Het definiëren van de ondergrond hebben voor lipase en fosfolipase Kandidaten

Het algemene doel van deze procedure is om de detectie van fysiologische substraten voor potentiële lipasen en fosfolipidasen te versnellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de Entomologie, zoals hoe fosfolipidasen bijdragen aan lipide-omvorming in biologische membranen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de optimalisatie van enzymatische activiteit en de zoektocht naar het natuurlijke substraat voor het enzym onafhankelijk van elkaar kunnen worden uitgevoerd.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de substraatspecificiteit van bacteriële lipasen en fosfolipidasen, kan deze ook worden aangepast om hydrolasen van andere modelorganismen te bestuderen. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we op zoek waren naar een enzymactiviteit die het intrinsieke membraanlipide fosfatidylcholine inorhizobium meliloti kon afbreken. Om celvrije eiwitextracten te bereiden, ontdooi de bacteriële celsuspensies en bewaar ze op ijs.

Geef de celsuspensies vervolgens drie keer door een koude drukcel bij 20.000 pond per vierkante inch. Verwijder de intacte cellen en celresten door centrifugatie bij 5.000 keer g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Bereid na de centrifugatie aliquots van 100 en 500 microliters uit het supernatant voor voor verdere analyse.

Stel het eerder geoptimaliseerde enzymassay in met behulp van de pipetteringsschema's die zijn opgenomen in het tekstprotocol. Gebruik voor een eerste dekking van verschillende enzymactiviteiten kunstmatige substraten die bij hydrolyse een gekleurd product opleveren, zoals para-nitrofenol of PNP-derivaten. Volg het tijdsverloop van een toename van de absorptie bij 405 nanometer, als gevolg van de vorming van PNP in een spectrofotometer bij 30 graden Celsius gedurende een periode van vijf minuten.

Voer ten slotte berekeningen uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Voor radiolabeling van lipiden, bereid een nachtcultuur van een organisme van belang in vijf milliliter van het gewenste kweekmedium en kweek bij 30 graden Celsius. Vanuit de pre-cultuur, inoculeer in 20 millimeter vers medium in een 100-millimeter kweekfles, om een ​​initiële optische dichtheid bij 620 nanometer van 0,3 voor de cultuur te verkrijgen.

Vervolgens brengt u een aliquot van één milliliter van de cultuur onder steriele omstandigheden over naar een steriele ronde bodempolystyreenbuis van 14 milliliter. Voeg één microcurie 114 c acetaat toe aan de een milliliter cultuur. Bewaar vervolgens de vloeibare cultuur gedurende 24 uur onder roeren bij 30 graden Celsius.

Aan het einde van de incubatieperiode brengt u de cultuur over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeert u deze gedurende vijf minuten bij 12.000 keer g bij kamertemperatuur. Breng de pellet opnieuw in suspensie in 100 microliter water. Bewaar de celsuspensie op dit punt bij min 20 graden Celsius of ga onmiddellijk verder met de extractie van polaire lipiden.

Voer de extractie van polaire lipiden uit door 375 microliter van een methanol-op-chloroform-oplossing van twee op één toe te voegen aan de 100 microliter waterige celsuspensie. Vorm het monster gedurende 30 seconden en incubeer het gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer het monster na incubatie gedurende vijf minuten bij 12.000 keer g bij kamertemperatuur.

Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens 125 microliter chloroform en 125 microliter water toe aan het supernatant. Centrifugeer het monster na 30 seconden voortbeweging gedurende één minuut bij 12.000 keer g bij kamertemperatuur.

Breng de onderste chloroformfase over naar een verse buis. Droog vervolgens de oplossing met een stroom stikstofgas. Los de gedroogde lipiden op in 100 microliter chloroform tot methanol-oplossing.

Voor scheiding van neutrale polaire lipiden door dunnelaagchromatografie, breng drie microliter aliquots van de lipidemonsters aan op een aluminium blad van hoogwaardige dunnelaagchromatografie silicagel, beginnend op twee centimeter van de randen van de plaat. Als meerdere monsters worden geanalyseerd in eendimensionele chromatografie, houdt u een afstand van minimaal 1,5 centimeter tussen de verschillende monsteraanbrengplaatsen. Breng de mobiele fase over naar een TLC-ontwikkelingskamer, intern bedekt met chromatografiepapier.

Bedek met een glazen plaat om de kamer 30 minuten te laten verzadigen. Breng de HPTLC Silica Gel aluminium plaat met de gedroogde lipidemonsters over naar de kamer. Laat de plaat 30 minuten ontwikkelen in een gesloten kamer voordat u de plaat verwijdert.

Laat vervolgens de oplosmiddelen gedurende twee uur drogen in een stroomkast. Zodra de ontwikkelde TLC-plaat droog is, incubeer het met een fotostimuleerbare luminescentiescherm in een gesloten cassette gedurende drie dagen. Breng vervolgens het geïncubeerde scherm bloot aan een PSL-scanner en verwerf een virtueel beeld van de gescheiden radiogelabelde lipiden.

Om diacylglycerol of DAG-lipase-activiteit te bepalen, voegt u eerst 5.000 CPM van 14 C-gelabeld DAG toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg ook een oplossing van Triton X-100 toe aan de buis en meng door middel van voortbeweging. Droog de oplossing onder een stroom stikstof.

Voor een uiteindelijke 100 microliter-assay, voegt u Tris-HCl-buffer, een natriumchlorideoplossing en tweemaal gedestilleerd water toe. Vorm het gedurende vijf seconden. Start de reactie door vijf microliter enzym aan de oplossing toe te voegen.

Incubeer de oplossing gedurende vier uur bij 30 graden Celsius. Stop de reactie door de toevoeging van 250 microliter methanol en 125 microliter chloroform, voordat u de lipiden extraheert zoals eerder in deze video beschreven. Ga door met het analyseren van neutrale polaire lipiden door 1DTLC en daaropvolgende PSL-beeldvorming zoals eerder.

Hoewel de voorspelde fosfolipidase SMc01003 activiteit vertoont met kunstmatige para-nitro