Name: In vivo studie van humane endotheliale-pericyte Interaction Met behulp van de Matrix Gel Plug Assay in Mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Leer de matrix gel plug assay om endotheel-pericyt interacties in vivo te bestuderen. Deze methode identificeert signaleringsroutes en genen gerelateerd aan vaatziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. K. Yuan werd ondersteund door een American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) en de Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Dr. V. de Jesus Perez werd ondersteund door een carrièreontwikkelingsaward van de Robert Wood Johnson Foundation, een NIH K08 HL105884-01 award, een Pulmonary Hypertension Association Award, een Biomedical Research Award van de American Lung Association en een Translational Research and Applied Medicine award van Stanford University.

Ethiek Verklaring: Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Stanford University School of Medicine. LET OP: De dieren zijn onder verdoving met 3% verdamper isofluraan en 3% levering van O 2 gas. Het gebruik van vet zalf op de ogen kan helpen tot droog te voorkomen dat tijdens het onder narcose. 1. Celbereiding <ol><li> Groeien humane endotheliale en pericyte celkweken in 100 mm platen met 10 ml van de geschikte media. Vervang 10 ml vers medium om de 2-3 dagen tot cellen te bereiken 80% samenvloeiing. <ol><li> Kweek endotheelcellen (EC) in alle endotheliale celmedium (ECM) aangevuld met bedrijf leverde 5% foetaal runderserum (FBS), 10% penicilline / streptomycine en 10% endotheelcel supplement. </li><li> Cultuur pericyten in volledige pericyte media (PM), aangevuld met bedrijf leverde 2% FBS, 10% penicilline / streptomycine en 10% pericyte groei supplement. </li&gt; </ol></li><li> Bereid cel mengsels <ol><li> Bereken het vereiste aantal cellen voor de experimentele en controlegroepen. OPMERKING: Elke plug in de experimentele groep bevat één miljoen (1 x 10 6) humane EC en tweehonderdduizend (2 x 10 5) pericytes. Voor de controlegroep, elke plug bevat slechts 1,2 miljoen menselijk EC. De negatieve controle groep heeft slechts matrix gel. Elke groep ten minste vier stekkers, die twee muizen vereisen pluggen kan worden geïnjecteerd in elke zijde van een muis onderrug. Drie connectors zouden dienen als triplo voor het experiment en de vierde kan worden gebruikt wanneer één uitvalt. Bereid 25% extra cellen om de extra volume van de gel aan te passen. </li><li> Verzamelen en cellen tellen vanaf kweekplaten. <ol><li> Om cellen los, verwijder media en eenmaal wassen met kamertemperatuur 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijderen PBS, voeg 1 ml 0,25% trypsine / 2,21 mM EDTA, en incubeer gedurende 1 min. Was de cellen van de plaat door toevoeging van 2ml medium en het verzamelen in een 15 ml buis. </li><li> Celtelling met een hemocytometer volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Centrifugeer de geschikte aantal cellen in een korrel bij 400 xg gedurende 5 minuten. Voor de experimentele groep, centrifuge zowel EC en pericytes beneden samen in een pellet. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Matrix gelbereiding <ol><li> Ontdooien matrix gel volledig bij 4 ° C gedurende 4 uur of een nacht om een ​​homogene oplossing te verkrijgen. Mengen niet vereist. </li><li> Aliquot matrix gel in 1,5 ml buisjes en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Pre-chill steriele 1,5 ml buizen en 28 G 1 cc insuline spuiten bij 4 ° C. Let op: Houd matrix gel op ijs te allen tijde. </li><li> Meng koude matrixgel met bFGF in een volumeverhouding van 1: 100 (eindconcentratie van bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF voorraadoplossing = 50 ug / ml) Na menging matrixgel oplossing en neer te pipetteren meerdere malen, incubeer op ijs gedurende 30 - 60 min before mengen met de cellen in stap 3,1. LET OP: Ontdooi de voorraad bFGF voor het mengen. Bereken het aantal pluggen nodig voor injectie. Bijvoorbeeld, elke plug vereist 200 pl matrix gel. Daarom bereiden 25% extra gel. </li></ol> 3. Meng Matrix Gel met cellen <ol><li> Voor elke groep, resuspendeer de celpellet (die geschikte aantal cellen) met de berekende hoeveelheid matrix gel met bFGF. Meng voorzichtig om schuimvorming te voorkomen en laat in de 15 ml buis op ijs tot muizen worden voorbereid voor injectie. </li></ol> 4. Mouse Voorbereiding <ol><li> Verdoven 1 SCID muizen gedurende 5 minuten in 3% Isofluraan plus 3% O 2 in een inductie kamer. Focus op een experimentele groep of 2 muizen per keer. </li><li> Verwijder de muis uit de inductie kamer, plaats op een verwarmingselement ventrale zijde naar beneden en snel bevestig een snuit pijpje in het gezicht van de muis via een niet-rebreathing systeem om de anesthesie te leveren gedurende de Injectie procedure. Zet de gasstroom uit de inductie kamer naar de open systeem en laat de gasdruk tot 1,5% isofluraan en 1,5% O2. </li><li> Verwijder haar van beide laterale achterste regio&#39;s (ongeveer 1 cm diameter) met een scheerapparaat of ontharingscrème. </li><li> Veeg de huid met een 70% alcohol pad. </li><li> Zet de muis om de inductie kamer en herhaal de stappen 4,2-4,4 met de tweede muis. </li></ol> 5. Matrix Gel Injection <ol><li> Bereid een muis voor injectie door het aanbrengen van de niet-rebreathing systeem en het op de verwarming pad ventrale zijde naar beneden. </li><li> Laad de matrix gel in een voorgekoeld 28 G 1 cc insulinespuit één muis tegelijk. <ol><li> Laad de volledige 500 pl volume matrixgel twee pluggen (200 gl per plug plus 25% extra) in de spuit. </li><li> Zorg ervoor dat de matrix gel in de muizen te injecteren binnen 3 minuten van het laden van de cellen in de spuit om de ce voorkomenlls van de afwikkeling naar de kant van de spuit en te voorkomen matrixgel stollen binnenzijde van de spuit. </li></ol></li><li> Til de achterkant huid om subcutane ruimte te vinden, dan injecteer 200 ul van de matrix gel langzaam en gelijkmatig in de subcutane ruimte van de achterkant posterior van de ribbenkast. </li><li> Verwijder de injectienaald langzaam en voorzichtig om te voorkomen dat matrix gel lekt uit de injectieplaats. Een bult zal vormen op de injectieplaats. Veeg de injectieplaats met een doekje met alcohol. </li><li> Tweede injectie stappen 5,2-5,5 aan de andere kant van de rug muis, laat de muis op de rug voor 1 min tot gelering van de gel matrix op het vuur pad mogelijk. </li><li> Schetsen beide bulten met behulp van een permanent marker om de bult te identificeren na 14 dagen. Na wat haar terug groeit, zal het makkelijker zijn om de bult te vinden. </li></ol> 6. Matrix Gel Plug Isolatie: 14 dagen na de injectie <ol><li> Euthanaseren de muizen op humane wijze door het blootstellen van het diers tot&gt; 5 min van inhalatie van kooldioxide, gevolgd door cervicale dislocatie gedood verzekeren. </li><li> Verwijder de matrix gel stekker uit de rug van de muis. <ol><li> Verwijder voorzichtig regrown haar rond de plaats van injectie, waar de stekker zich bevindt, herhaalt u stap 4.3. De markering lijn geeft het formaat van het origineel bult onder de huid. </li><li> Uitsnijden de plug samen met de omringende huid en spierlagen bevestigd aan de boven- en onderkant van de plug respectievelijk. <ol><li> Met behulp van fijne chirurgische schaar, een insnijding op de gemarkeerde rand van de plug die loodrecht op de huid en doorsnijden de spieren onder de plug. Vervolgens knip voorzichtig rond de omtrek van de plug op de gemarkeerde rand. </li><li> Trek de stekker, het houden van het ingeklemd tussen de huid en spieren lagen. Onmiddellijk spoelen in een kleine beker met 1x PBS weg te wassen overtollige bloed. De plug kan nu worden vastgesteld (volgende stap 6,3). </li></ol></li></ol></li><li> Bevestig de plug in 4% paraformaldehyde. <ol><li> Plaats het gehele plug met schil en spierlagen, in een 50 ml buis met 25 ml 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur bij kamertemperatuur zonder schokken. De volgende dag, de overdracht van de stekker in 25 ml 70% ethanol nog 24 uur voor inbedden in paraffine. OPMERKING: ga paraformaldehyde met de nodige voorzichtigheid. Draag handschoenen. </li></ol></li></ol> 7. Paraffine Verwerk de Matrix Gel Plug <ol><li> Maak de stekker voor paraffine inbedding. <ol><li> Richt de stekker zoals weergegeven in figuur 1a; de stekker in een weefselcassette dat de zijde van de stekker naar boven en zowel de huid als spierlagen zichtbaar over het oppervlak van het weefsel blok dat eerst wordt gesneden tijdens het snijden. </li></ol></li><li> Paraffine insluiten de stekker volgens standaard paraffine inbedding protocollen 13. </li><li> Snijd 8-10 urn dik secties af van het weefsel blok en monteren op microscoopglaasjes AccorDing standaard paraffine snijden protocollen 13. </li><li> Bewaar de dia&#39;s in een koele en droge plaats bij kamertemperatuur totdat klaar voor kleuring. </li></ol> 8. Stain secties met hematoxyline en eosine Stain (H &amp; E) 13 <ol><li> De-paraffinize de weefselcoupes door het passeren van de dia&#39;s door 100% xyleen tweemaal, 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en tenslotte 1x PBS, elk gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Laat objectglaasjes in 1x PBS tot de volgende stap. </li><li> Pipet 100 pi H &amp; E oplossing op de sectie en incubeer gedurende 1-5 min, of totdat er een duidelijke contrast tussen blauw kernen en roze cytoplasma in een cel als bekeken onder een rechtopstaande lichtmicroscoop bij 10x vergroting. Wees voorzichtig niet te laten H &amp; E oplossing te raken de doelstelling. </li><li> Wash H &amp; E oplossing off van de dia door dunking de dia in een grote beker van leidingwater, plaats dan de dia in een rek in de beker en spoelen met stromend water gedurende 2 minuten. </li><li> Move stap 9.8 op de objectglaasjes monteren. </li></ol> 9. Stain Andere Slides for Human haarvaten en pericytes <ol><li> De-paraffinize de weefselcoupes door het passeren van de dia&#39;s door 100% xyleen tweemaal, 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en tenslotte 1x PBS, elk gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Laat objectglaasjes in 1x PBS tot de volgende stap. </li><li> Kook de secties in antigen retrieval oplossing. <ol><li> In een 2 L beker bereiden kokende antigeenterugtrekking oplossing met 1 x citraatbuffer (pH 7,0) bij 95 ° C op een verwarmingsblok. </li><li> Eenmaal koken, plaats de dia&#39;s in een metalen rek en onder te dompelen in de kokende antigen retrieval oplossing gedurende 20 min. </li><li> Haal het bekerglas van de verwarming blok met de glijbanen nog steeds onder water en laat de oplossing langzaam terug naar kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 min. </li><li> Plaats de dia&#39;s in 1x PBS tot de volgende stap. </li></ol></li><li> Blokkeer de secties in het blokkeren van buffer (1x PBS, 5% Goat Serum, 00,3% Triton X-100). <ol><li> Teken een hydrofobe cirkel rond de randen van elke sectie met een PAP pen. </li><li> Plaats de objectglaasjes in een vochtige bak met gedestilleerd water op de bodem van de bak. </li><li> Pipetteer 100 ui blokkerende buffer op de secties zorgt ervoor dat alle van het weefsel is bedekt met vloeistof (kan meer dan 100 ul vereist). </li><li> Incubeer secties met blokkerende buffer gedurende 1 uur. </li></ol></li><li> Incubeer secties met primair antilichaam. <ol><li> Bereid een oplossing met twee primaire antilichamen de verschillende onderdelen voor CD31 (EC) en gladde spier actine (pericyten) verdund in verdunningsbuffer (1 x PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100) probe. OPMERKING: Hier, anti-CD31 concentratie 01:50 en anti-gladde spier actine concentratie 1: 300. </li><li> Incubeer de secties overnacht bij 4 ° C met 100 gl primaire antilichamen in een vochtige bak met gedestilleerd water. </li></ol></li><li> Was de dia driemaal 1x PBST (1x PBS + 0,1% TweEN20) gedurende 5 minuten elke wasbeurt. </li><li> Incubeer secties met secundair antilichaam. <ol><li> Bereid een oplossing met een fluorofoor geconjugeerd geit anti-konijn secundair antilichaam aan het anti-CD31 antilichaam van konijn verdund in verdunningsbuffer herkennen. <ol><li> OPMERKING: De gladde spier actine primaire antilichaam is geconjugeerd met een al CY3 fluorofoor, dus geen secundair antilichaam kleuring nodig. Goat-anti konijn secundair concentratie antilichaam 1: 250. </li></ol></li><li> Incubeer de secties gedurende 1 uur met 100 ul secundair antilichaam in de luchtvochtigheid bak met gedestilleerd water. </li></ol></li><li> Was de dia&#39;s drie keer in 1x PBST gedurende 5 minuten elke wasbeurt. </li><li> Monteer de dia&#39;s. <ol><li> Pipetteer 2-3 druppels (~ 40 - 60 pl) van antifade bevestigingsoplossing met DAPI kleuring van kernen op elke sectie. </li><li> Plaats voorzichtig een nee. 1,5 dekglas via secties en montage oplossing, waardoor de vloeistof verspreid over de delen en de randen vanhet deksel slip. Voorzichtig gebruik van een vinger uit te drukken luchtbellen die over de sectie kan worden gevestigd. </li><li> Laat de dia&#39;s drogen gedurende ten minste 1 uur voordat het. </li></ol></li></ol> 10. Kwantificeer capillaire dichtheid en structuur 14 <ol><li> Tel het aantal capillairen in H &amp; E gekleurde coupes, uitgedrukt als # / mm 2. <ol><li> Verwerven foto&#39;s van vier verschillende velden op een rechtopstaande lichtmicroscoop onder 40x vergroting. OPMERKING: Haarvaten geïdentificeerd als buizen gevuld met rode bloedcellen. </li><li> In plaats van handmatig tellen capillairen gebruikt beeldanalyse software (bijv Wimasis Image Analysis) om verschillende parameters zoals angiogenese vaartuignummer, gemiddelde duur vaartuig en diameter, en vertakkingspunten kwantificeren. </li></ol></li><li> Analyseer capillaire structuur in immunofluorescentie-gekleurde coupes. <ol><li> Verwerven foto&#39;s van vier verschillende velden op een omgekeerde fluorescentiemicroscoopmet FITC en TxRed filter kubus. <ol><li> Gebruik een FITC kubus afbeelding EC door excitatie bij 488 nm golflengte en gebruik een TxRed kubus afbeelding pericyten door excitatie bij 594 nm golflengte. <style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
			</style><style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
span.s1 {letter-spacing: -0.1px}
			</style><style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
span.s1 {letter-spacing: -0.1px}
			</style><style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
span.s1 {letter-spacing: -0.1px}
			</style></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li>
<li>Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pericytes+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of pericytes in angiogenesis.</a> Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).</li>
<li>Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three+dimensional+collagen+matrix+models+of+endothelial+lumen+formation+during+vasculogenesis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis.</a> Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).</li>
<li>Liu, Y., Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-specific+activation+of+Src+and+Rho+initiates+capillary+morphogenesis+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells.</a> FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).</li>
<li>Grant, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+endothelial+cells+with+a+laminin+A+chain+peptide+%28SIKVAV%29+in+vitro+and+induction+of+angiogenic+behavior+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo.</a> J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).</li>
<li>Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+modulation+of+endothelial+cells+by+transforming+growth+factor-beta+depends+upon+the+composition+and+organization+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix.</a> J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).</li>
<li>Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+10-day-old+chick+embryo+model+for+studying+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).</li>
<li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+pathway+is+required+for+pericyte+recruitment+during+pulmonary+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis.</a> Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).</li>
<li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+estrogen+receptor+gene+prevents+17+beta+estradiol-induced+angiogenesis+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice.</a> Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).</li>
<li>Chen, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pericytes+for+ischemic+heart+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human pericytes for ischemic heart repair.</a> Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).</li>
<li>Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+blood+vessels%2C+endothelial+cells%2C+and+vascular+pericytes+in+insulin+secretion+and+peripheral+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action.</a> Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).</li>
<li>Ricard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+pericyte+coverage+mediated+by+endothelial-derived+fibroblast+growth+factor-2+and+interleukin-6+is+a+source+of+smooth+muscle-like+cells+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension.</a> Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).</li>
<li>Buchwalow, I. B., Bocker, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchwalow%2C+IB+%22Immunohistochemistry%3A+Basics+and+Methods%22">Immunohistochemistry: Basics and Methods</a>. , 1-153 (2010).</li>
<li>Tata, D. A., Anderson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+investigation+of+capillary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method for the investigation of capillary structure.</a> J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).</li>
</ol>

Geen concurrerende financiële belangen inbegrepen.

De matrix gel plug bepaling blijkt een gemakkelijke en krachtige methode om genregulatie in angiogenese, angiogene en anti-angiogene verbindingen in vivo te evalueren en in vitro testen kunnen vullen. Hier beschrijven we in detail een nieuwe matrix gel plug assay van humane angiogenese die de interactie tussen endotheliale cellen en pericyten onderzoekt bij bloedvatvorming. Er zijn een paar nieuwe en kritische stappen in dit protocol. Cellen in lage passage (passage 1-4) de...

Angiogenese is het proces waardoor nieuwe bloedvaten worden gevormd uit een reeds bestaande vasculaire netwerk 1 en is het onderwerp van onderzoek in vele gebieden, variërend van normale ontwikkeling ziekten. Dit dynamische proces omvat de proliferatie en migratie van endotheelcellen (EC) en de aanwerving van pericytes een vasculaire buis die is gericht op de site die zuurstof en voedingsstoffen levering 2 moet construeren. Studeren vereist deze werkwijze een even dynamische test, vooral degene die de driedimensionale aard van vaatvorming kan herhalen. In vitro 3D matrix assays ontwikkeld om deze behoefte en goed gefunctioneerd om onderzoekers de discrete stappen in ruimte en tijd waarin angiogenese plaatsvindt 3, 4, 5, 6 definiëren. Echter, deze in vitro 3D matrixmodellen beperkt tot het bestuderen van niet-geperfuseerde vaten ind daarom geen kritische componenten die relevant zijn voor het proces van angiogenese (bijv circulerende groei en remmende factoren, onnatuurlijke spanningen / krachten over het vasculaire bed) en niet aan de complexe omgeving aanwezig in levend weefsel te simuleren. Om deze beperking te pakken zijn verscheidene in vivo angiogenese assays ontwikkeld 7, waaronder de matrixgel plug assay die de focus van ons rapport 8, 9 zijn. De matrix gel plug test is een gevestigde in vivo angiogenese assay dat een beroep op de onderzoekers omdat het een robuust platform om de rol van de verschillende cellen en stoffen bij angiogenese te testen. Matrixgel is een commercieel verkrijgbare basaalmembraan oplossing die wordt afgescheiden door de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muizen sarcoma cellijn die stolt tot een gel-achtig materiaal bij 37 ° C. De gel matrix kan worden gemengd met cellen en / of stoffen, zoals groeifactoren en injesubcutaan cted in de muis. De gastheer EC zal de plug binnenvallen meer dan 14 dagen, vormen een vasculair netwerk, en raken perfusie met bloed van de gastheer. Tot op heden zijn matrixgel plug assays uitsluitend gericht op de studie van endotheelcellen gedrag tijdens angiogenese echter om ons beste weten geen inspanningen nog uitgevoerd om te bepalen of deze assay kan worden gebruikt voor co-kweek endotheelcellen en pericyten te bestuderen hoe deze twee celtypen interactie tijdens angiogenese. Specifiek, inzicht in de relatie tussen EC en pericyten is waardevol voor het bestuderen van ziekten waarbij bloedvat verlies pathologisch, waaronder microvasculaire ischemie en perifere vaatziekte 10, 11, 12. We beschrijven een protocol dat humaan afgeleide pericytes introduceert de matrixgel mengsel samen met humane EC en fibroblast groeifactor (bFGF). Dit mengsel kan vervolgens subcutaan in het dorsale gedeelte van SCID muizen om de vorming van volledig functioneel, pericyte gecoat, hybride schepen toe te staan. Ons protocol beschrijft hoe matrix gel pluggen die humane EC met of zonder menselijke pericytes, plaatsing in SCID muizen en hoe de histologische secties voor kritische angiogenese eindpunten te analyseren voor te bereiden.

<table><tbody><tr><td>PBS (Phosphate buffered saline)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Media (ECM) kit</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td>includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td></tr><tr><td>Pericyte Media (PM) kit</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td>includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td></tr><tr><td>primary human pulmonary microvascular endothelial cells</td><td>Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td><td></td><td>this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4</td></tr><tr><td>primary human pulmonary pericytes</td><td>Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td><td></td><td>this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4</td></tr><tr><td>bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>stock solution is 50 µg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 µl and stored at -20 degrees</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 cc Insluin Syringe</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age</td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 ml screw top tubes, sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Nair hair removal cream</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD31 primary antibody</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B4737</td><td>working solution is 1:50</td></tr><tr><td>anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>working solution is 1:300</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>working solution is 1:250</td></tr><tr><td>Prolong Gold DAPI solution</td><td>Cell Signaling</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>no. 1.5 cover slips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>citrate buffer 10x</td><td>Millipore</td><td>21545</td><td></td></tr><tr><td>extra fine surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Formalin (paraformaldehyde)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>245-685</td><td></td></tr><tr><td>Tissue cassettes</td><td>Simport</td><td>M492-12</td><td></td></tr><tr><td>goat serum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo studie van humane endotheliale-pericyte interaction met behulp van de matrix gel plug assay in mouse

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is het proces waarbij nieuwe bloedvaten worden gevormd uit bestaande vaten. Nieuwe vaatgroei vereist gecoördineerde proliferatie, migratie en uitlijning van endotheelcellen om buisvormige structuren te vormen, gevolgd door de rekrutering van pericyten om wandondersteuning te bieden en de vatmaturatie te vergemakkelijken. Huidige in vitro celkweekbenaderingen kunnen het complexe biologische milieu waarin endotheelcellen en pericyten interageren om functionele vaten te produceren niet volledig reproduceren. We presenteren een nieuwe toepassing van de in vivo matrix gel plug test om endotheel-periccyte interacties en de vorming van functionele bloedvaten te bestuderen met behulp van muizen met een ernstige gecombineerde immuundeficiëntiemutatie (SCID). In het kort, matrixgel wordt gemengd met een oplossing die endotheelcellen bevat met of zonder pericyten, gevolgd door injectie in de rug van geanesthetiseerde SCID-muizen. Na 14 dagen worden de matrix gel plugs verwijderd, gefixeerd en gesneden voor histologische analyse. De lengte, het aantal, de grootte en de mate van periccytenbedeking van volwassen vaten (gedefinieerd door de aanwezigheid van rode bloedcellen in het lumen) kunnen worden gekwantificeerd en vergeleken tussen experimentele groepen met behulp van commerciële statistische platforms. Naast het gebruik als een angiogenesis test, kan deze matrix gel plug test worden gebruikt om genetische studies uit te voeren en als platform voor medicijnontdekking. Kortom, dit protocol zal onderzoekers in staat stellen om beschikbare in vitro tests aan te vullen voor de studie van endotheel-periccyte interacties en hun relevantie voor systemische of pulmonaire angiogenesis.

Vertegenwoordiger H &amp; E en immunofluorescentie kleuring van matrix gel plug secties worden weergegeven in figuur 2. De artikelen van EG uitsluitend stekkers weer enkele schepen die meestal niet worden geperfuseerd met bloed (Figuur 2 linksboven, zwarte pijlen), terwijl pluggen die zowel EC en pericytes tonen verschillende geperfundeerde schepen met grotere diameters en complete pericyte dekking, zoals blijkt uit de positieve SMA kleuring direct grenz...

We presenteren een protocol voor humane endotheliale pericyte-interacties in muizen te bestuderen onder toepassing van een variatie van de matrix gel plug angiogenese assay.

In vivo studie van humane endotheliale-pericyte Interaction Met behulp van de Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

Het algemene doel van deze in-vivo matrixgel-assay is om de interactie van endotheelcellen met parasieten te onderzoeken. Deze matrigel-assay is ontworpen om onderzoekers te helpen bij het bestuderen van de belangrijkste stappen in de angiogenese. Daarnaast maakt het de identificatie mogelijk van signaleringspaden die verantwoordelijk zijn voor cruciale stappen in de bloedvatvorming, alsofmede genen waarvan disfunctie kan leiden tot vasculaire aandoeningen en andere aberraties van de angiogenese.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om de in-vivo bloedvatvorming te bestuderen waarbij zowel endotheelcellen als hun ondersteunende cellen, pericyten, betrokken zijn. Begin met het kweken van menselijke endotheel- en parasietcelculturen op 100-millimeter platen met 10 milliliters van het geschikte medium. Ververs het medium elke twee tot drie dagen totdat de cellen een confluentie van 80% bereiken.Om de matrixgel-oplossing ter menging met de cellen voor te bereiden, wordt een voorraad matrixgel overnacht ontdooid bij vier graden Celsius. Maak vervolgens aliquoten van 1,5 milliliter voor langdurige bewaring bij negatief-20 graden Celsius, of voor maximaal twee weken bij vier graden Celsius. Voor elke experimentele plug is 200 microliters matrixgel nodig.Eén voorraadbuis kan dus zes plugs voorzien met een overschot van 25%. Bereid elk benodigde aliquoot voor gebruik door 15 µL ontdooide 100x beta-FGF-voorraad toe te voegen. Meng de beta-FGF in de oplossing door te pipetteren en incubeer vervolgens ten minste 30 minuten op ijs voordat de cellen worden toegevoegd.Koel op dit punt enkele 28-gauge 1cc insulinespuiten voor de injecties. Om de cellen uit de kweekplaten te oogsten, verwijdert u het medium en wast u de cellen eenmaal met PBS. Voeg na het verwijderen van de PBS één milliliter trypsine-oplossing toe en plaats de platen gedurende één minuut terug in de incubator.Pipette vervolgens twee milliliters kweekmedium over de platen om de cellen los te maken en verzamel het medium in een 15 milliliter buis. Controleer nu de concentratie van de collecties met behulp van een hemocytometer. Bereid daarna aliquots van cellen voor in 15 milliliter buizen.Voor de experimentele groep wordt hier een combinatie van één miljoen endotheelcellen en 200.000 parasieten gebruikt. Centrifugeer vervolgens de celaliquots bij 400g gedurende vijf minuten. Voeg daarna het berekende volume matrixgel toe aan de celpellet en meng dit voorzichtig door te pipetteren zodat er geen schuim ontstaat, aangezien luchtbellen niet geïnjecteerd kunnen worden.Houd de preparaten nu op ijs tot de muizen klaar zijn voor injectie. Nadat een muis is geanestheseerd met isofluraan en de anesthetische toestand is bevestigd met een knijptest in de teen, wordt de muis aangesloten op het non-rebreathing systeem dat isofluraan toedient en op het warmtekussen geplaatst, met de ventrale zijde naar beneden. Verwijder nu ongeveer een vierkante centimeter haar van beide laterale achterregio's.Reinig vervolgens de blootgestelde huid met 70% alcohol. Laad daarna één milliliter van de bereide celoplossing in een gekoelde spuit, wat voldoende is voor vier plugs. Om een injectie uit te voeren, til je de huid op de rug op om de subcutane ruimte te lokaliseren.Injecteer vervolgens langzaam en gelijkmatig 200 µL in de subcutane ruimte achter de ribbenkast en verwijder de naald langzaam om lekken te voorkomen. Na de injectie zal er een bult op de injectieplaats ontstaan. Veeg de plek af met alcohol en omcirkel de bult vervolgens met een permanente marker, zodat deze later teruggevonden kan worden.Herhaal vervolgens de injectieprocedure aan de andere zijde van de muis. Zorg ervoor dat alle cellen binnen drie minuten worden geïnjecteerd, anders zullen ze aan de spuit gaan kleven. De injectiestap is cruciaal om correct uit te voeren, zodat de matrixgelplug zich tussen de huid- en spierlagen vormt, waardoor de plug een goede vorm behoudt en niet diffuus wordt.Voordat u overgaat tot het injecteren van de volgende muis, laat u de geïnjecteerde muis een minuut op het warmtekussen blijven zodat de matrix de tijd heeft om te geleren. Plaats de muis na euthanasie op de operatietafel. Verwijder eventueel teruggegroeid haar van de injectieplaats en zoek de markerlijnen die de locatie van de plug aangeven.Maak vervolgens met een fijne chirurgische schaar een incisie langs de gemarkeerde rand van de plug, loodrecht op de huid en door tot aan de onderliggende spier. Snijd voorzichtig rondom de periferie van de gemarkeerde rand. Verwijder daarna de plug, waarbij deze tussen de huid- en spierlagen wordt gehouden.Spoel de plug onmiddellijk af in een klein bekerglas met PBS om het bloed te verwijderen. Plaats vervolgens de gehele plug in een buis van 50 milliliter met 25 milliliter 4%paraformaldehyde. Laat deze 24 uur lang fixeren bij kamertemperatuur zonder agitatie.Overdraag de pluggen de volgende dag naar 25 milliliters 70% ethanol voor 24 uur. Ga vervolgens over tot paraffine-inbedding. Secties van pluggen die uitsluitend endotheelcellen bevatten, laten zien dat sommige vaten na 14 dagen in-vivo niet worden geperfuseerd met het bloed van de gastheer.Daarentegen vertonen pluggen die zowel endotheelcellen als parasieten bevatten na 14 dagen in-vivo veel geperfuseerde vaten. Deze pluggen bevatten cellen die positief zijn voor glad spieractinestaining, zichtbaar in het rood, direct grenzend aan CD31-positieve endotheelcellen, zichtbaar in het groen. Daarom kunnen parasieten een aanzienlijke rol spelen bij de vorming van nieuwe bloedvaten.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze krachtige in-vivo techniek kunt toepassen om de vorming van bloedvaten in meerdere celtypen te bestuderen. Deze techniek zal de weg vrijmaken voor onderzoekers om diverse onderwerpen binnen de vasculaire biologie in muismodellen te verkennen. Na deze procedure kunnen ook andere methoden, zoals kwantitatieve PCR en Western immunoblotting, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals veranderingen in genexpressie en proteomica.Deze krachtige techniek stelt de onderzoeker in staat om in-vivo te bestuderen hoe endotheelcellen en parasieten interageren tijdens de vorming van bloedvaten, wat een cruciale stap is bij angiogenese. Deze krachtige techniek stelt de onderzoeker daarnaast in staat om andere cel-celinteracties te bestuderen die relevant zijn voor het begrijpen van vasculaire aandoeningen, zoals onder andere pulmonale hypertensie.

in-vivo-study-human-endothelial-pericyte-interaction-using-matrix-gel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een methode om menselijk navelstrengbloed afgeleide endotheel kolonie-vormende cellen (ECFCs) en beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's), ingebed in een collageen / fibronectine gel, subcutaan in immunodeficiënte muizen. Te leveren Deze cel / gel combinatie genereert een humane vasculaire netwerk dat verbindt met de muis vaatstelsel.

Bioengineering Human Microvasculaire Netwerken in immunodeficiënte muizen

In this video, we demonstrate the real-time visualization of blood cell-endothelial interactions in the mesenterial veins of a mouse model injected intraperitoneally with lipopolysaccharide.

Intravital Microscopy to Analyze Blood Cell-Endothelial Interactions in an Inflammation Mouse Model

De endotheliale glycocalyx / endotheliale oppervlaktelaag is ideaal bestudeerd met behulp van intravitale microscopie. Intravitale microscopie is technisch uitdagend in een bewegend orgaan zoals de longen. We zien hoe gelijktijdige helderveld en fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om endotheeloppervlak laagdikte schatten in een vrij...

In vivo meting van de muis Pulmonary Endothelial oppervlaktelaag

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

We beschrijven een matrigel-plugtest om het angiogeen potentieel van een pool van factoren te illustreren die worden afgescheiden door kankercellen, met behulp van twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten, echografie en endomicroscopie. De matrigel, een buitencelmatrix (ECM)-nabootsende gel, wordt gebruikt om de gastheer (muis) te introduceren met angiogeen factoren die worden afgescheiden naar het geconditioneerde medium...

Monitoring Functionaliteit en morfologie van vaatstelsel aangeworven door gesekreteerd door Snelgroeiende Tumor genererende cellen

Om de interactie van bacteriën met de bloedvaten onder afschuifspanning te bestuderen, worden een stromingskamer en een in vivo mesenteriale intravitale microscopiemodel beschreven die het mogelijk maken om de bacteriële en gastheerfactoren die bijdragen aan vasculaire adhesie te ontleden.

In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen

Deze vereenvoudigde toepassing van intravitale microscopie van mesenterische aderen bij muizen kan worden gebruikt in verschillende ontstekingsmodellen om leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukemie-interacties te observeren.

Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen

Het behoud van de bloeddrukbarriere dekking is de sleutel voor de homeostase van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft in vitro technieken om de fundamentele en pathologische processen te definiëren die de bloeddrukbeperking moduleren.

In Vitro- analyses voor het beoordelen van bloed-hersenbarrière Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Dit protocol presenteert een kraal roman in vitro assay dat meer modellen op de juiste wijze het proces van in vivo angiogenese kiemen door pericytes op te nemen. Deze wijziging maakt het mogelijk de bepaling van de kraal te recapituleren meer getrouw de heterotypic cellulaire interacties tussen endotheliale cellen en muurschildering cellen die essentieel zijn voor angiogenese.

Integratie van Pericytes in een parel van de Endothelial cel kiemen Assay

Deze test maakt gebruik van embryonale stamcellen van muizen gedifferentieerd in embryoïde lichamen gekweekt in 3D-collageengel om de biologische processen te analyseren die kiemende angiogenese in vitro beheersen. De techniek kan worden toegepast voor het testen van medicijnen, het modelleren van ziekten en voor het bestuderen van specifieke genen in de context van deleties die embryonaal dodelijk zijn.

In vitro Driedimensionale kiemtest van angiogenese met behulp van embryonale stamcellen van muizen voor vaatziektemodellering en drugstests

De hier gepresenteerde methode kan het effect van reagentia op angiogenese of vasculaire permeabiliteit in vivo evalueren zonder kleuring. De methode maakt gebruik van dextran-FITC-injectie via de staartader om neovaten of vasculaire lekkage te visualiseren.

Gemodificeerde In Vivo Matrix Gel Plug Assay voor Angiogenesestudies

Leer de matrix gel plug assay om endotheel-pericyt interacties in vivo te bestuderen. Deze methode identificeert signaleringsroutes en genen gerelateerd aan vaatziekten.

In vivo studie van humane endotheliale-pericyte Interaction Met behulp van de Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Meer video's verkennen