Toepassing van Waterdicht Barrières In combinatie met de kandidaat-Factor Soaked Beads om Inductive Signalen studie in de Chick

Het doel van deze chirurgische ingreep is om de mechanismen van ledemaatinductie in het kuikenembryo te verduidelijken door het voorkomen dat signaalmoleculen diffunderen van mediale weefsels naar cellen in het laterale plaatmesoderm en het bestuderen van het effect ervan op genexpressie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie te beantwoorden, zoals, wat zijn de inductieve signalen om ledemaatknopinitiatie te controleren. Het voordeel van deze techniek is dat het kuikenembryo toegankelijk is voor chirurgische manipulatie en zeer robuust is, bovendien dient de niet-geopereerde contralaterale controle ledemaatknop als een zeer nuttige interne controle.

Susan Wilde zal de procedure demonstreren. Om te beginnen, snijdt u een 1 cm vierkante plak van 0,013 mm dik aluminiumfolie en steriliseert deze door het af te vegen met 70% ethanol. Plaats vervolgens het vierkant op een 6 cm steriele plastic petrischaal.

Om statische aantrekkingskracht te voorkomen, gooit u het deksel weg en maakt u een nieuwe voor de schotel uit dezelfde folie. Plaats vervolgens de petrischaal op een stadiumgratikel onder een binoculaire microscoop ingesteld op 1,6x vergroting. Gebruik een nummer 15-blad kleine scalpel om 1,3 mm brede stroken van de folie te snijden die 2 mm lang zijn.

Separeer de foliestroken met behulp van twee paar horlogemakerstangen nummer vier. Maak vervolgens een rechte hoekige bocht in het midden van de foliebarrière zodat deze op een scharnier lijkt. Lijn de barrières uit in het midden van de petrischaal met één kant vlak tegen de schaal en de andere kant omhoog uit de schaal, bereid 20 of meer barrières voor vóór de operatiedag.

Plaats het foliedeksel over de schotel en bewaar de barrières op een plaats waar ze niet gestoord worden. Met het ei op zijn zij liggen, grijpt u stevig een paar type AA sterke tang en gebruikt u een gecontroleerde steekbeweging om het stompe uiteinde van het ei te doorboren dat de luchtzak bevat terwijl u het ei met de vrije hand vasthoudt. Zorg ervoor dat het binnenste schilmembraan is gebroken.

Vervolgens neemt u het ei in beide handen en draait u het 180 graden langs de horizontale as. Neem vervolgens een stuk duidelijk tape, ongeveer 5 cm vierkant en plak dit dicht op het bovenste oppervlak van het ei om te voorkomen dat de eischaal op het embryo afbrokkelt wanneer het ei wordt geopend. Gebruik een paar gebogen schaar om zachtjes door de schaal en de bijbehorende binnenste celmembranen in het midden van het bovenste deel van het ei te breken.

Maak een heel klein gaatje met één blad van de schaar zodat lucht het ei over het embryo kan binnenkomen. Gebruik de schaar om het gat in de schaal te vergroten tot een cirkel met een diameter van ongeveer 1 cm. Verwijder dit stuk eigrootte schaal uit het ei.

Bedek het gaatje op het ei met een stuk duidelijk tape van ongeveer 5 cm vierkant. Druk op de tape om hem alleen aan de rand van het gat te plakken en laat de resterende tape vrij. De vrije tape kan dan worden vastgepakt om het ei gemakkelijk te ontzegelen.

Neem een stadium 15 embryo uit de incubator en plaats het ei op een eierest onder een binoculaire microscoop ingesteld op een vergroting van 3,2x of hoger. Vervolgens verwijdert u de bovenste laag duidelijk tape. Gebruik een stalen micromes om een incisie te maken door het vitelline membraan en lateraal plaat mesoderm naast somieten 26-32 aan de rechterkant van het embryo.

Pak de barrière met micro tang nummer 5 aan het ene uiteinde en draai de barrière om het vrije uiteinde in de incisie in te steken. Zodra mogelijk, verzegelt u het ei met duidelijke tape en plaatst u het terug in de incubator. Als er een kraal moet worden geplaatst in combinatie met een barrière, bereid dan eerst met retinoïnezuur doordrenkte kralen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Vervolgens neemt u de kraal en een paar micro tang nummer 5 en steekt deze in de gesneden kant van het lateraal plaat mesoderm aan de distale kant van de incisie. Steek vervolgens de barrière in de incisie proximaal van de kraal. Verzegeld het ei en plaatst het onmiddellijk terug in de incubator.

Als een kraal of kralen zonder barrière moeten worden geplaatst, maak dan geen lange incisie. Maak in plaats daarvan een kleine incisie door het vitelline membraan en in het lateraal plaat mesoderm op de positie waar de kraal moet worden geplaatst. Neem vervolgens de kraal en micro tang nummer 5 en steek deze in het gat in het lateraal plaat mesoderm.

Duwt het een beetje verder met de gesloten uiteinden van de tang. Neem een raamstadium tien embryo uit de incubator en plaats het ei op een eierest onder een binoculaire microscoop ingesteld op 3,2x vergroting of hoger indien gewenst. Gebruik vervolgens een stalen micromes om een incisie te maken door het vitelline membraan en lateraal plaat mesoderm, lateraal aan de primitieve streep aan het caudale uiteinde van het embryo in lijn met de somieten, ongeveer zes somietlengten lang.

Pak vervolgens de barrière met een paar micro tang nummer 5, aan het uiteinde dat uit de petrischaal steekt en draai de hand om het vrije uiteinde van de barrière in de incisie te steken. Zodra mogelijk, verzegelt u het ei met duidelijke tape en plaatst u het terug in de incubator. Als er een kraal moet worden geplaatst zonder barrière, maakt u een kleine incisie door het vitelline membraan en in het lateraal plaat mesoderm op de positie waar de kraal moet worden geplaatst.

Neem vervolgens de kraal en een paar micro tang nummer 5 en steek deze in het gat in het lateraal plaat mesoderm. Duwt het tenslotte een beetje verder met de gesloten uiteinden van de tang. Hier wordt de barrièrepositie op het veronderstelde beenniveau van somieten 26-32 in een stadium 15 embryo getoond.

Deze barrière leidt ertoe dat zowel Fhf10 als Fhf8-expressie afwezig is in het beenknopgebied aan