In vivo studie van humane endotheliale-pericyte Interaction Met behulp van de Matrix Gel Plug Assay in Mouse
19 december 2016
We presenteren een protocol voor humane endotheliale pericyte-interacties in muizen te bestuderen onder toepassing van een variatie van de matrix gel plug angiogenese assay.
Het algemene doel van deze in-vivo matrixgel-assay is om de interactie van endotheelcellen met parasieten te onderzoeken. Deze matrigel-assay is ontworpen om onderzoekers te helpen bij het bestuderen van de belangrijkste stappen in de angiogenese. Daarnaast maakt het de identificatie mogelijk van signaleringspaden die verantwoordelijk zijn voor cruciale stappen in de bloedvatvorming, alsofmede genen waarvan disfunctie kan leiden tot vasculaire aandoeningen en andere aberraties van de angiogenese.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om de in-vivo bloedvatvorming te bestuderen waarbij zowel endotheelcellen als hun ondersteunende cellen, pericyten, betrokken zijn. Begin met het kweken van menselijke endotheel- en parasietcelculturen op 100-millimeter platen met 10 milliliters van het geschikte medium. Ververs het medium elke twee tot drie dagen totdat de cellen een confluentie van 80% bereiken.
Om de matrixgel-oplossing ter menging met de cellen voor te bereiden, wordt een voorraad matrixgel overnacht ontdooid bij vier graden Celsius. Maak vervolgens aliquoten van 1,5 milliliter voor langdurige bewaring bij negatief-20 graden Celsius, of voor maximaal twee weken bij vier graden Celsius. Voor elke experimentele plug is 200 microliters matrixgel nodig.
Eén voorraadbuis kan dus zes plugs voorzien met een overschot van 25%. Bereid elk benodigde aliquoot voor gebruik door 15 µL ontdooide 100x beta-FGF-voorraad toe te voegen. Meng de beta-FGF in de oplossing door te pipetteren en incubeer vervolgens ten minste 30 minuten op ijs voordat de cellen worden toegevoegd.
Koel op dit punt enkele 28-gauge 1cc insulinespuiten voor de injecties. Om de cellen uit de kweekplaten te oogsten, verwijdert u het medium en wast u de cellen eenmaal met PBS. Voeg na het verwijderen van de PBS één milliliter trypsine-oplossing toe en plaats de platen gedurende één minuut terug in de incubator.
Pipette vervolgens twee milliliters kweekmedium over de platen om de cellen los te maken en verzamel het medium in een 15 milliliter buis. Controleer nu de concentratie van de collecties met behulp van een hemocytometer. Bereid daarna aliquots van cellen voor in 15 milliliter buizen.
Voor de experimentele groep wordt hier een combinatie van één miljoen endotheelcellen en 200.000 parasieten gebruikt. Centrifugeer vervolgens de celaliquots bij 400g gedurende vijf minuten. Voeg daarna het berekende volume matrixgel toe aan de celpellet en meng dit voorzichtig door te pipetteren zodat er geen schuim ontstaat, aangezien luchtbellen niet geïnjecteerd kunnen worden.
Houd de preparaten nu op ijs tot de muizen klaar zijn voor injectie. Nadat een muis is geanestheseerd met isofluraan en de anesthetische toestand is bevestigd met een knijptest in de teen, wordt de muis aangesloten op het non-rebreathing systeem dat isofluraan toedient en op het warmtekussen geplaatst, met de ventrale zijde naar beneden. Verwijder nu ongeveer een vierkante centimeter haar van beide laterale achterregio's.
Reinig vervolgens de blootgestelde huid met 70% alcohol. Laad daarna één milliliter van de bereide celoplossing in een gekoelde spuit, wat voldoende is voor vier plugs. Om een injectie uit te voeren, til je de huid op de rug op om de subcutane ruimte te lokaliseren.
Injecteer vervolgens langzaam en gelijkmatig 200 µL in de subcutane ruimte achter de ribbenkast en verwijder de naald langzaam om lekken te voorkomen. Na de injectie zal er een bult op de injectieplaats ontstaan. Veeg de plek af met alcohol en omcirkel de bult vervolgens met een permanente marker, zodat deze later teruggevonden kan worden.
Herhaal vervolgens de injectieprocedure aan de andere zijde van de muis. Zorg ervoor dat alle cellen binnen drie minuten worden geïnjecteerd, anders zullen ze aan de spuit gaan kleven. De injectiestap is cruciaal om correct uit te voeren, zodat de matrixgelplug zich tussen de huid- en spierlagen vormt, waardoor de plug een goede vorm behoudt en niet diffuus wordt.
Voordat u overgaat tot het injecteren van de volgende muis, laat u de geïnjecteerde muis een minuut op het warmtekussen blijven zodat de matrix de tijd heeft om te geleren. Plaats de muis na euthanasie op de operatietafel. Verwijder eventueel teruggegroeid haar van de injectieplaats en zoek de markerlijnen die de locatie van de plug aangeven.
Maak vervolgens met een fijne chirurgische schaar een incisie langs de gemarkeerde rand van de plug, loodrecht op de huid en door tot aan de onderliggende spier. Snijd voorzichtig rondom de periferie van de gemarkeerde rand. Verwijder daarna de plug, waarbij deze tussen de huid- en spierlagen wordt gehouden.
Spoel de plug onmiddellijk af in een klein bekerglas met PBS om het bloed te verwijderen. Plaats vervolgens de gehele plug in een buis van 50 milliliter met 25 milliliter 4%paraformaldehyde. Laat deze 24 uur lang fixeren bij kamertemperatuur zonder agitatie.
Overdraag de pluggen de volgende dag naar 25 milliliters 70% ethanol voor 24 uur. Ga vervolgens over tot paraffine-inbedding. Secties van pluggen die uitsluitend endotheelcellen bevatten, laten zien dat sommige vaten na 14 dagen in-vivo niet worden geperfuseerd met het bloed van de gastheer.
Daarentegen vertonen pluggen die zowel endotheelcellen als parasieten bevatten na 14 dagen in-vivo veel geperfuseerde vaten. Deze pluggen bevatten cellen die positief zijn voor glad spieractinestaining, zichtbaar in het rood, direct grenzend aan CD31-positieve endotheelcellen, zichtbaar in het groen. Daarom kunnen parasieten een aanzienlijke rol spelen bij de vorming van nieuwe bloedvaten.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze krachtige in-vivo techniek kunt toepassen om de vorming van bloedvaten in meerdere celtypen te bestuderen. Deze techniek zal de weg vrijmaken voor onderzoekers om diverse onderwerpen binnen de vasculaire biologie in muismodellen te verkennen. Na deze procedure kunnen ook andere methoden, zoals kwantitatieve PCR en Western immunoblotting, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals veranderingen in genexpressie en proteomica.
Deze krachtige techniek stelt de onderzoeker in staat om in-vivo te bestuderen hoe endotheelcellen en parasieten interageren tijdens de vorming van bloedvaten, wat een cruciale stap is bij angiogenese. Deze krachtige techniek stelt de onderzoeker daarnaast in staat om andere cel-celinteracties te bestuderen die relevant zijn voor het begrijpen van vasculaire aandoeningen, zoals onder andere pulmonale hypertensie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol presenteert een methode om interacties tussen humane endotheelcellen en pericyten in vivo te bestuderen met behulp van een matrixgelplug-angiogenesassay. De assay is erop gericht de signaleringspaden die betrokken zijn bij de vorming van bloedvaten te verduidelijken en genen te identificeren die geassocieerd zijn met vasculaire aandoeningen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Angiogenese
- Celinteracties
- Vasculaire biologie
Achtergrond
- De interactie tussen endotheelcellen en pericyten is cruciaal voor de stabiliteit van bloedvaten.
- Inzicht in deze interacties kan aanwijzingen verschaffen over vasculaire aandoeningen.
- De matrixgel-plug-assay maakt in vivo observatie van deze processen mogelijk.
- Eerdere studies hebben het belang van signaleringspaden bij angiogenese benadrukt.
Doel van de studie
- Om interacties tussen endotheelcellen en pericytcellen te onderzoeken.
- Om signaleringspaden te identificeren die betrokken zijn bij de vorming van bloedvaten.
- Om genen te onderzoeken die bij disfunctie kunnen leiden tot vasculaire aandoeningen.
Gebruikte methoden
- In vivo matrix-gel-assay.
- Kweek van menselijke endotheel- en pericytcellen.
- Observatie van bloedvatvorming.
- Analyse van signaleringsroutes en genexpressie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle totstandkoming van interacties tussen endotheelcellen en pericyten in vivo.
- Identificatie van belangrijke signaleringspaden die betrokken zijn bij angiogenese.
- Inzichten in genen die geassocieerd zijn met vasculaire aandoeningen.
- Demonstratie van de voordelen van de matrix gel plug-assay.
Conclusies
- De matrixgelplug-assay is effectief voor het bestuderen van interacties tussen endotheelcellen en pericyten.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de bloedvatvorming.
- Potentiële implicaties voor therapeutische strategieën gericht op vasculaire aandoeningen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Deze in vivo matrix-gelplug-assay vult een kritisch gat in het onderzoek naar angiogenese door de bestudering van interacties tussen menselijke endotheelcellen en pericyten binnen een fysiologische micro-omgeving mogelijk te maken, wat essentieel is voor het verminderen van risico's bij de validatie van vasculaire targets en het verbeteren van het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen. De assay ondersteunt mechanistische studies naar de rijping van bloedvaten en de rekrutering van pericyten, wat translationele relevantie biedt voor pulmonale en systemische vasculaire aandoeningen. Het vult bestaande in vitro systemen aan door functionele read-outs te leveren, zoals de vorming van geperfuseerde vaten en pericytdekking, die direct toepasbaar zijn in workflows voor targetvalidatie en lead-identificatie binnen biopharma R&D.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar therapeutische hypothesen over endotheliaal-pericyten-signalering bij vasculaire rijping.
- Operationele waarde: Biedt een ziekterelevant systeem om target-engagement en padmodulatie in vivo te beoordelen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt mechanische risicoreductie door de functionele rol van pericyten bij vaatstabiliteit en perfusie te verduidelijken.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, op histologie gebaseerde resultaten, waaronder vaatlengte, aantal, grootte en pericytbedekking voor comparatieve analyse.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare vasculaire meetwaarden die geschikt zijn voor assay-validatie en compound-screeningcascades.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt de preparatie van gevalideerde biologische systemen mogelijk voor downstream-evaluatie van angiogene of anti-angiogene kandidaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterelevant model voor de studie naar vasculaire aandoeningen, zoals pulmonale hypertensie, via enting van menselijke cellen in immuungecompromitteerde muizen.
- Operationele waarde: Faciliteert de afstemming van translationele biomarkers door pericytenbedekking en vaatrijping te koppelen aan functionele uitkomsten.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt preklinische continuïteit door beoordeling mogelijk te maken van genetische of farmacologische interventies op de vorming van het vasculaire netwerk.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische evaluatie, in het bijzonder voor programma's in de vasculaire biologie die functionele validatie van angiogene of vaatstabiliserende mechanismen vereisen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door observatie van de interactie tussen endotheelcellen en pericyten in een levende micro-omgeving mogelijk te maken.
- Screening: Maakt assays gereed via gestandaardiseerde plugvorming, fixatie en coupesnijden voor kwantitatieve histologische analyse.
- Analytics: Biedt morfometrische en op perfusie gebaseerde read-outs (vatgrootte, aantal, pericytedekking, RBC-bevattende lumina) die een vergelijkende beoordeling van condities mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt met preklinische continuïteit door menselijke vasculaire interacties in vivo te modelleren, relevant voor pulmonale en systemische angiogenese.
- Enterprise Reuse: Functioneert als een herbruikbaar platform voor genetische studies, pathway-onderzoek en drug discovery-campagnes gericht op vasculaire targets.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanische ambiguïteit bij de validatie van vasculaire targets te verminderen via directe observatie van pericyte-afhankelijke vatrijping.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via gedefinieerde celratio's, matrixgel-bereiding en histologische kwantificeringsprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door functionele gegevens over vasculaire rijping eerder in de discovery-pipeline te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van vasculaire targets mogelijk op basis van pericytenrekrutering en vaatfunctionaliteit in vivo.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in primaire menselijke celkweek, steriele chirurgische technieken en histologische verwerking.
- Afhankelijk van immuungecompromitteerde muismodellen (bijv. SCID) en toegang tot matrixgel, perfusiemarkers en immunohistochemische reagentia.
- Noodzaak tot standaardisatie tussen teams voor celvoorbereiding, consistentie van injecties en geblindeerde histologische analyse.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten soortspecifieke celbronnen, pericytentypen en het testen van angiogene versus anti-angiogene verbindingen.
- Praktische beperkingen omvatten de assayduur van 14 dagen, variabiliteit in de terugwinning van de plug en de afhankelijkheid van endpoint histologische analyse in plaats van real-time imaging.
