A-CFSE gebaseerde test om de migratie van de huid van muizen dendritische cellen Onderzoek naar drainerende lymfeklieren tijdens infectie met

Het algemene doel van deze assay op basis van fluorescerende celtrackers is het monitoren en karakteriseren van specifieke celpopulaties van belang terwijl deze migreren van de huid naar de drainerende lymfeklier na een voetkusseninfectie met Bacille Calmette-Guerin, of BCG. We hebben deze techniek gebruikt om de dendritische celpopulatie te identificeren die naar de drainerende lymfeklier migreert na een BCG-infectie van de huid. Deze techniek maakte het mogelijk om de celmigratie te bestuderen door de tumoren tijdens een gedefinieerd venster van 24 uur te injecteren.

Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor de injectie in het voetzoolkussentje en de isolatie van de lymfeklieren moeilijk via tekst te leren zijn. Voor de injectie van Mycobacterium bovis BCG wordt, na bevestiging van het juiste sedatieniveau door middel van een knijptest bij de teen, een spuit met een 29-gauge naald van 1/2 inch gebruikt om het achterste voetzoolkussentje van een muis van acht tot 12 weken oud te inoculeren met 1 × 10⁶ colony-forming units van de bacteriën in 30 µL PBS. Injecteer controle-voetzoolkussentjes met enkel PBS.

Houd de dieren vervolgens in de gaten totdat ze volledig rechtop staan en gewicht kunnen dragen op de geïnjecteerde voetkussentje. Voor de CFSE-injectie dient u, op het juiste tijdstip na de BCG-injectie, een flesje van vijf millimolar CFSE op kamertemperatuur tienvoudig te verdunnen in PBS, waarbij u erop let dat de oplossing grondig wordt resuspendeerd. Vul vervolgens de spuit met de verdunde CFSE en dien 20 microliters toe in hetzelfde achterste voetkussentje dat de eerste injectie heeft ontvangen.

Maak 24 uur na de CFSE-injectie voorzichtig een verticale incisie in het achterdijbeen en verwijder het spiervet. Gebruik vervolgens een schaar en een pincet om de popliteaire lymfeklier, diep in de vetzak in de knieholte gelegen, bloot te leggen en uit te snijden. Breng de lymfeklier over in 0,5 milliliters steriele PBS op ijs en homogeniseer de lymfeklier door een 70 micron cell strainer in één putje van een six well plate met vijf milliliters PBS, met behulp van de achterzijde van een drie milliliter spuit.

Spoel de zeef met nog eens 5 milliliters buffer en breng de celoplossing over in een 15 milliliter buis. Centrifugeer vervolgens de cellen en resuspendeer het pellet in een voldoende volume buffer. Om de cellen te labelen voor flowcytometrie, zal ik Liaquat één tot tien keer tien tot de zesde cellen in vijf milliliter ronde-bodem polystyreen buisjes overbrengen en de cellen wassen in verse FACS-buffer.

Resuspendeer de pellets in 50 tot 100 µL van het juiste antilichaamcocktail bevattend anti-muis CD16 CD32 om aspecifieke FC-gemedieerde interacties te blokkeren in FACS-buffer op ijs, beschermd tegen licht. Was na 30 tot 45 minuten de cellen in FACS-buffer en resuspendeer de pellets in 50 tot 100 µL verse FACS-buffer. Het grootste deel van de CFSE-labeling in de popliteale lymfeknoop wordt waargenomen in MHC-II high en CD11c positive low cellen, wat consistent is met huid-dendritische cellen die migreren naar lymfeknopen die de huid draineren.

Zowel de frequentie als het totale aantal van deze gelabelde cellen lijken verhoogd in de popliteale lymfeklieren van BCG-geïnfecteerde muizen, vergeleken met PBS-geïnjecteerde controles, wat suggereert dat BCG de relocatie van deze cellen naar de drainerende lymfeklier versterkt. Dendritische cellen uit de huid blijven tot vijf dagen na infectie de drainerende lymfe binnengaan, waardoor de migratie van dendritische cellen in het huidige model zich ruim uitstrekt voorbij het tijdspad van de initiële activatie van antigeenspecifieke CD4 positieve T-cellen in de popliteale lymfeklier. Bovendien brengen migrerende dendritische huidcellen verhoogde niveaus van costimulerende moleculen tot expressie, wat het concept ondersteunt dat deze migrerende dendritische cellen geactiveerd zijn.

Belangrijk is dat zowel lymfeklierresistente mono-cytoïde als plasma-cytoïde dendritische cellen, die ontstoken lymfeklieren binnengaan via hoge endotheliale venulen en niet via afferente lymfevaten, negatief zijn voor CFSE, wat verder bevestigt dat CFSE-labeling voornamelijk in de voetzool plaatsvindt. Bovendien onthult aanvullende flowcytometrische analyse dat een subpopulatie van EpCAM low CD11b high cellen de belangrijkste migrerende subset van huid-dendritische cellen is die naar de popliteale lymfeklier draineert als reactie op een BCG-infectie. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in vijf minuten worden uitgevoerd als deze correct wordt gedaan.

Tijdens het uitvoeren van dit proces is het belangrijk om voorzichtig te zijn met de injectieplaats en het injectievolume; er moet uiterste zorg worden betracht om de drainerende lymfeklier tijdens de dissectie niet te beschadigen. Na de procedure kunnen andere methoden, zoals flowcytometrie of confocale microscopie, worden toegepast voor verdere analyse van de micro-expressie van subsetspecifieke cellen. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om cellen van de huid naar de drainerende lymfeklier te volgen binnen een periode van 24 uur als reactie op een infectie of vaccinatie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u voetkusseninjecties uitvoert en hoe u de drainerende lymfeklieren lokaliseert en isoleert voor het volgen en karakteriseren van migrerende dendritische celpopulaties van belang.