Name: Toepassing van Waterdicht Barrières In combinatie met de kandidaat-Factor Soaked Beads om Inductive Signalen studie in de Chick (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Leer een chirurgische methode om ledemaatinductie in kippenembryo's te bestuderen met waterdichte barrières en retinoïnezuurparels. Deze techniek analyseert genexpressie van Tbx4, Fgf10 en Fgf8.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door MRC-subsidie MC.PC_13052.

<ol><li>Murillo-Ferrol, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causal+study+of+the+earliest+differentiation+of+the+morphological+rudiments+of+the+extremities.+Experimental+analysis+on+bird+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anat+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos.</a> Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).</li>
<li>Sweeney, R. M., Watterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rib+development+in+chick+embryos+analyzed+by+means+of+tantalum+foil+blocks%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks).</a> Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).</li>
<li>Kieny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+relations+between+somatic+and+somatopleural+mesoderm+before+and+during+primary+induction+of+chick+embryo+limbs%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Acad+Sci+Hebd+Seances+Acad+Sci+D%22%5BJournal%5D)">On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).</li>
<li>Pinot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+somitic+mesoderm+in+the+early+morphogenesis+of+the+limbs+in+the+fowl+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo.</a> J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).</li>
<li>Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontrolled+release+of+biologically+active+compounds+in+chick+embryos%3A+beads+of+200-microns+diameter+for+the+local+release+of+retinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids.</a> Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).</li>
<li>Cohn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factors+induce+additional+limb+development+from+the+flank+of+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos.</a> Cell. 80 (5), 739-746 (1995).</li>
<li>Nishimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RA+Acts+in+a+Coherent+Feed-Forward+Mechanism+with+Tbx5+to+Control+Limb+Bud+Induction+and+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation.</a> Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Stephens, T. D., McNulty, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+metameric+pattern+in+the+development+of+the+chick+humerus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus.</a> J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).</li>
<li>Strecker, T. R., Stephens, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerves+do+not+play+a+trophic+role+in+limb+skeletal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Teratology%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis.</a> Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).</li>
<li>Riddle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).</li>
<li>Ng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limb+identity+gene+Tbx5+promotes+limb+initiation+by+interacting+with+Wnt2b+and+Fgf10%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10.</a> Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).</li>
<li>Takeuchi, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx5+and+Tbx4+trigger+limb+initiation+through+activation+of+the+Wnt%2FFgf+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade.</a> Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).</li>
<li>Lee, J., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+and+pattern+formation+in+the+developing+chick+wing%3A+SEM+and+quantitative+studies+of+early+effects+on+the+apical+ectodermal+ridge+and+bud+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth.</a> J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).</li>
<li>Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+application+to+chick+wing+buds+leads+to+a+dose-dependent+reorganization+of+the+apical+ectodermal+ridge+that+is+mediated+by+the+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme.</a> Devel. 106 (4), 691-705 (1989).</li>
<li>MacCabe, J. A., Parker, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+gradient+of+a+morphogenetic+substance+in+the+developing+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb.</a> Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).</li>
<li>Summerbell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zone+of+polarizing+activity%3A+evidence+for+a+role+in+normal+chick+limb+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis.</a> J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).</li>
<li>Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+reprogramme+pre-bud+mesenchyme+to+give+changes+in+limb+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern.</a> Devel. 100 (4), 723-733 (1987).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

We beschrijven het gebruik van ondoordringbare barrières voor ledematen knopvorming in het kippenembryo voorkomen. Deze techniek heeft een aantal kritische stappen. Volgende voorlopige experimenten bleek dat het scharnier gevormde barrières gebruikt in 9, 10 blijven op hun plaats in het embryo beter dan rechte barrières. Het distale platte kant van de barrière kleeft aan het vitelline membraan en houdt de barrière op zijn plaats (figuur 2C). Zorgvuldige voorbereiding scharnier gevormde belemmeringen van aluminiumfolie zoals beschreven in stap 1.6 protocol is essentieel voor het succes van de operatie. Een tweede belangrijk stap is ervoor te zorgen dat de eieren niet uit de incubator worden gelaten te lang na windowing en rustplaatsen alvorens te gaan werken op het embryo. In onze ervaring, embryo&#39;s overleven een operatie beter als ze op of in de buurt incubatietemperatuur wanneer de operatie wordt uitgevoerd. Operaties moeten daarom worden zo snel mogelijk uitgevoerd en de eieren opnieuw afgesloten promptly te zorgen voor een goede overlevingskansen. Veel onderzoekers een druppeltje antibiotica om het embryo na microchirurgie, voordat de eieren in de incubator. De aanwezigheid van de vloeistof belet de belemmeringen uit goed plakken in stand. Toevoeging van antibiotica kan ook kralen los na plaatsing. Dus niet het gebruik van antibiotica, snelle operaties en een goede hygiëne van de instrumenten wordt aanbevolen om infecties te voorkomen. Afvegen instrumenten met 70% ethanol na elke fase van een operatie is van essentieel belang om te voorkomen dat instrumenten van steeds plakkerig van het contact met de vitelline membraan dat kan leiden tot zowel barrières of kralen om zich te houden aan een tang (zie protocol stap 3.1.2.2). Beide soorten kralen gebruikt kon niet op zijn plaats na de operatie valt. Wanneer de barrière positie de volgende dag werd gecontroleerd was het niet mogelijk om te zien door de barrière te gaan of de kraal bleef op zijn plaats is of niet. In gevallen waarin de kraal waren uitgevallen werd vleugel bud uitgroei niet gered ( <strong&gt; tabel 1). Het vermijden van het overbrengen van vloeistof met de kraal als ze implanteren betekent dat kralen vasthouden gemakkelijker om de cut gezicht van het LPM (zie protocol 2.3.2.3). Tenslotte zorgen dat embryo&#39;s worden vastgesteld onmiddellijk na de oogst is van cruciaal belang voor een goede verdere analyse van genexpressie (zie protocol stap 4.2). Dit protocol wijzigt eerder gepubliceerde experimenten die barrières gebruikt om ledematen bud initiatie te voorkomen, bevat specifieke optimale breedte voor slagbomen en introduceert een combinatie van barrière en kralen plaatsing gevolgd door de analyse van genexpressie. We hebben met gebruikelijke aluminiumfolie, die goedkoop en gemakkelijk beschikbaar in alle laboratoria, produceert resultaten gelijk aan die welke eerder gebruikte tantaal folie. De folie kan worden achtergelaten in het embryo wanneer uit de uitvoering in situ hybridisatie (figuur 2C &#39;), maar verwijderen we het meestal als er meer dan één embryo wordt verwerkt om de scherpe randen van de folie beschadigen embryo&#39;s te voorkomen. PIlot studies aangetoond dat de breedte van beengebied belemmeringen is bijzonder belangrijk. Aanvankelijk was de barrières trialed waren te kort en been bud uitgroei was niet verhinderd. 1,2-1,3 mm is de optimale breedte voor een barrière been bud uitgroei volledig te blokkeren. De smalste vleugel barrières die men nauwkeurig kan plaatsen om te voorkomen dat bud uitgroei de beste overlevingskansen. Dit kan zo smal 0,5-0,7 mm. Echter, barrières die iets breder zijn, zijn meer waarschijnlijk resulteren in volledige blokkering van de vleugel bud uitgroei omdat ze zorgen voor een kleine onnauwkeurigheid van plaatsing (wij gebruikten 0,7-1 mm). Vermijden van de bloedvaten bij het maken van de incisie is van cruciaal belang voor de vleugel bud niveau barrières. Halfdoorlatende barrières zijn eerder gebruikt om het kuiken ledematen kiem halveren. MacCabe en Parker, 1976 en Summerbell, 1979 beide gebruikte filters 0,45 urn en 0,8 urn poriegrootte, respectievelijk 16, 17. Zij rapporteerden dat diffundeerbaar signalen door de poriën in het filter en dat kan passerenbehaalde resultaten met behulp van halfdoorlatende barrières waren midden tussen een ledemaat knop met geen belemmering aanwezig en één met een ondoordringbare tantaal folie barrière. Dit protocol kan worden aangepast om semi-permeabele barrières met variërende poriëngrootte om kandidaat signalen op basis van grootte of op de dynamiek van het signaal diffusie wijzigen differentiëren. Dit protocol heeft verschillende beperkingen vooral geassocieerd met het model organisme zelf. Dergelijke technieken kunnen worden gebruikt om verdere vragen ledematenontwikkeling alsmede andere vragen van gewervelde embryogenese sonde. Een voorwaarde is dat het orgel / gebied in kwestie moet ontwikkelen als het kippenembryo is toegankelijk voor interventie. De aanwezigheid van grote bloedvaten in het gebied waar een barrière moet worden geplaatst maakt barrière plaatsing later dan stage 13 of 14 technisch uitdagend. Als grote bloedvaten tijdens barrière plaatsing worden gesneden kan deze embryo sterfte veroorzaken. Ons onderzoek wanneer de transcriptiefactoren TBX5 en Tbx4 eerst geïnduceerd in de LPM beperkt door de vroegste fase waarin we een barrière die later respectievelijk zou uiteindelijk tegenover ofwel de vleugel of been kiem kunnen plaatsen. Het kan worden verhelderend om te proberen Tbx gen inductie te blokkeren in eerdere stadia, dichter bij de gastrulatie. De vroegste een barrière kunnen in de vermoedelijke vleugelgebied geplaatst succesvol was stap 8 en in het beengebied trap 10. Dit protocol is waarschijnlijk niet geschikt voor de studie van genexpressie dan ledemaatknop komen vanwege daaropvolgende snelle groei van de barrière en resultaten zou verdringen zou hebben alleen betrekking op de eerste positie van de slagboom. Die soortgelijke beperkingen van het kippenembryo in dit verband zijn ten opzichte van andere gewervelde modelorganismen veel. Het kippenembryo is een zeer geschikt diermodel voor dergelijke fysiek ingrijpen in een vertebraat embryo. De embryo&#39;s zijn relatief groot en zijn gemakkelijk bereikbaar through de eierschaal. Men kan terugkeren naar het embryo voor verdere experimenten (zoals afvoeren van een kraal 18 of belemmering) of controleren voortgang door eenvoudig de cassette venster verwijderen. Er is mogelijk ruimte voor live-imaging of time lapse imaging bevatten. We beschrijven een werkwijze windowing kippeneieren die bijzonder geschikt bij het rijden in een vroeg stadium embryo. Bij ledemaat studies is zeer belangrijk en nuttig dat er een contralaterale ledemaat controle voor elk experiment is een ideale interne controle voor elke biologische repliceren. De combinatie van het gebruik van ondoordringbare barrières voor ledematen uitgroei en kralen gedrenkt in signaalmoleculen voorkomen is niet eerder gerapporteerd. Onze analyse van mRNA expressie na dergelijke interventies is ook roman. Deze technieken konden we de moeilijke probleem van als lidmaat specifieke transcriptiefactoren Tbx5 en Tbx4 worden geïnduceerd in de LPM en ook ontledenaantonen dat later vóór knopaanleg ledematen, de aanwezigheid van deze genen in de Tbx LPM is niet voldoende voor het activeren van Fgf10 transcriptie en de start van ledemaatknop uitgroei. Figuren 2G, 2D en 2E illustreren deze bevindingen ook. De afwezigheid van Tbx4 expressie na het inbrengen van een barrière in stadium 10 in figuur 2G is in schril contrast met zijn aanwezigheid in 2D en 2E volgende barrière inbrengen in de eerste fase 15, na de inductie van Tbx4. De implantatie van RA geweekte kralen vergemakkelijkt de redding van ledematen knopaanleg volgende barrière inbrengen en zo punten te RA uit de somieten zijn essentieel in de LPM voordat ledematen knop uitgroei kan beginnen. Dergelijke technieken kunnen worden gebruikt om verdere vragen lidmaatonwikkeling maar ook andere vragen van gewervelde embryogenese lossen. Gebieden van de hersenen, ogen en romp waarschijnlijk geschikt.

Classical embryologen oudsher gebruikt fysieke technieken om de mechanismen die de embryonale ontwikkeling te ondervragen. In de jaren 1960 en 1970 ontwikkeld onderzoekers technieken ondoordringbare barrières ingevoegd tussen weefsels van het ontwikkelende embryo om het belang van inductieve signalen tonen tijdens embryogenese gebruikt. Onze interesse is in gewervelde ledematen ontwikkeling en in het bijzonder welke gebeurtenissen voorafgaan ledematen bud uitgroei. Zo kan aanbrengen van een barrière voorkomen ledemaatknop uitgroei optreedt aan één zijde van het kippenembryo terwijl deze normaal gaan van de contralaterale, niet geopereerde zijde. Materialen die worden gebruikt om deze barrières gevarieerd te maken; bijvoorbeeld, mica platen 1 en tantaal folie 2. Deze belemmeringen effectief scheiden de laterale plaat mesoderm (LPM), waaruit de ledemaatknop vormen van de somieten gevormd uit de paraxiale mesoderm. Chirurgische enten technieken aan te tonen dat nauwe samenwerking with de somieten is essentieel onderdeel knopaanleg moet plaatsvinden in de LPM 3 4. In de jaren &#39;80 en &#39;90 ontdekten ontwikkelingsstoornissen biologen diffundeerbare signaalmoleculen die essentieel zijn bij de bestrijding van ontwikkelingsprocessen zijn. Kralen gedrenkt met deze signaalmoleculen kunnen worden geïmplanteerd in specifieke gebieden van het embryo en veranderingen produceren embryonale ontwikkeling. Zo wordt retinoïnezuur (RA) door ionenuitwisseling parels die afgegeven gedurende een periode van 24 uur na implantatie in een kippenembryo en kunnen spiegelbeeld duplicatie van de cijfers 5 produceren. Heparine acrylkralen met FGF-eiwit kan ledematen bud uitgroei te leiden uit de tussen ledematen LPM 6. Meer recent muis en vis genetica hebben de studie van gewervelde ledematen inwijding genomen in een nieuw tijdperk (beoordeeld in 7). Er zijn duidelijke aanwijzingen dat de RA in de somieten voorafgaand aan ledematen bud initiatie is het van essentieel belang diffundeerbare signaal vereist door de LPM om ledematen Budding initiëren. We wilden de toegankelijkheid en experimentele robuustheid van het kippenembryo benutten om het effect barrière implantatie op genexpressie ontleden in de LPM rond de tijd van ledemaatknop initiatie. Een nieuwe aanpassing van onze methode is om een ​​barrière te combineren dat blokkeert signalen van axiale weefsels kraal plaatsing lateraal van de belemmering van exogeen supply kandidaat endogene factoren die zijn geblokkeerd door de barrière. De volgende protocollen die zijn ontwikkeld om plagen uit de mechanismen van de ledematen bud inductie en initiatie. Studeren ledematen bud initiatie betekent het gebruik van een vroeg stadium embryo&#39;s. Veel onderzoekers window kippeneieren door eerst een deel van de albumine door de lucht zak met een injectienaald. Het embryo, dat ligt bovenop de dooier, lager liggen dan in het ei. Dit is een voordeel voor een aantal technieken, zoals elektroporatie, maar kan een nadeel zijn als operatieve manipulatie van het embryo gewenst.We vinden dat het embryo zo dicht mogelijk bij de opening in het ei mogelijk is een voordeel. Vragen blijven over de signalen die gewervelde ledematen knop inductie en initiatie te controleren en de volgende protocollen geschikt zijn om ze aan te pakken. Wij zijn de eerste om een protocol voor het inbrengen van de belemmeringen voor kuiken ledematen bud uitgroei in een stadium eerder dan fase 12 8 voorkomen ontwikkelen. Gemodificeerde versies van deze protocollen kunnen ook worden gebruikt om andere vragen over de oorsprong en de timing van inductieve signalen te bieden waarin een toegankelijke inducerende weefsel ligt naast het primordium geïnduceerd. Mits het gebied van het embryo te bereiken op de desbetreffende ontwikkelingsfase dan een barrière kunnen worden geplaatst tussen de twee weefsels en veranderingen in de ontwikkeling bestudeerd. Voorbeelden kan men in hersenontwikkeling, as uitbreiding en eventueel orgaanontwikkeling zoals lever of de nieren inductie.

<table><tbody><tr><td>Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont strong forceps, type AA</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved scissors with blades 2.5 cm long</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5&nbsp;cm long</td><td>Fine Science Tools www.finescience.de</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Steel pin, 0.2 mm wide</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharpening stone, square</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Clear tape, 50 mm x 66&nbsp;m</td><td>www.5staroffice.com</td><td>295985</td><td></td></tr><tr><td>FGF4 protein</td><td></td><td></td><td>Een geschenk van Cliff Tabin.</td></tr><tr><td>all-trans-retinoic acid</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>R2625-50MG</td><td>Onthoud om te beschermen tegen licht.</td></tr><tr><td>BMS 493</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>B6688-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade No. 15</td><td>www.swann-morton.com</td><td>cat no. 0105</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>153-7301</td><td>Kralen voor het leveren van eiwit.</td></tr><tr><td>AG1-X2 Ion exchange resin</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>140-1251</td><td>Kralen voor het leveren van RA of BMS 493.</td></tr><tr><td>Incubator for eggs</td><td>Memmert www.hce-uk.com</td><td>LAB128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>P6148-1KG</td><td>Schadelijk, irriterend, corrosief.&nbsp; Behandel poeder in een afzuigkap met volledige beschermende kleding.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Gibco www.thermofisher.com</td><td>41965-039</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific webshop.fishersci.com</td><td>D/4121/PB08</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Binocular Microscope&nbsp;</td><td>Leica www.leica-microsystems.com</td><td>MZ6</td><td>Vervangen door M60</td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>Henry Stewart &amp; Co Ltd sales@medeggs.com</td><td></td><td>Brown Eggs</td></tr></tbody></table>

toepassing van waterdicht barrières in combinatie met de kandidaat-factor soaked beads om inductive signalen studie in de chick

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

De kippenembryo biedt een prachtig gewervelde model dat gebruikt kan worden om de ontwikkeling vragen op een directe manier te ontleden. De toegankelijkheid en de robuustheid na chirurgische ingreep zijn de belangrijkste experimentele sterke punten. Mica platen waren de eerste barrières gebruikt om chick ledematen knopaanleg 1 te voorkomen. Protocollen die aluminiumfolie gebruiken als een ondoordringbare barrière voor vleugel bud of been knop inductie en of inleiding beschreven. Wij combineren deze techniek met kraal plaatsing lateraal van de barrière om het aanbod kandidaat endogene factoren die zijn geblokkeerd door de barrière exogeen. De resultaten worden geanalyseerd door in situ hybridisatie van latere genexpressie. Onze belangrijkste focus ligt op de rol van retinoïnezuur signalering in de inductie en latere opening van het kippenembryo voor- en achterbeen. Wij gebruiken BMS 493 (een inverse agonist van retinezuur receptoren (RAR)) geweekte korrels geïmplanteerd in de laterale plaat mesoderm (LPM) om het effect van een bar nabootsenrier geplaatst tussen de somieten (een bron van retinoïnezuur (RA)) en de LPM waaruit ledemaatknopen groeien. Gemodificeerde versies van deze protocollen kunnen ook worden gebruikt om andere vragen over de oorsprong en de timing van inductieve signalen pakken. Mits het gebied van het kippenembryo is toegankelijk op het betrokken ontwikkelingsstadium kan een barrière worden geplaatst tussen de twee weefsels en veranderingen in de ontwikkeling bestudeerd. Voorbeelden zijn te vinden in de zich ontwikkelende hersenen, as uitbreiding en orgaanontwikkeling, zoals lever of de nieren inductie.

Het protocol hierboven beschreven beschrijft de methoden die bij Nishimoto et al methoden. , 2015. De paper bestudeert ledematen knop inductie en initiatie in zowel de voor- als achterbeen van het kippenembryo. Resultaten als zij voorzien van ondoordringbare barrières voor de uitgroei van de voorpoot kiem te voorkomen zijn eerder gepubliceerd 1, 2, 9 maar er is slechts één onderzoek beschrijft barrières been knopaanleg 1 geweest. Achterbeen data van Nishimoto et al. 2015 worden hier gepresenteerd als representatieve resultaten van de studie van mRNA expressie volgende barrière inbrengen. Tbx4 ​​Expressie in de LPM is niet voldoende om Initiate achterbeen uitgroei: Figuren 2B en C (tabel 2) blijkt dat barrière insertie in stap 15 (figuur 2A) (zie protocol 3,2) beide Fgf10en Fgf8 expressie afwezig in het been kiem regio (aangeduid door de beugel) op de geopereerde rechterkant. Vergelijken met de geopereerde linkerzijde. Echter Tbx4 expressie waargenomen bij zowel fase 19 en stap 23 op de geopereerde zijde (figuur 2D en E). We concluderen dat Tbx4 expressie alleen is niet voldoende om achterbeen uitgroei starten vanaf de LPM. Andere studies in het kuiken hebben gesuggereerd dat Tbx genexpressie is voldoende om voorpoot knopvorming 12, 13 te initiëren. Figuur 2C &#39;is opgenomen om te illustreren hoe een barrière lijkt ingebed in het been regio van het embryo na de fixatie. In de meeste gevallen belemmeringen werden verwijderd voorafgaand aan in situ hybridisatie (protocol 4,3). RA uit de Somieten is essentieel in de LPM voordat Fgf10 Veroorzaakt Limb Bud Outgrowth: Figuur 3A is een schematische die de toevoeging van een RA geweekt kraal distaal van een barrière ingebracht in stadium 15 (protocol 3.2.1.3). Na deze bewerking ledemaatknop uitgroei (aangeduid met een asterisk) wordt waargenomen over de toegepaste rechterkant en Tbx4, Fgf10 en Fgf8 zijn uitgedrukt in de kiem als in de controlegroep links (figuur 3B, C en D, Tabel 2) . Aldus toevoeging van RA op de LPM overwint het effect van de barrière en ledemaatknop initiatie verloopt. We concluderen dat normale ontwikkeling van de somieten RA is essentieel in de LPM voor ledemaatknop uitgroei kan worden gestart. De resulterende achterbeen knoppen zijn over het algemeen kleiner zijn dan die op de controle kant. Dit kan te wijten zijn aan de RA dosering bij LPM die niet gelijk is aan het wildtype situatie. Als het RA dosis te hoog is de apicale ectodermale Ridge (AER) kan worden ingekort en kleinere knoppen zou resulteren14, 15. Dat RA (van de somieten) in de LPM bevestigen is vereist voor normaal onderdeel knopaanleg een inverse agonist van RAR, BMS 493, werd gebruikt. Kralen worden geïmplanteerd in het been regio LPM in stadium 15 (zie protocol 3.2.1.4) (Figuur 3E). Fgf10 expressie wordt gedownreguleerd volgende toepassing van BMS 493 kralen in de LPM, waardoor kleinere achterpoot knoppen tegenover de bedieningszijde (figuur 3F; tabel 3). Controle DMSO kralen niet deze gebreken (; Tabel 3 figuren 3G en 3H) veroorzaken. De gebreken waargenomen na BMS 493 toepassing zijn milder dan die geïnduceerd door een barrière operatie; dat wil zeggen, Fgf10 wordt nog steeds uitgedrukt en ledematen knoppen worden gevormd. Dit is waarschijnlijk omdat de effecten van BMS 493 lokaal worden beperkt om de korrels mogelijk niet alle RA door axi antagoniserenal weefsels. Vroege Axial Signalen Geef de LPM Cellen die Later Express Tbx4: We testten toen de LPM verwerft het vermogen om Tbx4 in de aspirant-been vormende gebied uit te drukken. De vroegste stadium waarin een barrière kan worden ingebracht, die vervolgens zal blokkeren been bud uitgroei, is het podium 10. Wij zijn de eerste die een protocol om de belemmeringen in te voegen op stadia eerder dan het podium 12. Belemmeringen ingevoegd tussen de paraxiale mesoderm en de vermoedelijke been te ontwikkelen LPM in stadium 10 (zie protocol 3,4) blok been knopvorming en de expressie van Tbx4 in de beenvormende LPM (figuren 2F en 2G, tabel 2), hetgeen suggereert dat een signaal van axiale weefsels in stadium 10 is nodig voor latere expressie van Tbx4 in achterbeen LPM. Vergelijk dit resultaat met figuren 2D en E, waar later barrière inbrengen maakt Tbx4 expressievast te stellen. Daarnaast testten we of deze axiale signaal kon RA door het waarnemen of het inverse agonist van RAR vermindert Tbx4 expressie. Een BMS 493 kraal geplaatst in het achterbeen LPM in stadium 10 (zie protocol 3.4.1.3) downregulates Tbx4 expressie (figuren 2H en 2I), terwijl controle kralen gedrenkt in DMSO hebben geen invloed op Tbx4 expressie (figuren 2J en 2K). Tezamen ondersteunen deze resultaten een model dat een RA signaal van axiale weefsels regelt onderdeel inductie door positief reguleren Tbx4 in het achterbeen LPM 7. Postoperatieve Death: Tabellen 1, 2 en 3 geven details van de experimentele resultaten, inclusief het aantal chick embryo&#39;s die na de operatie en vóór de oogst stierf. Aantal sterfgevallen na microchirurgie van deze aard te verwachten. De nummers sterven kan worden bewaard<html> tot een minimum door ervoor te zorgen dat instrumenten schoon, het gat in het ei is de minimale vereiste dat de embryo&#39;s worden achtergelaten zonder de bescherming van de plakband afdichting voor een minimumtijd en samen hiermee is dat de transactie wordt zo snel uitgevoerd mogelijk. Geen van deze activiteiten zijn zeer tijdrovend, maar handelingen met kralen en barrières te nemen een beetje meer tijd. Ondanks deze maatregelen verrichte handelingen in de vroegste stadia en die in de vleugel regio hebben meer kans op de dood veroorzaken. Er zijn grote bloedvaten rond de ledematen vormende gebieden en toevallige breuk van deze schepen kan leiden tot de dood als gevolg van bloedverlies. We vinden dat eieren in stap 8 of 9, waarvan de embryo&#39;s niet zijn geopereerd, zal sterven vaak de volgende dag geopend. Daarom is de enige oplossing voor deze problemen is een groot aantal experimenten uit te voeren. d / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; Figuur 2. Marker Gene Expression Wijzigingen volgende Barrier of Bead Insertion bij Vermoedelijke Been niveau. (A) schematische weergave barrière positie (groene lijn) op de vermoedelijke been niveau (somieten 26-32) in een fase 15 embryo. (B - E en G) WISH analyse bediende embryo&#39;s. De beengebied is uiteengezet (tussen haakjes). (B) Fgf10 expressie afwezig is in de geopereerde LPM, maar robuuste expressie wordt gedetecteerd in de linker knop. (C) Fgf8 expressie afwezig is in de geopereerde zijde, suggereert er geen AER. (C) Dezelfde embryo vóór het blok werd verwijderd. (D) Tbx4 wordt uitgedrukt in de LPM tegelijk rostro-caudale niveau als controle kiem. (E) Tbx4 expressie wordt gehandhaafd in het rechterbeen gebied ondanks afwezigheid van ledematen groei. (F) Schematische weergave van een podium<html> 10 kippenembryo tonen barrière positie (groene lijn) op de vermoedelijke been niveau. (G) Tbx4 expressie afwezig is in de geopereerde juiste LPM (beugel). (H) Schematische weergave van een stage 10 kippenembryo toont BMS 493 bead positie (paarse cirkel) en vermoedelijke been niveau. (I) Tbx4 expressie wordt gedownreguleerd over de toegepaste rechterkant na behandeling met BMS 493. (J) Schematische weergave van een stage 10 kippenembryo met de beschrijving DMSO kraal positie (grijze cirkel). (K) Tbx4 wordt uitgedrukt op de geopereerde rechterkant op een vergelijkbaar niveau met dat van controle linkerkant na behandeling met alleen DMSO. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> d / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; Figuur 3. RA Reddingen Limb Bud&#39;s Absence Veroorzaakt door Barrier Insertion en is essentieel in de LPM Voorafgaand aan Been Bud uitgroei. (A) Schematische weergave aangeeft barrière positie (groene lijn) op de vermoedelijke been niveau (somieten 26-32) en een RA-doordrenkte kraal (rode cirkel). (B - D) RA reddingen been bud uitgroei (aangegeven met een asterisk). (B) Tbx4 expressie is aanwezig in de geredde been knop vergelijkbaar met de niet-geopereerde zijde. (C) Fgf10 uitgedrukt in de geredde been kiem vergelijkbaar met de niet-geopereerde zijde. (D) Fgf8 wordt uitgedrukt in de AER van de geredde rechterbeen bud. (E) Schematische aangegeven waar BMS 493 kralen (paars cirkels) in de vermoedelijke been LPM van het podium 15 embryo&#39;s werden geplaatst. (F) Fgf10 expressie wordt gedownreguleerd over de toegepaste rechterkant en de poot kiem klein volgende BMS 493 behandeling. Kralen zijn asterisk. (G) Vergelijkbare schema om (E), die de positie van de controle DMSO kralen (grijze cirkels). (H) DMSO kralen (aangegeven door sterretjes) had geen effect Fgf10 expressie of been knopgrootte. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stage barrière geplaatst (+ bead) * </td><td> Uitgevoerd </td><td> Wing ontbrekende ** </td><td> Wing aanwezig ** </td><td> aantal doden </td></tr><tr><td> Stage 12-14 </td><td> 40 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Stage 8/9 </td><td> 65 </td><td> 23 </td><td> 0 </td><td> 42 </td></tr><tr><td> Stage 12-13 (FGF4 bead) </td><td> 41 </td><td> 7 (kraal ontbrekende) </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Stage 12-13 (RA bead) </td><td> 75 </td><td> 9 (kraal ontbrekende) </td><td> 32 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> Stage 13 (controle bead) </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 0,7-1 mm folie barrières geplaatst tussen somieten 15-20 en de laterale plaat mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 bead. 0,05-0,1 mg / ml RA bead. </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSO controle kraal. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** Chick embryo vaste fasen 21-23 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Wing Level Barrier en Bead Experiment Outcomes. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stage barrière geplaatst (+ bead) * </td&gt; <td> Uitgevoerd </td><td> Been ontbreekt ** </td><td> Been aanwezig ** </td><td> aantal doden </td></tr><tr><td> Stage 12-15 </td><td> 43 </td><td> 39 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Stage 10/11 </td><td> 23 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Etappe 15 (FGF4 bead) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Etappe 15 (RA bead) </td><td> 18 </td><td> 0 </td><td> 18 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 0,7-1,3 mm folie barrières geplaatst tussen somieten 26-32 en de laterale plaat mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 bead. 0,05-0,1 mg / ml RA bead. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** Chick embryo vaste fasen 18-24 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Leg Level Barrier en Bead Experiment Outcomes. <table border = &quot;1&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-met-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Uitgevoerd </td><td> Leg bud klein </td><td> Been bud wat klein </td><td> Been bud normale grootte </td><td> aantal doden </td></tr><tr><td> BMS 493 kralen * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> 12 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> DMSO kralen ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 2-3 kralen gedrenkt in 5 mg / ml BMS 493 geplaatst in het juiste stadium 14-15 LPM op been niveau. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 2-3 kralen gedrenkt in DMSO alleen in de juiste fase 15 LPM geplaatst aan been niveau. </td></tr><tr><td colspan="5"> Kippenembryo&#39;s vastgesteld op fasen 17-19. </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Leg Level BMS 493 Bead Experiment Outcomes.

Protocollen die ondoordringbare barrières gebruiken om inductie-evenementen te blokkeren tussen weefsels van de hoofdlichaamsas en de flank in het kippenembryo, die nodig zijn voor ledeformatie, worden beschreven. Kralen gedrenkt in kandidaat-inductieve signalen worden gebruikt om het effect van barrièreplaatsing te overwinnen en analyse van genexpressie bevestigt dit.

Toepassing van Waterdicht Barrières In combinatie met de kandidaat-Factor Soaked Beads om Inductive Signalen studie in de Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Het doel van deze chirurgische interventie is om de mechanismen van ledemaatinductie in het kippenembryo te verduidelijken door te voorkomen dat signalerende moleculen diffunderen van mediale weefsels naar cellen in het mesoderm van de laterale plaat, en het effect hiervan op de genexpressie te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals welke inductieve signalen de initiatie van de ledemaatknop controleren. Het voordeel van deze techniek is dat het kippenembryo toegankelijk is voor chirurgische manipulatie en zeer robuust is; bovendien dient de niet-geopereerde contralaterale controle-ledemaatknop als een zeer nuttige interne controle.Susan Wilde zal de procedure demonstreren. Begin met het uitknippen van een vierkant stuk aluminiumfolie van 1 cm met een dikte van 0,013 mm en steriliseer dit door het af te vegen met 70% ethanol. Plaats het vierkant vervolgens op een steriele plastic petrischaal van 6 cm.Om statische kleving te voorkomen, dient u het deksel weg te gooien en een nieuw deksel voor de schaal te maken van hetzelfde folie. Plaats de petrischaal vervolgens op een objectglasmet schaalverdeling onder een binoculaire microscoop ingesteld op een vergroting van 1,6x. Gebruik een klein scalpel met een mesje van nummer 15 om stroken folie van 1,3 mm breed en 2 mm lang te knippen.Scheid de foliestrips met twee paren nummer vier horlogemakerspincetten. Maak vervolgens een haakse buiging in het midden van de foliebarrière zodat deze op een scharnier lijkt. Plaats de barrières in het midden van de petrischaal, waarbij één zijde plat tegen de schaal ligt en de andere zijde uit de schaal omhoog wijst; bereid 20 of meer barrières voor vóór de dag van de operatie.Plaats het aluminiumfoliedeksel over de schaal en bewaar de barrières op een plek waar ze niet gestoord worden. Terwijl het ei op zijn zij ligt, pakt u een paar sterke pincetten type AA stevig vast en gebruikt u een gecontroleerde steekbeweging om het stompe uiteinde van het ei, waar de luchtzak zich bevindt, door te prikken terwijl u het ei met de vrije hand vasthoudt. Zorg ervoor dat het binnenste schaalvlies is doorbroken.Neem vervolgens het ei met beide handen vast en draai het 180 graden om zijn horizontale as. Neem daarna een stukje transparante tape van ongeveer 5 cm vierkant en plak dit strak over het bovenste oppervlak van het ei om te voorkomen dat de eierschaal in het embryo valt wanneer het ei wordt geopend. Gebruik een gebogen schaar om voorzichtig door de schaal en de bijbehorende binnenste celmembranen in het midden van het bovenste gedeelte van het ei te knippen.Maak met één schaarblad een zeer klein gaatje, zodat er lucht in het ei boven het embryo kan komen. Gebruik de schaar om het gat in de schaal te vergroten tot een cirkel met een diameter van ongeveer 1 cm. Verwijder dit stukje eischaal uit het ei.Bedek het gat in het ei met een stukje transparante tape van ongeveer 5 cm vierkant. Druk de tape aan zodat deze alleen aan de rand van het gat plakt, terwijl de rest van de tape los blijft. De losse tape kan vervolgens worden vastgegrepen om het ei eenvoudig te openen.Neem een embryo in stadium 15 uit de incubator en plaats het ei op een eiersteun onder een binoculaire microscoop die is ingesteld op een vergroting van 3,2x of hoger. Verwijder vervolgens de bovenste laag van de transparante tape. Maak met een stalen micronmes een incisie door het vitellijnmembraan en het laterale plaatmesoderm grenzend aan de somieten 26-32 aan de rechterzijde van het embryo.Pak de barrière aan één uiteinde op met micro-pincetten van nummer 5 en draai de barrière zodat het vrije uiteinde in de incisie wordt ingebracht. Seal het ei zo snel mogelijk af met transparante plakband en plaats het terug in de incubator. Indien er in combinatie met een barrière een kraal moet worden ingebracht, bereid dan eerst retinoïnezuur-gedrenkte kralen voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Neem vervolgens de kraal en een micro-pincet nummer 5 en breng deze in via het gesneden vlak van het laterale plaatmesoderm aan de distale zijde van de incisie. Plaats vervolgens de barrière in de incisie proximaal ten opzichte van de kraal. Sluit het ei af en plaats het direct terug in de incubator.Als een kraal of meerdere kralen zonder barrière moeten worden ingebracht, wordt de lange incisie niet gemaakt. Maak in plaats daarvan een kleine incisie door het vitellijnmembraan en in het laterale plaatmesoderm op de positie waar de kraal geplaatst moet worden. Neem vervolgens de kraal en de nummer 5 micro-pincet en breng deze in het gat in het laterale plaatmesoderm aan.Duw het iets verder naar binnen met de gesloten uiteinden van de pincet. Neem een embryo uit het incubatorstadium tien met venster en plaats het ei op een eiersteun onder een binoculair microscoop, ingesteld op een vergroting van 3,2x of hoger indien gewenst. Maak vervolgens met een stalen micronmes een incisie door het vitellijnmembraan en het mesoderm van de laterale plaat, lateraal van de primitieve streep aan het caudale uiteinde van het embryo, in lijn met de somieten en ongeveer zes somietlengtes lang.Pak vervolgens de barrière op met een micro-pincet nummer 5, aan het uiteinde dat uit de petrischaal steekt, en draai de hand om het vrije uiteinde van de barrière in de incisie te plaatsen. Sluit het ei zo snel mogelijk af met transparante tape en plaats het terug in de incubator. Als er een kraaltje zonder barrière moet worden ingebracht, maak dan een kleine incisie door het vitellijnmembraan en in het laterale plaatmesoderm op de positie waar het kraaltje geplaatst moet worden.Neem vervolgens de kraal en een pincet (nummer 5) en voer deze in het gat in het laterale plaatmesoderm in. Duw het tenslotte met de gesloten uiteinden van het pincet iets verder naar binnen. Hier wordt de positie van de barrière getoond op het niveau van het presumptieve pootgebied van somieten 26-32 in een embryo in stadium 15.Deze barrière leidt ertoe dat zowel de expressie van Fhf10 als die van Fhf8 afwezig is in de regio van de pootknop aan de geopereerde zijde, maar aanwezig is aan de niet-geopereerde linkerzijde. De expressie van Tbx4 is echter waargenomen aan de geopereerde zijde in zowel stadium 19 als stadium 23. Dit impliceert dat de expressie van Tbx4 alleen niet voldoende is om de uitgroei van de achterpoot vanuit de lpm te initiëren.Wanneer met retinoïnezuur gedrenkte kraaltjes in stadium 15 distaal van de barrière worden geplaatst, worden Tbx4, Fgf10 en Fgf8 aan de geopereerde zijde tot expressie gebracht, net als aan de linker controleszijde. Somit is, tijdens de normale ontwikkeling, retinoïnezuur uit de somieten essentieel voordat de uitgroei van de ledemaatknop kan worden ingezet. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het gebruik van ondoordringbare barrières en met kandidaatfactoren gedrenkte kraaltjes om te bestuderen hoe inductieve signalen de initiatie van de ledemaatknop in het kippenembryo reguleren.

application-impermeable-barriers-combined-with-candidate-factor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een verscheidenheid van groeifactoren en eiwitten interageren te bewegen cellen op zich te nemen andere cel lot tijdens de ontwikkeling. Hier laten we zien het gebruik van een in-ovo voorbereiding op mogelijke interacties tussen verschillende eiwitten in de ontwikkeling te pakken door het plaatsen van kralen op E2.5 kippenembryo's.

Het plaatsen van Growth Factor-Coated Kralen op Early Stage kippenembryo&#39;s

Neurale inductie is de eerste stap in de vorming van de hersenen. Het is een mechanisme waarmee Hensen's node (organisator), instrueert aangrenzend weefsel aan te nemen een neurale lot, dat wil zeggen om aanleiding te geven aan het zenuwstelsel. Deze video toont een test voor neurale inductie bij kippenembryo.

Test voor Neurale Inductie in het kippenembryo

Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatie techniek die is ontworpen om de signalering en patroonvorming eigenschappen van de oppervlakte Cephalic ectoderm tijdens de craniofaciale ontwikkeling test.

Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling

Dit artikel beschrijft het oppervlak etikettering en...

Tracking Morfogenetische Tissue vervormingen in de vroege Chick Embryo

Het bekijken en toegang krijgen tot het kippenembryo tijdens de ontwikkeling kan een uitdaging zijn. We hebben een ex ovo methode ontwikkeld die eenvoudig, kosteneffectief is en gemakkelijk kan worden gebruikt in een klaslokaal of onderzoeksomgeving. Deze methode biedt toegang tot het embryo tot in de late stadia van de embryonale ontwikkeling (HH 40).

Geoptimaliseerd Ex-ovo Het kweken van kippenembryo's tot geavanceerde stadia van ontwikkeling

Door kralen gedrenkt in groeifactoren of specifieke remmers van signaalroutes in zich ontwikkelende embryo's te enten, is het mogelijk om hun effecten direct in vivo te testen. In dit protocol worden kralen in de ledemaatknop geënt om de effecten van deze moleculen op genexpressie en signaaltransductie te bepalen.

Enten van kralen in de ontwikkeling van kippenembryo Ledematen kunnen identificeren signaaltransductieroutes invloed Gene Expression

Hier presenteren we een nieuwe techniek om kuikenembryo's ex ovo te kweken voor time-lapse beeldvorming met behulp van doorgelaten licht en fluorescentiemicroscopie. De ondergedompelde filterpapiersandwich is een variant van de bekende filterpapierdragertechniek1 die het mogelijk maakt om kuikenembryo's volledig ondergedompeld in een vloeibaar kweekmedium te kweken.

Een Ondergedompeld Filter Paper Sandwich voor de lange termijn Ex Ovo Time-lapse beeldvorming van Early kippenembryo's

We beschrijven de methoden voor het labelen van fluorescerende tangentieel migreren cellen door electroporation, en voor time-lapse beeldvorming van de beweging van de gelabelde cel in een flat-mount cultuur om te visualiseren migreren cel gedrag in de ontwikkelingslanden chick optic tectum .

Visualisatie van tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden Chick Optic Tectum

De geweekte kraaltest omvat gerichte toediening van testreagens op elk ontwikkelingstijdpunt om de regulatie van celdifferentiatie en morfogenese te bestuderen. Een gedetailleerd protocol, toepasbaar op elk proefdiermodel, voor het bereiden van drie verschillende soorten geweekte kralen en het implanteren hiervan in de interdigit van een kippenembryo wordt gepresenteerd.

Analyse van celdifferentiatie, morfogenese en patronen tijdens kippenembrogenese met behulp van de soaked-bead assay

Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.

In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

Leer een chirurgische methode om ledemaatinductie in kippenembryo's te bestuderen met waterdichte barrières en retinoïnezuurparels. Deze techniek analyseert genexpressie van Tbx4, Fgf10 en Fgf8.

Toepassing van Waterdicht Barrières In combinatie met de kandidaat-Factor Soaked Beads om Inductive Signalen studie in de Chick

Meer video's verkennen