Name: Een acute retinale model voor het evalueren van Blood Retina Barrier Breach en potentiële geneesmiddelen voor de behandeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Ontdek een kosteneffectief ex vivo varkensretina-model om bloed-retina barrière-breuken te evalueren en potentiële behandelingen zoals lipoxine A4 te screenen. Deze methode biedt waardevolle inzichten voor neurodegeneratieve ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bringhurst Meats (Berlin, NJ) wordt erkend voor hun oprechte hulp bij het leveren van de varkensoogbollen.

Alle protocollen werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid van de Animal Care en gebruik Comite institutionele waar van toepassing. 1. Voorbereiding <ol><li> Bereid de stabilisatie media met 75% Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), 25% Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). Meng goed, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. </li><li> Bereid de fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en steriliseer in de autoclaaf. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur. Verwarm de PBS tot 37 ° C vóór het experiment (5 ml per putje). </li><li> Bereid 10%, 20% en 30% sucrose in PBS. Filter alle oplossingen individueel via aparte 0,22 pm filters voor sterilisatie. Bewaar de oplossingen bij 4 ° C. </li><li> Bereid de histamine voorraadoplossing in PBS tot een concentratie van 90 mM. Steriliseer de oplossing door te filteren over een 0,22 pm filter. Aliquot en opslaan van de oplossing bij -80 ° C. Vermijd meerdere freeze-and-dooi cycli. </li><li> Voeg vers 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS voor het experiment. Plaats het op ijs. Let op: Houd PFA in een zuurkast en geschikte kleding te dragen. </li><li> Ontdooi de stabilisatie medium (20 ml per retina). Add penicilline-streptomycine tot een eindconcentratie van 100 U / ml. Warme deel van het medium (15 ml per retina) tot 37 ° C incubator voor het experiment. Laat de rest van het medium op het ijs. </li><li> Plaats de HBSS (10 ml per retina) op ijs. </li></ol> 2. het netvlies organotypische Cultuur <ol><li> Breng de monsters een weefselkweek kap. Open de oogschelp door te snijden rond de lens. Met behulp van een borstel, verwijdert het glasvocht zonder te trekken aan het netvlies. Voorzichtig los van het netvlies van het snijvlak met een borstel om de optische schijf bloot te leggen. Ernstige de oogzenuw met een scheermes en het netvlies los. </li><li> Breng de retina in een petrischaal en zorgvuldig spoel de retina eenmaal met koud HBSS. Plaats het monster in HBSS op ice. Ontleden zoveel netvliezen als nodig is door het herhalen van stap 2.1 en deze stap. </li><li> Snijd het netvlies doormidden symmetrisch met een scheermes. Voorzichtig doorvoermonsters een 6-well plaat met 3 ml stabilisatie medium per putje. Laten equilibreren gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een incubator met de atmosfeer die 5% CO2. </li><li> Bereid de volgende reagentia tijdens de incubatie bij Stap 2.3: Verdun de histamine stockoplossing aan de gewenste concentratie (450 uM) in warm medium. Oplossen LXA4 (onder argon opgeslagen) in het medium tot een uiteindelijke concentratie van 250 ng / ml. OPMERKING: Bij het meten van het effect van LXA4 is de helft van één retina voor alleen histamine, terwijl de andere helft wordt gebruikt voor histamine met LXA4. </li><li> Zuig de stabilisering medium zorgvuldig en voeg de voorbereide medium aan elk putje (3 ml per putje). Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 1 uur in een incubator met de atmosfeer die 5% CO2. </li><li> Spoel desamples eenmaal in warm, steriele PBS. </li></ol> 3. Bereid de monsters voor Immunokleuring <ol><li> Zuig PBS van de platen. Voeg 4% PFA (3 ml per putje) en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Snel zuig het PFA. Spoel de monsters tegelijk met behulp van PBS. Breng de monsters tot 10% sucrose (5 ml per putje) en incubeer gedurende 2 tot 4 uur bij 4 ° C. </li><li> Breng de monsters naar een 30% sucrose (5 ml per putje) en incubeer overnacht bij 4 ° C. Meng een deel van de commerciële bevriezing medium met twee delen 20% sucrose om de werkende bevriezing drager. Laat het bij 4 ° C gedurende de nacht of langer totdat de luchtbellen verdwijnen. </li><li> Breng de monsters aan de werkende invriesmedium en laat equilibreren gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Trim elke retina in rechthoeken (ongeveer 3 mm bij 5 mm). </li><li> Breng voorzichtig de monsters in de werkende bevriezing media geborgen in een cilindervormige container (ongeveer 1 cm radius x 2 cm hoogte) devseerd uit aluminiumfolie. Waarborgen dat de retinale schijfjes verticaal (gericht op een dwarsdoorsnede van de retina verlenen op snijden) en invriezen in vloeibare stikstof. Bewaar de blokken bij -80 ° C tot gebruik. </li><li> Sectie elk blok op een cryostaat in 14 micrometer dikke plakken en monteer de secties op glasplaatjes. Bewaar de objectglaasjes bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol> 4. Immunokleuring <ol><li> Was de secties met 5% sucrose fosfaatbuffer (SPB, 5% sucrose in PBS, pH 7,4) eenmaal. Blokkeert de niet-specifieke bindingsplaatsen door incuberen van de secties in blokkerende buffer (5% SPB met 10% normaal geitenserum en 0,5% Triton X-100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Incubeer de secties (op dia&#39;s) met de juiste primaire antilichaam (GFAP of MAP2, verdund 1: 500 in het blokkeren van buffer) gedurende 1 uur. Zuig de oplossing. Was drie keer in 5% SPB. Voor het kleuren van de endogene IgG, deze stap overslaan. </li><li> Incubeer de secties met de bijbehorende Secondaire antilichamen (Cyanine3 / FITC geconjugeerd ezel-anti-muis / anti-konijn IgG, verdund 1: 800 in blokkerende buffer) gedurende 1 uur. </li><li> Was de onderdelen grondig met 5% SPB drie keer. Bereid de monsters voor microscopie door het monteren van hen in de montage medium met DAPI en afdekken met dekglaasjes. </li><li> Met behulp van een laser confocale microscoop, beelden vast te leggen door middel van een 20x lens onder identieke parameters zoals laser intensiteit, gain-waarde, verblijftijd, enz. Over groepen. Stel de excitatie / emissie-golflengten voor het blauwe kanaal (op te sporen DAPI) als 408/447 nm, voor het rode kanaal (tot Cyanine3 detecteren) als 561/785 nm en voor het groene kanaal (tot FITC detecteren) als 488/525 nm . </li></ol> 5. Image Analysis <ol><li> Kwantificeren percentage lekkende bloedvaten volgens de volgende criteria 12: alleen bloedvaten met endotheliale celkernen in het snijvlak in de telling; overwegen een bloedvat lek als het ag toontradient van immunokleuring rondom het schip. </li><li> Om de expressie te bepalen, selecteert u regio&#39;s van belang en meet de gemiddelde grijswaarde met behulp van de software voor beeldanalyse. </li><li> Om de breedte van het proces te meten, kies een gebied van de sectie waar de processen onderscheiden (de buitenste nucleaire laag, ONL, bijvoorbeeld). Kies dan voor een optische veld waarin dergelijke processen zijn zichtbaar en continu. Zet de schaal bar volgens de microscopische setting, trek een lijn over het proces en het uitvoeren van de meting. </li><li> Om de continuïteit van het proces, analyseren en regio&#39;s van belang, gelden de filter genaamd variantie waarin de randen in het beeld versterkt door elke pixel te vervangen met zijn omgeving variantie, automatisch het contrast en de helderheid aan te passen, de telling van de lijnen en het normaliseren van de telling door de gebied. </li><li> Bereken statistische betekenissen met behulp van een tweezijdige Student&#39;s t-test. *, P &lt;0,05; **, P &lt;0,01; *** P &lt;0,001. Plot het resultaat als gemiddelde ± SEM. </li></ol>

<ol><li>Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-retinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Blood-retinal barrier.</a> J Ophthalmol. 21, 3(2011).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-neural+barrier%3A+intercellular+communication+at+glio-vascular+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface.</a> J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).</li>
<li>Kumagai, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+in+brain+and+retina%3A+implications+in+the+management+and+complications+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes.</a> Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).</li>
<li>Runkle, E. A., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-retinal+barrier%3A+structure+and+functional+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">The blood-retinal barrier: structure and functional significance.</a> Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).</li>
<li>Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+glucose+across+the+blood-tissue+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Transport of glucose across the blood-tissue barriers.</a> Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).</li>
<li>Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+claudins+in+blood-tissue+barriers+under+physiological+and+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states.</a> Tissue Barriers. 1, 24782(2013).</li>
<li>Patton, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+image+analysis%3A+concepts%2C+applications+and+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Ret+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal image analysis: concepts, applications and potential.</a> Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).</li>
<li>Di Marco, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+dysfunction+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease--A+review+of+endothelium-mediated+mechanisms+and+ensuing+vicious+circles%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles.</a> Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).</li>
<li>Nagele, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-reactive+autoantibodies+prevalent+in+human+sera+increase+intraneuronal+amyloid-beta%281-42%29+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimer%27s+Dis%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition.</a> J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).</li>
<li>Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+and+blood-brain+barrier+compromise%3A+A+mechanistic+link+between+vascular+disease+and+Alzheimer%27s+disease+subtypes+of+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders.</a> J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10(2015).</li>
<li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nat Photonics. 7, (2013).</li>
<li>Sedeyn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+Induces+Alzheimer%27s+Disease-Like+Blood+Brain+Barrier+Breach+and+Local+Cellular+Responses+in+Mouse+Brain+Organotypic+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures.</a> Biomed Res Int. 2015, 937148(2015).</li>
<li>Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAvdeef%2C+A+%22Blood-Brain+Barrier+in+Drug+Discovery%3A+Optimizing+Brain+Exposure+of+CNS+Drugs+and+Minimizing+Brain+Side+Effects+for+Peripheral+Drugs%22">Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs</a>. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188(2014).</li>
<li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10, 33(2013).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+blood-brain+barrier+model+combining+shear+stress+and+endothelial+cell%2Fastrocyte+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture.</a> J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).</li>
<li>Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+transport+through+the+blood-retina+and+blood-brain+barrier+of+rat+visual+system+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging.</a> Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).</li>
<li>Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilicity+and+transporter+influence+on+blood-retinal+barrier+permeability%3A+a+comparison+with+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability.</a> Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).</li>
<li>Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+dehydroascorbic+acid+transport+across+the+rat+blood-retinal+and+-brain+barriers+in+experimental+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes.</a> Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).</li>
<li>Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+pathology+and+blood-brain+barrier+disruption+in+cognitive+and+psychiatric+complications+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Psychiatry+Neurol%22%5BJournal%5D)">Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus.</a> Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202(2011).</li>
<li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+retina+works+-+Much+of+the+construction+of+an+image+takes+place+in+the+retina+itself+through+the+use+of+specialized+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Sci%22%5BJournal%5D)">How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits.</a> Am Sci. 91, 28-35 (2003).</li>
<li>Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pathology+as+biomarker+for+cognitive+impairment+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurgery+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease.</a> J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).</li>
<li>Tan, Z., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta%2C+the+retina%2C+and+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease.</a> Am J Pathol. 176, 2055(2010).</li>
<li>Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-resolving+lipid+mediators+are+leads+for+resolution+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology.</a> Nature. 510, 92-101 (2014).</li>
<li>Bucolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+topical+indomethacin%2C+bromfenac+and+nepafenac+on+lipopolysaccharide-induced+ocular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation.</a> J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).</li>
<li>Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroids+inhibit+VEGF-induced+vascular+leakage+in+a+rabbit+model+of+blood-retinal+and+blood-aqueous+barrier+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown.</a> Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit rapport presenteren we een krachtig ex vivo acuut retinale model van BRB-disfunctie met behulp van de varkensretina. Dit modelsysteem vereist geen speciale instrumenten en kan gemakkelijk worden aangepast onder de meeste laboratoriumomstandigheden. Om een succesvol resultaat te verkrijgen, vereisen verschillende stappen echter speciale aandacht. Nadat de oogbollen uit de bron zijn verkregen, moeten ze worden bewaard op 4 °C of op ijs en zo snel mogelijk worden verwerkt. Wanneer het effect van een behandel...

Een groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal ondersteunt het bestaan ​​van bloed retinale barrière (BRB) 1-5 en de gelijkenis met de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​6,7. Compromis van de BBB is nauw verbonden causaal of diagnostische merker van chronische neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD) 8,9 en acute aandoeningen zoals delirium 10. Mechanistische inzichten in deze pathologieën en ontdekkingen voor potentiële drug targets zijn over het algemeen belemmerd door de beperkte toegankelijkheid en netwerk complexiteit van de hersenen. Alternatieven zoals in vivo beeldvorming 11, hersenen organotypische cultuur 12, primaire celculturen 13,14 en co-cultuur systemen 15 zijn gegenereerd. De meeste van deze modellen vereisen speciale instrumenten, lange experimentele perioden of meerdere markers aan cellen te identificeren. Functionele en structurele overeenkomsten tussen BBB en BRB en een correlatie tussen de DYsfunctions van de twee werden aangevoerd 16-19. Daarnaast zijn gemakkelijker toegang welomschreven celtypen en een gelaagde structuur goed gekarakteriseerde retina als een venster naar de hersenen toegestaan. De structurele en functionele identiteit van de BBB en BRB nog worden vergeleken detail. Echter, retinale aandoeningen, met name de breuk BRB, zijn ook sterk geassocieerd met de progressie van verschillende ziekten, waaronder diabetes 18-19 en AD 21,22. Derhalve is het van belang een BRB disfunctie systeem niet alleen het mechanisme af te bakenen, maar ook potentiële geneesmiddelen te screenen stellen. In dit rapport wordt een protocol waarmee BRB disfunctie met behulp van een eenvoudige acute retinale cultuur ontwikkeld en gepresenteerd. Verhoogde BBB permeabiliteit en AD-achtige pathologische veranderingen zijn vastgesteld in de hersenen organotypische cultuur geïncubeerd met histamine, een pro-inflammatoire mediator 12. Daarom is in de gepresenteerde systeem histamine was applied de ex vivo netvlies cultuur BRB dysfunctie veroorzaken. Retina&#39;s van verschillende soorten, zoals Mus musculus en Bos taurus, getest. Vanwege hun commerciële beschikbaarheid en gelijkenis met menselijk weefsel, werden verse varkens oogappels gebruikt om de gegevens in dit jaarverslag verschaffen. Na incubatie met histamine en / of andere geneesmiddelen werden de retina voor evaluatie verwerkt door immunokleuring voor verscheidene eiwitten 12 zoals Immunoglobuline G (IgG), een van de belangrijkste bestanddelen van het bloed; glia fibrillair zuur eiwit (GFAP), een bekend marker voor glia activering; en microtubule-geassocieerd eiwit 2 (MAP2), een neuron-specifieke cytoskelet eiwit essentieel is voor de assemblage van microtubuli. Voorts is de gelaagde structuur van het netvlies kan een gedetailleerde analyse van de processen van Müllercellen en ganglioncellen, zoals veranderingen in de breedte en continuïteit. Aldus aantal extra parameters om de gevolgen van de te evaluerenBRB breuk in een vroeg stadium en de omkering effecten van mogelijke behandelingen te evalueren. In dit protocol wordt potentiële omkering effecten van onderzochte geneesmiddelen benaderd vanuit drie perspectieven: lekkage van bloedvaten (BV), de activering van gliacellen en de schade-reactie van neuronale cellen. Verschillende kwantificeringsmethoden worden gebruikt, bijvoorbeeld het expressieniveau getoond door de intensiteit van de immunokleuring, breedtemaat van een proces en continuïteit van neuronale uitlopers getoond door een verbetering filter. Om beter te illustreren de werkwijze en te helpen resultaten te interpreteren, lipoxine A4 (LXA4), een verbinding endogeen gesynthetiseerd in reactie op inflammatoire schade en verzachtende endotheeldysfunctie 23, is gekozen voor demonstratiedoeleinden.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>J.T.Baker</td><td>4072-05</td><td></td></tr><tr><td>Histamine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7125-1G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Freezing Media&nbsp;</td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>D104-00-0050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>GFAP Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 Antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>mounting medium containing DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Laser Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti microscope</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.45s</td><td></td></tr></tbody></table>

een acute retinale model voor het evalueren van blood retina barrier breach en potentiële geneesmiddelen voor de behandeling

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Een laagdrempelig, gebruiksvriendelijk en krachtig modelsysteem is opgezet om mogelijke behandelingen te evalueren die een schending van de bloed-retinabarrière kunnen verbeteren. Een ontstekingsfactor, histamine, wordt aangetoond om de integriteit van de bloedvaten in de gekweekte retina te compromitteren door positieve kleuring van IgG buiten de bloedvaten. De effecten van histamine zelf en die van kandidaat-geneesmiddelen voor mogelijke behandelingen, zoals lipoxine A4, worden beoordeeld aan de hand van drie parameters: lekkage van bloedvaten via IgG-immunokleuring, activering van Müller-cellen via GFAP-kleuring en verandering in neuronale dendrieten door kleuring voor MAP2. Bovendien maakt de gelaagde organisatie van de retina een gedetailleerde analyse mogelijk van de processen van Müller- en ganglioncellen, zoals veranderingen in breedte en continuïteit. Hoewel de gepresenteerde gegevens betrekking hebben op varkensretinacultuur, is het systeem toepasbaar op meerdere soorten. Het model biedt dus een betrouwbare tool om de vroege effecten van een verminderde integriteit van de retinale bloedvaten op verschillende celtypen te onderzoeken en ook om potentiële kandidaat-geneesmiddelen voor behandeling te evalueren.

We presenteren een goedkope, tijdbesparende en gemakkelijk te gebruiken kunnen mogelijke behandelingen die bescherming kan bieden tegen BRB breuk veroorzaakt door histamine evalueren. IgG wordt beperkt binnen de vaten controle retina (Figuur 1A), maar lekt uit de bloedvaten bij blootstelling histamine (Figuur 1B), hetgeen bevestigt dat het model tot stand is gebracht. LXA4 werd gekozen om het ...

Een low-cost, is makkelijk te gebruiken en krachtige systeem opgezet om potentiële behandelingen die bloed retinale barrière schending geïnduceerd door histamine kon verbeteren evalueren. Bloedvat lekkage Müller celactivering en de continuïteit van neuronale processen worden gebruikt om de schadereactie en de omkering van een potentieel geneesmiddel, lipoxine A4 beoordelen.

Een acute retinale model voor het evalueren van Blood Retina Barrier Breach en potentiële geneesmiddelen voor de behandeling

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Het algemene doel van dit ex vivo retina-model is het screenen van geneesmiddelen die de doorbraak van de bloed-neurale barrière kunnen verminderen. Deze methode kan antwoord bieden op verschillende kernvragen binnen het veld van neurodegeneratieve ziekten, zoals wat de vroege gebeurtenissen zijn en hoe we kunnen screenen op medicijnen die kunnen helpen bij de behandeling van deze patiënten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kosteneffectief, eenvoudig in gebruik, snel en aanpasbaar is.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het verkrijgen van betrouwbare en reproduceerbare gegevens afhangt van de technische vaardigheden om goede monsters te genereren. Ten eerste worden hier varkensretina's gebruikt, verkregen uit een commerciële bron. Na verkrijging van de bron moeten de oogballen op 4 °C, of op ijs, worden bewaard en zo snel mogelijk worden verwerkt.Begin de dissectie in een weefkweekkast door rond de lens te snijden om de oogcap te openen. Gebruik vervolgens een penseel om voorzichtig het glasachtig lichaam te verwijderen, zonder aan het netvlies te trekken. Gebruik een penseel om het netvlies voorzichtig los te maken van de gesneden rand, zodat de oogzenuwkop zichtbaar wordt.Doorsnij de oogzenuw met een scheermesje en maak het netvlies los. Breng het netvlies over naar een petrischaal en spoel het netvlies zorgvuldig één keer af met koud HBSS. Plaats het monster in HBSS op ijs.Gebruik vervolgens een scheermesje om het netvlies symmetrisch door te snijden. Wanneer behandelingen vereist zijn, wordt één helft van het netvlies behandeld, terwijl de andere helft van hetzelfde netvlies verwerkt moet worden om de basislijn vast te stellen en te corrigeren voor variaties tussen dieren. Breng de monsters voorzichtig over naar een six-wellplaat die drie milliliter stabilisatiemedium per well bevat.Equilibreer de retinae gedurende 30 minuten bij 37 °C in een incubator met een atmosfeer die 5% koolstofdioxide bevat. Aspireer na de incubatie voorzichtig het stabilisatiemedium en voeg drie milliliter medium met histamine en LXA4 toe aan elke put. Incubeer de monsters nog een uur.Na het spoelen met warme steriele PBS, voegt u drie milliliter 4% PFA toe aan elke well en incubeert u dit gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zodra de incubatietijd is verstreken, zuigt u de PFA snel af en spoelt u de monsters eenmaal met PBS. Voeg 10% sucrose toe aan de wells en incubeer gedurende twee tot vier uur bij vier graden Celsius.Vervang vervolgens de 10% sucrose door 30% sucrose en incubeer dit een nacht bij vier graden Celsius. Meng daarna één deel commercieel invriesmedium met twee delen 20% sucrose om het werkbare invriesmedium te maken. Bewaar dit een nacht of langer bij vier graden Celsius totdat de luchtbellen zijn verdwenen.Vervang de volgende dag de 30%sucrose door werkend vriesmedium en laat dit vijf minuten equilibreren bij kamertemperatuur. Trim na equilibratie elk netvlies in rechthoekjes van drie millimeter bij vijf millimeter en vries de netvliesplakjes vervolgens in door ze te plaatsen in vriesmedium, gevat in een cilinder van aluminiumfolie. Zorg ervoor dat de netvliesplakjes verticaal staan om een dwarsdoorsnede van het netvlies te verkrijgen bij het snijden, en vries ze in vloeibare stikstof.Snijd elk blok op een cryostaat in plakjes van 14 micron en monteer de coupes op glazen objectglaasjes. Bewaar de glaasjes bij negatief 80 °C tot gebruik. Begin de immuunkleuring door de coupes te wassen met een 5% sucrosefosfaatbuffer, of SPB.Blok vervolgens de aspecifieke bindingsplaatsen door de coupes en de blokkeringsbuffer één uur bij kamertemperatuur te incuberen. Incubeer de coupes daarna één uur met het juiste primaire antilichaam. Nadat het uur is verstreken, wordt de oplossing afgezogen en worden de coupes drie keer gewassen in 5% SPB.Incubeer vervolgens de coupes gedurende één uur met de overeenkomstige secundaire antilichamen, terwijl ze worden beschermd tegen licht. Nadat de coupes drie keer zijn gewassen met 5% SPB, worden de monsters voorbereid voor microscopie door ze te mounten in een medium dat DAPI bevat en te dekken met dekglasjes. Leg tot slot afbeeldingen vast met behulp van een confocale microscoop.Om de breedte van de uitlopers te meten, gebruikt u het vergrootglas-instrument om een gebied van de sectie te kiezen waar de uitlopers aanwezig zijn, zoals de buitenste kernlaag. Kies vervolgens een optisch veld waarin dergelijke uitlopers zichtbaar en continu zijn. Klik op het analyse-instrument in het hoofdmenu en klik vervolgens op 'schaal instellen' in het submenu, om de schaalbalk in overeenstemming met de microscopische instellingen in te stellen.Selecteer de lijnfunctie in het hoofdmenu en trek een lijn door het proces. Klik in het hoofdmenu op analyseren en vervolgens op meten in het submenu om de meting uit te voeren. Om de continuïteit van het proces te analyseren, keert u terug naar het hoofdmenu en gebruikt u de polygoonfunctie om de inner plexiform layer te selecteren als het gebied van interesse.Meet het oppervlak door op analyze en vervolgens op measure te klikken. Klik op process, filter en daarna op variants, om de randen in de afbeelding te verbeteren door elke pixel te vervangen door de variant van de directe omgeving. Pas vervolgens automatisch het contrast en de helderheid aan door op image, adjust, brightness and contrast te klikken, en daarna op auto in het submenu.Tel vervolgens de lijnen. In deze afbeeldingen is IGG-immunoreactiviteit in het rood zichtbaar. In controlegroepen is IGG beperkt tot de bloedvaten.In de histaminegroep wordt IGG gedetecteerd buiten de bloedvaten, waar het lekkagewolken vormt die worden aangegeven door stippellijnen. In de met LXA4 behandelde groepen is IGG opnieuw beperkt tot de bloedvaten. Verdere toevoeging van LXA4 herstelt de door histamine veroorzaakte bloedvatfunctie.Dit histogram toont het percentage lekkende bloedvaten over de geteste groepen. In deze afbeeldingen wordt de immunokleuring voor GFAP, waarmee Müllercellen worden gekleurd, weergegeven. Positieve kleuring is zichtbaar in de uitlopers van de Müllercellen, over de retina en rondom de bloedvaten.De breedte van de uitlopers van de Mullercellen van alle groepen wordt gepresenteerd. Behandeling met histamine of LXA4 alleen verminderde de breedte van de uitlopers. Wanneer beide reagentia echter samen werden toegepast, werd de breedte van de uitlopers hersteld.In deze afbeeldingen wordt de immunokleuring voor MAP2 getoond. Er is een positieve kleuring van de uitlopers en cellichamen van ganglioncellen waargenomen. De dichtheid van continue MAP2-positieve uitlopers van ganglioncellen uit alle groepen wordt weergegeven.Behandeling met histamine vermindert de continuïteit van dendritische processen, terwijl LXA4 geen significante effecten heeft. Eenmaal beheerst, kan dit experiment in drie tot vijf dagen worden uitgevoerd, mits correct uitgevoerd, met vijf minuten per retina voor dissectie, zes minuten voor behandeling, gevolgd door sectieerwerk, immunokleuring en analyse. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om vers weefsel en passende controles te gebruiken.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals live imaging, worden toegevoegd om real-time veranderingen in calciumgehaltes en mitochondriale eigenschappen te volgen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het gebruik van dit ex vivo acute retina-kweekmodel om een BRB-dysfunctie te creëren, de schade te beoordelen en te screenen op potentiële medicijnen. Hartelijk dank voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

an-acute-retinal-model-for-evaluating-blood-retinal-barrier-breach

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Het creëren van experimentele netvliesloslatingen met een reproduceerbare en aanhoudende hoogte van onthechting en zonder subretinale bloeding, is belangrijk voor het bestuderen van de pathofysiologie van fotoreceptorcel verlies in retinale aandoeningen en evalueren van potentiële therapeutische interventies. Hier melden wij een dergelijke methode in detail.

Netvliesloslating Model in Knaagdieren door Subretinal Injectie van natriumhyaluronaat

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor het induceren van retinale ischemie-reperfusieschade door verhoogde intraoculaire druk bij muizen. Retinale ischemie-reperfusieschade door verhoogde intraoculaire druk dient om menselijke pathologieën gekenmerkt door gecompromitteerd zuurstof en van voedingsstoffen in het netvlies model, waardoor onderzoekers potentiële cellulaire mechanismen en therapieën voor menselijke ziekten van het netvlies neurovasculaire eenheid onderzocht.

Een muismodel van retinale ischemie-reperfusie letsel door misbruik van intra-oculaire druk

Zuurstofgeïnduceerde retinopathie (OIR) kan worden gebruikt om ischemische netvliesaandoeningen zoals retinopathie van prematuriteit en proliferatieve diabetische retinopathie te modelleren en om te dienen als model voor proof-of-concept studies bij het evalueren van antiangiogene geneesmiddelen voor neovasculaire ziekten. OIR induceert robuuste en reproduceerbare neovascularisatie in het netvlies die kan worden gekwantificeerd.

Zuurstofgeïnduceerde retinopathiemodel voor ischemische netvliesziekten bij knaagdieren

Diabetische retinopathie is een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. Histologie, bloed-retinale barrièreafbraaktest en fluorescentieangiografie zijn waardevolle technieken om de pathofysiologie van het netvlies te begrijpen, wat de efficiënte screening van geneesmiddelen tegen diabetische retinopathie verder zou kunnen verbeteren.

Retinale pathofysiologische evaluatie in een rattenmodel

Dit protocol illustreert een in vitro endotheelceltranscytosetest als een model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren door het vermogen van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen te meten om mierikswortelperoxidase over cellen te transporteren in caveolae-gemedieerde transcellulaire transportprocessen.

Endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren

Degeneratieve oogziekten die de retinale pigmentepitheellaag van het oog aantasten, hebben een monogene en polygene oorsprong. Verschillende ziektemodellen en een softwaretoepassing, LipidUNet, zijn ontwikkeld om ziektemechanismen te bestuderen, evenals mogelijke therapeutische interventies.

LipidUNet-Machine Learning-gebaseerde methode voor karakterisering en kwantificering van lipideafzettingen met behulp van iPSC-afgeleid retinaal pigmentepitheel

We hebben verschillende protocollen ontwikkeld om schade aan het netvlies of degeneratie van het netvlies te induceren bij kikkervisjes van Xenopus laevis . Deze modellen bieden de mogelijkheid om retinale regeneratiemechanismen te bestuderen.

Modellen voor netvliesletsel genereren bij xenopus-kikkervisjes

Er werd een beschermingstest ontwikkeld om de veerkracht van het netvlies tegen overlijden door diabetes/diabetische retinopathie-gerelateerde beledigingen zoals oxidatieve stress en cytokines te controleren.

Een test om bescherming van het netvlies te detecteren tegen diabetesgerelateerde sterfte bij muizen

Dit protocol modelleert retinale ischemie-reperfusieschade in een muizenoog door retinale ischemie te induceren via canulatie van de voorste kamer en intraoculaire drukverhoging, gevolgd door intraoculaire druknormalisatie om de reperfusie te starten.

Inductie van retinale ischemie-reperfusieschade in een muisoogmodel

Deze studie presenteert een methodologie voor de toediening van therapieën in het netvlies en de oogzenuwen van de volwassen rat. Daarnaast wordt een unieke methode voor weefselverzameling geïntroduceerd voor een top-down en bloc verzameling van de oogzenuw en het netvlies bij een volwassen rat.

Oculaire therapeutische toediening en geavanceerde weefselafname bij volwassen ratten

Ontdek een kosteneffectief ex vivo varkensretina-model om bloed-retina barrière-breuken te evalueren en potentiële behandelingen zoals lipoxine A4 te screenen. Deze methode biedt waardevolle inzichten voor neurodegeneratieve ziekten.

Een acute retinale model voor het evalueren van Blood Retina Barrier Breach en potentiële geneesmiddelen voor de behandeling

Meer video's verkennen