als gevolg van de vorming van PNP in een spectrophotometer bij 30 degrees Celsius over een periode van vijf minuten.Voer tenslotte de berekeningen uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Voor de radiomerkering van lipiden wordt een overnight pre-cultuur van het betreffende organisme voorbereid in vijf milliliters van het gewenste culturemedium en gekweekt bij 30 °C. Inoculeer vanuit de pre-cultuur 20 millimeters vers medium in een 100-millimeter kweekkolf, om een initiële optische dichtheid van 0,3 bij 620 nanometers voor de cultuur te verkrijgen.Breng vervolgens onder steriele omstandigheden een aliquot van 1 ml van de cultuur over naar een steriele polystyreen ronde bodembuis van 14 ml. Voeg 1 µCi 114 c acetaat toe aan de cultuur van 1 ml. Incubeer de vloeibare cultuur vervolgens onder agitatie bij 30 °C gedurende een periode van 24 uur.Breng de cultuur aan het einde van de incubatieperiode over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeer 5 minuten bij 12.000 ×g op kamertemperatuur. Resuspendeer het pellet in 100 µL water. De celsuspensie kan op dit punt worden bewaard bij -20 °C of er kan direct worden doorgegaan met de extractie van polaire lipiden.Voor het extraheren van polaire lipiden voegt u 375 µL van een methanol-chloroformoplossing in een verhouding van twee-op-een toe aan de 100 µL waterige celsuspensie. Vortex het monster gedurende 30 seconden voordat u het vijf minuten laat incuberen bij kamertemperatuur. Centrifugeer na incubatie vijf minuten bij 12.000 ×g bij kamertemperatuur.Breyng vervolgens de supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg daarna 125 microliters chloroform en 125 microliters water toe aan de supernatant. Na 30 seconden vortexen wordt het monster gedurende één minuut gecentrifugeerd bij 12 000 ×g bij kamertemperatuur.Overbreng de onderste chloroform-fase naar een nieuwe buis. Droog de oplossing vervolgens met een stroom nitrogengas. Los de gedroogde lipiden op in 100 µL van een chloroform-methanoloplossing.Breng voor de scheiding van neutrale polaire lipiden via dunne-laagschromatografie aliquots van drie µL van de lipidemonsters aan op een aluminiumplaat met silica gel voor hogeresolutie dunne-laagschromatografie, beginnend op twee cm van de randen van de plaat. Als er meerdere monsters in één-dimensionale chromatografie worden geanalyseerd, moet er een afstand van ten minste 1,5 cm worden aangehouden tussen de verschillende applicatieplaatsen van de monsters. Breng de mobiele fase over in een TLC-ontwikkelkamer die aan de binnenzijde is bekleed met chromatografiepapier.Dek af met een glasplaat om de kamer 30 minuten te laten verzadigen. Plaats de HPTLC Silica Gel aluminiumplaat met de gedroogde lipidemonsters in de kamer. Laat de plaat 30 minuten ontwikkelen in een gesloten kamer voordat u de plaat verwijdert.Laat de oplosmiddelen vervolgens gedurende twee uur opdrogen in een flow hood. Zodra de ontwikkelde TLC-plaat droog is, wordt deze drie dagen samen met een fotostimuleerbaar luminescentiescherm in een gesloten cassette geïncubeerd. Stel het geïncubeerde scherm daarna bloot aan een PSL-scanner en leg een virtueel beeld vast van de gescheiden radiogemarkeerde lipiden.Om de diacylglycerol- of DAG-lipaseactiviteit te bepalen, voegt u eerst 5.000 CPM aan 14 C-gelabelde DAG toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg daarnaast een Triton X-100-oplossing toe aan de buis en meng dit door te vortexen. Droog de oplossing onder een stroom stikstof.Voeg voor een uiteindelijke assay van 100 µL Tris-HCl-buffer, een natriumchloride-oplossing en bi-gedestilleerd water toe. Vortex gedurende vijf seconden. Start de reactie door vijf µL enzym aan de oplossing toe te voegen.Incubeer de oplossing gedurende vier uur bij 30 °C. Stop de reactie door toevoeging van 250 µL methanol en 125 µL chloroform, alvorens de lipiden te extraheren zoals eerder in deze video beschreven. Ga verder met de analyse van neutrale polaire lipiden via 1DTLC en daaropvolgende PSL-imaging zoals voorheen.Hoewel de voorspelde fosfolipase SMc01003 activiteit vertoont met kunstmatige para-nitrofenol acyl esters, is deze activiteit slechts tweemaal of driemaal zo hoog als de achtergrondactiviteit in celvrije extracten van Escherichia coli waarin geen vreemd gen was tot expressie gebracht. Dit wijst erop dat para-nitrofenyl acyl esters geen geschikte substraten lijken te zijn voor SMc01003. Terwijl celvrije extracten van E. coli diacylglycerol niet kunnen afbreken, veroorzaakten extracten van stammen waarin de voorspelde fosfolipase, SMc01003, tot expressie was gebracht, wel een afbraak van diacylglycerol.Hoewel werd voorspeld dat SMc01003 een fosfolipase zou zijn, is het in feite een diacylglycerol-lipase dat diacylglycerol afbreekt tot monoacylglycerol en één vetzuur. Vervolgens breekt het monoacylglycerol verder af tot glycerol en nog een vetzuur. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in enkele weken worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de enzymactiviteiten van lipasen en fosfolipasen optimaliseert en hoe u vervolgens de zoektocht naar hun fysiologische substraten voortzet. Een cruciaal voordeel van deze procedure is dat de optimalisatie van de enzymactiviteit kan worden gescheiden van de zoektocht naar het natuurlijke enzymsubstraat. Vergeet niet dat werken met organische oplosmiddelen of radioactieve stoffen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat de vereiste voorzorgsmaatregelen altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

defining-substrate-specificities-for-lipase-phospholipase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Fosforylering van eiwitten is een centrale eigenschap van hoe cellen informatie in hun extracellulaire milieu interpreteren en hierop reageren. Hier presenteren we een hoogdoorlaatscreeningprotocol met behulp van kinasen gezuiverd uit zoogdiercellen om snel kinasen te identificeren die een substraat(s) van belang fosforyleren.

Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening

We beschrijven een op fluorescentie gebaseerde assay om fosfolipide-scrambling in grote unilamellaire liposomen gereconstitueerd met opsine te meten.

Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity

Hier presenteren we een ondersteunde lipid bilayer in het kader van een microfluïdisch platform om eiwit-fosfoinositide interacties te bestuderen met behulp van een etiketvrije methode op basis van pH-modulatie.

PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

Hier presenteren we een protocol bij het bepalen van protease specificiteit in ruwe muis weefsel extracten met behulp van spectrometrie van de MALDI-TOF.

De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Hier wordt een gevoelige fluorescentietest gepresenteerd om de Apolipoproteïne N-acyltransferase-activiteit te volgen met behulp van diacylglycerylpeptide en alkynfolipiden als substraten met klikchemie.

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

Hier beschrijven we protocollen met behulp van fluorescerende lipidesensoren en liposomen om te bepalen of een eiwit fosfatidylserine of fosfatidylinositol 4-fosfaat in vitroextraheert en transporteert .

Fluorescentie-gebaseerde metingen van fosfatidylserine / fosfatidylinositol 4-fosfaatuitwisseling tussen membranen

Dit protocol maakt gebruik van agarose zwelling als een krachtige en generaliseerbare techniek voor het opnemen van integrale membraaneiwitten (GMP's) in gigantische unilamellaire lipide blaasjes (GUVs), zoals hier beschreven voor de reconstructie van het menselijke 1A serotoninereceptoreiwit (5-HT1AR), een van de klassen van farmacologisch belangrijke G-eiwit-gekoppelde receptoren.

Constructie van modellipidenmembranen met G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's)

Een hangende drop surface filmbalans geïmplementeerd met een multi-subfase uitwisseling, bijgenaamd de OCTOPUS, maakt het mogelijk om spijsverteringsproblemen na te bootsen door de sequentiële subfase-uitwisseling van de originele bulkoplossing met gesimuleerde gastro-intestinale vloeistoffen. De gesimuleerde in vitro vertering wordt gemonitord door in situ de interfaciale spanning van de verteerde interfaciale laag te registreren.

In vitro Vertering van emulsies in een enkele druppel via multi-subfase-uitwisseling van gesimuleerde gastro-intestinale vloeistoffen

Deze methode beschrijft een op lectine gebaseerde in vitro sedimentatietest om de bindingsaffiniteit van glucaanfosfatase en amylopectine te kwantificeren. Deze co-sedimentatietest is betrouwbaar voor het meten van glucaanfosfatasesubstraatbinding en kan worden toegepast op verschillende opgeloste glucaansubstraten.

Concanavaline A-gebaseerde sedimentatietest om substraatbinding van glucaanfosfatasen te meten

We presenteren een kosteneffectieve methode voor het beoordelen van liposomale membraanpermeabiliteit met een superieure gevoeligheid en resolutie ten opzichte van conventionele technieken. Met behulp van een nieuwe ingekapselde ligandsubstitutiereactie detecteert deze techniek fosfolipase A 2-geïnduceerde veranderingen in modelmembranen. Deze toegankelijke benadering kan eenvoudig worden geïntegreerd met standaardanalyses en verbetert de resolutie voor het bestuderen van membraanbiofysica en...

Een liposoommembraanpermeabiliteitstest voor het onderzoeken van de effecten van fosfatidylinositolfosfaatgroepen op de membraneutrope werking van gif PLA2

Verken een methode om lipase- en fosfolipase-activiteit te optimaliseren en hun natuurlijke substraten te identificeren met behulp van celvrije eiwitextracten. Deze techniek versnelt het onderzoek naar enzymfuncties in lipide-metabolisme.

Het definiëren van de ondergrond hebben voor lipase en fosfolipase Kandidaten

Meer video's verkennen