Name: Transductie-Transplantatie Mouse Model van myeloproliferatieve aandoening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Leer de transductie-transplantatiemethode voor het genereren van muismodellen met genexpressie in hematopoëtische cellen. Deze techniek helpt onderzoekers bij het bestuderen van hematologische maligniteiten en normale hematopoëse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door de V Foundation Scholar (AGF) en de MPN Research Foundation (AGF).

Deze studie werd goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Californië, Irvine uitgevoerd. Alle procedures werden uitgevoerd onder isofluraananesthesie en alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren. 1. Generatie van ecotrope retrovirus <ol><li> Bereid hoogwaardige plasmiden met een concentratie van ten minste 1 ug / ul met behulp van een commercieel maxi-prep kit of cesiumchloride zuivering. Opmerking: Deze omvatten een MSCV hoofdketen vector coderend voor het gen van belang (hier CALr 7,8) en teller keuze (GFP, Neo, etc.) en een ecotropische inpak plasmide, coderend voor gag-pol-env (bedoelde hier plasmide). </li><li> Ontdooien en uitbreiding weinig overgezette 293T cellen in DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en L-glutamine met penicilline / streptomycine (D10). Plate 5 x 10 6 cellen in een 10 cm weefselkweek behandeld schotel in een vochtigeweefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Uitbreiden 293T-cellen in de cultuur. De dag voor transfectie, wassen cellen door toevoeging van 1 ml PBS en zuig supernatant in een vacuüm kolf. </li><li> Cellen trypsinize, voeg 2 ml 0,05% trypsine en incubeer gerechten in een bevochtigde weefselcultuur incubator gedurende 2-3 minuten bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Om behandeling met trypsine te stoppen, voeg 3 ml D10 voor te schotelen en overdracht cellen om een ​​15 ml conische buis. Spin cellen bij 400 xg gedurende 10 min. </li><li> Zuig supernatant in een vacuüm kolf en resuspendeer celpellet in 2 ml D10. </li><li> Tel de cellen met behulp van trypan blauw exclusie onder toepassing van een hemocytometer. </li><li> Seed 2 x 10 6 cellen per schaaltje in drie 10 cm weefselkweek behandeld gerechten per virus gegenereerd. OPMERKING: Voor een optimaal resultaat, niet toestaan dat de cellen tot 30 hoger is dan - 50% samenvloeiing op het moment van transfectie of een slechte virus opbrengst kan worden verkregen. </li><li> Onmiddellijk voor transfectieaspireren media in een vacuüm kolf en te vervangen door 5 ml vers D10. </li><li> Voor elke 10 cm Petrischaal te transfecteren bereiden individuele steriele 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Pipetteer 760 ul gereduceerd serum medium in elk microcentrifugebuis, dan wordt voorzichtig 40 pl transfectiereagens direct in het medium. Incubeer de buizen in weefselkweek kap bij kamertemperatuur gedurende 5 min. </li><li> Voeg 30 ug MSCV vector met gen van interesse (15 ug bij gebruik lege vector) en 5 ug plasmide aan elke respectieve buis en meng voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur in weefselkweek kap gedurende nog 15 min. OPMERKING: Kleinere vectoren hebben de neiging om een hogere virale opbrengsten hebben. </li><li> Voeg voorzichtig het totale volume van elke reactie (ongeveer 800 ui) druppelsgewijs in zijn respectievelijke 10 cm petrischaal en zachtjes kantelt de schaal van links naar rechts om te mengen. Terug cellen aan de bevochtigde weefsel culture incubator. </li><li> Na 8 uur of overnacht incuberen in weefselkweek incubator, aspiraat media in een vacuüm fles en voorzichtig vervangen door 10 ml vers D10. </li><li> Op 48 uur na transfectie supernatant te verzamelen in een 35 ml spuit en filtreer door een 0,45 urn membraan celresten te verwijderen. </li><li> OPTIE: Plaats 10 ml vers D10 terug op de 293T-cellen en aanvullende virus kan worden geoogst 72 uur na transfectie. </li><li> Gooi 293T-cellen in biologisch gevaarlijk afval als er geen extra virus wordt verzameld. </li><li> Aliquot virale supernatant in voor eenmalig gebruik volumes (bijvoorbeeld 1 ml voor virustiter of 6,5 ml voor BM-infectie). Flash-freeze virus met vloeibare stikstof en opslag virus bij -80 ° C. LET OP: Vermijd herhaalde vries / dooicycli als zij zeer virustiter te verminderen. </li></ol> 2. Bepaal Relatieve virale titer door flowcytometrie <ol><li> 3T3 cellen ontdooien en handhaven D10. Cultuur van de cellen in een 10 cmweefselkweek behandelde schotel in een bevochtigde weefselcultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Uitvoeren virale titer in drievoud. Om cellen te bereiden, wassen cellen door het toevoegen van 1 ml PBS en zuig supernatant in een thermoskan. </li><li> Cellen trypsinize, voeg 2 ml 0,05% trypsine en incubeer gerechten in een bevochtigde weefselcultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Om behandeling met trypsine te stoppen, voeg 3 ml D10 voor te schotelen en overdracht cellen om een ​​15 ml conische buis. Spin cellen bij 400 xg gedurende 10 min. </li><li> Zuig supernatant in een vacuüm kolf en resuspendeer celpellet in 2 ml D10. </li><li> Tel de cellen met behulp van trypan blauw exclusie onder toepassing van een hemocytometer. </li><li> Zaad 3T3 cellen bij een dichtheid van 1 x 10 5 cellen in vijftien 60 mm weefselkweek behandelde gerechten en incubeer overnacht. </li><li> Maak 1: 3, 1:10, 1:30 en 1: 100 verdunningen van ontdooide virale supernatant middels D10 in een totaal van 1 ml. Ook een virus-vrij controle. </li><li> aspireren media van 3T3 cellen in een vacuüm kolf en vervangen door 4 ml D10. </li><li> Overlay de 3T3 cellen met verdunningen van virale supernatant en voeg polybreen tot een eindconcentratie van 8 ug / ml elk gerecht. Incubeer gedurende 48 uur in de weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Bepaal relatieve virale titer met stroomcytometrie: <ol><li> Om de cellen te wassen, zuigen de media in een vacuüm kolf en voeg 5 ml PBS. </li><li> Zuig het PBS in een thermoskan. Voeg 1 ml 0,05% trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 2-5 minuten om cellen los van de schotel. </li><li> Voeg 3 ml D10 en pipet op en neer om alle resterende cellen van de plaat los te maken. Breng de cellen een FACS buis en centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min. </li><li> Decanteer supernatant en was cellen met 3 ml PBS. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min en decanteren supernatant. Resuspendeer in 200 ul PBS. </li><li> Run cellen op een flowcytometer 9. Verzamel tussen de 20.000 - 30.000 events binnen tHij woont cel gate (bepaald door FSC vs. SSC) en bereken het percentage van de GFP + en GFP - cellen. OPMERKING: De virale titer wordt aanvaardbaar geacht wanneer de 1:30 verdunning van viraal supernatant opbrengst minimaal 50% GFP + 3T3 cellen. Als deze verdunning geeft minder dan 50% GFP + cellen vervolgens suboptimale transductie resultaten kunnen worden verkregen. De berekening van virale titer te bepalen werd aangepast van Limon et al. , Blood (1997) 9. </li><li> Relatieve virus titer te bepalen, gebruik maken van de vergelijking: virus titer = deeltje eenheden (PFU) / ml = [(Aantal 3T3 Cellen × frequentie van GFP + cellen) / Volume van Supernatant (ml)] × Verdunningfactor. </li></ol></li></ol> 3. transduceren Donor Bone Marrow Cells <ol><li> Om donor muizen voor het beenmerg te bereiden (BM) oogst, eerst verdoven muizen door isofluraan vaporizer met een debiet van 5% gecombineerde supplementairezuurstof bij 1 l / min. Knijp voet naar responsiviteit te beoordelen. OPMERKING: Donormuizen (minder dan 8 weken oud) worden bereid 5 dagen voorafgaand aan beenmerg oogst (8 dagen voorafgaand aan de transplantatie). Één donor muizen genoeg cellen minstens 2 ontvangers. </li><li> Injecteren 150 mg / kg 5-fluorouracil (5-FU) via retro-orbitale injectie in verdoofde muizen met behulp van een 27 G x ½ &quot;naald. VOORZICHTIGHEID! 5-FU een anti-kanker chemotherapeutisch middel. handvat 5-FU altijd in een gecertificeerde zuurkast of een getunnelde bioveiligheid kast. Neem contact op met het laboratorium en dierlijke veiligheid commissie van de instelling om de juiste etikettering van muizen behandeld met 5-FU te bepalen. <ol><li> Plaats de verdoofde muis op zijn kant en beperken door zowel de duim en wijsvinger, zodat de gaten enigszins uitsteekt uit de kop. </li><li> Te beginnen met de naald lateraal van de mediale ooghoek en met de schuine kant naar boven, steek de naald op een 45° hoek in het mediale richting en stopt wanneer de naald half ingebracht. Langzaam injecteren cellen en verwijderen verwijder voorzichtig de naald. LET OP: Als deze techniek correct wordt uitgevoerd, moet het oog iets terug te trekken en er geen weerstand moet op de naald inbrengen worden gevoeld. </li><li> Onderzoek muis op tekenen van schade zoals zwelling of bloeding. </li></ol></li><li> Oogst beenmerg 5 dagen na 5-FU behandeling (3 dagen voorafgaand aan de transplantatie). <ol><li> Verdoven muizen met isofluraan vaporizer met een stroomsnelheid van 5% gecombineerde extra zuurstof bij 1 l / min. Knijp voet naar responsiviteit te beoordelen. </li><li> Sacrifice muis door cervicale dislocatie. Steriliseren muis door royaal besproeien met 70% EtOH totdat vacht nat wordt. </li><li> Gebruik ontleden schaar, een insnijding in de huid en fascia ontleden de weg van de beenspieren. Vervolgens ontleden het been uit de buurt van de muis door het scheiden van het dijbeen op de heup en het scheenbeen bij de enkel. </li><li> Bochthet been in een &quot;L&quot; vorm en scheiden elke poot bot door te snijden bij het kniegewricht met het ontleden van een schaar. </li><li> Kraakbeen bij de distale einden van elk been bot verwijderen met het ontleden schaar om voorzichtig schrapen de spieren in de richting van het ene uiteinde van het been bot totdat het kraakbeen is uitgeschakeld. </li><li> Met behulp van een spuit met een 27 G x ½ inch naald, flush elk been bot met PBS aangevuld met 2% FBS meer dan 100 um nylon membraan in een 50 ml conische buis. Flush been tot been wit wordt het aantal cellen geoogst maximaliseren. </li><li> Gebruik de plunjer van een injectiespuit aan cellen mash door het nylon membraan in de 50 ml conische buis om een ​​enkele celsuspensie te verkrijgen. Herhaal dit met andere muis been. </li></ol></li><li> Centrifugeer cellen bij 4 ° C gedurende 10 min bij 400 xg en verwijder het supernatant. Resuspendeer BM in 5 ml ammoniumchloride kalium (ACK) buffer om rode bloedcellen te lyseren. Incubeer cellen op ijs gedurende 10 min. </li><li> Vulbuis met PBS om cellysis te stoppen. Centrifuge cellen bij 4 ° C gedurende 10 min bij 400 xg en verwijder het supernatant. Herhaal lysis stap als de BM pellet rode kleur. </li><li> Hersuspenderen in 5 ml PBS en tel cellen door trypan blauw exclusie onder toepassing van een hemocytometer. </li><li> Resuspendeer cellen bij 2 x 10 6 cellen per m met 2x pre-stim cocktail die bestaat uit DMEM aangevuld met 20% FBS, L-glutamine, penicilline / streptomycine, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml) en SCF (112 ng / ml). Plaat 2 ml per putje in 6 well platen. </li><li> Incubeer de cellen overnacht bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Voeg 2 ml virale supernatant aan elk putje met BM cellen en voeg polybreen (8 ug / ml). Spin platen bij 30 ° C gedurende 90 min bij 1500 xg dan plaat terug naar de weefselkweek incubator overnacht. </li><li> Pipet celsuspensie in conische buizen en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 10 min bij 400 xg, niet de plaat verwijderen. Resuspendeer cellen in 2 ml vers 2x pre-stim cocktail per putje en terug te keren naar de oorspronkelijke bronnen. </li&gt; <li> Voer een 2e spinoculation door herhalen van de stappen 3,7-3,9. </li></ol> 4. Transplant donorcellen in Ontvanger Muizen <ol><li> Bereid syngene ontvangende muizen voor transplantatie met letale dosis totale lichaamsbestraling &lt;24 uur voor de injectie van BM cellen. OPMERKING: Lethal stralingsdosis voor BALB / c-muizen typisch 800-900 cGy en 1,000-1,200 cGy voor C57B / 6 10. De dosis wordt gewoonlijk verdeeld in twee sessies van bestraling afstand tenminste 3-4 uur apart. </li><li> Vervolg van stap 3.11, oogst getransduceerde donorcellen van de 6 wells platen door voorzichtig pipetteren supernatant in conische buizen. Was elk putje met 1 ml PBS om resterende cellen te verzamelen en voeg aan 50 ml conische buizen. </li><li> Voeg 0,5 ml van 0,05% trypsine aan de putjes en incubeer bij 37 ° C in de weefselkweek incubator gedurende 5 min. </li><li> Voeg 1 ml D10 te putten en los eventuele resterende cellen door zachte pipetteren. cellen toe te voegen aan de respectievelijke buiss van stap 4,2 en pellet door centrifugeren bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 400 x g. </li><li> Was de cellen met PBS en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 400 x g. Hersuspenderen in 5 ml PBS en tel cellen met een hemocytometer door trypan blauw exclusie. OPMERKING: Als de vector een GFP-tag dan kwantificeren van het percentage GFP-positieve cellen met een flowcytometer. </li><li> Resuspendeer 5 x 10 5 - 2x 10 6 cellen in 50-100 pi PBS voor injectie in muizen. </li><li> Injecteren cellen via retro-orbitale injectie in verdoofde muizen met behulp van een steriele 27 G x ½ &quot;naald. LET OP: Overige injectie technieken zijn staart-ader, milt, of dijbeen. <ol><li> Verdoven muis met behulp van isofluraan en pinch voet naar responsiviteit te beoordelen. </li><li> Plaats de muis op zijn kant en beperken door zowel de duim en wijsvinger, zodat de gaten enigszins uitsteekt uit de kop. </li><li> Met de schuine kant naar boven, steek de needle lateraal van de mediale ooghoek bij een 45 ° hoek. LET OP: Als deze techniek correct wordt uitgevoerd, moet het oog iets terug te trekken en er geen weerstand moet op de naald inbrengen worden gevoeld. </li><li> Onderzoek muis op tekenen van schade zoals zwelling of bloeding. NB: Na de transplantatie muizen zal lage bloeddruk telt voor een aantal weken te hebben en dus vatbaar zijn voor infecties. Profylaxe met antibiotica of het gebruik van aangezuurd water worden gebruikt. </li></ol></li><li> Een maand na de transplantatie, meet de% GFP in het perifere bloed als indicator voor getransplanteerde donor cellen door flowcytometrie. OPMERKING: GFP alleen niet succes van implantatie van de cellen te bepalen. De virale transductie mogelijk mislukt nog aanslaan kan zijn opgetreden. In dit geval zou er geen GFP + cellen worden gedetecteerd, maar aanslaan van getransplanteerde cellen succesvol was. <ol><li> Neem 10 pi van perifeer bloed by aanprikken van de ader vena been met een 21 G x 1 ½ &quot;spuit en voeg deze toe aan 100 mM EDTA in PBS om stolling te voorkomen. </li><li> Voeg 1 ml ACK om bloed en Lyse op ijs gedurende 10 min. Pellet cellen door centrifugatie bij 400 xg gedurende 10 min. </li><li> Aspireren supernatant in een vacuüm kolf en voeg 1 ml PBS aangevuld met 2% FBS aan lysis te stoppen. Pellet cellen door centrifugatie bij 400 xg gedurende 10 min. </li><li> Aspiraat supernatant onder vacuüm kolf en resuspendeer pellet in 100 pl PBS gesupplementeerd met 2% FBS. </li><li> Run monsters op een flowcytometer en het verzamelen van 300.000 events binnen de levende cellen gate (bepaald door FSC vs. SSC) en bereken het percentage van de GFP + en GFP - cellen 9. </li></ol></li><li> Daarnaast is op 1 maand na de transplantatie, uit te voeren complete bloedbeeld (CBC) met behulp van een geautomatiseerde veterinaire hematologie-analyse 18 tot progressie van de ziekte te volgen. LET OP: Ga door met de ziekte door% bewakenGFP in perifeer bloed en CBC maandelijks. </li><li> Om het experiment te beëindigen, verdoven muis met behulp van isofluraan en pinch voet naar responsiviteit te beoordelen. Sacrifice muis door cervicale dislocatie en de oogst milt en beenmerg voor histopathologie. OPMERKING: De duur van het experiment is subjectief en de einddatum worden beoordeeld op basis van het verwachte fenotype. </li></ol>

<ol><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDaley%2C+GQ+%22Science%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science(New York, N.Y.)</a>. 247 (4944), 824-830 (1990).</li>
<li>Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Jak2V617F+causes+a+polycythemia+vera-like+disease+with+associated+myelofibrosis+in+a+murine+bone+marrow+transplant+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model.</a> Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).</li>
<li>Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2V617F+expression+in+murine+hematopoietic+cells+leads+to+MPD+mimicking+human+PV+with+secondary+myelofibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis.</a> Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).</li>
<li>Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+and+therapy+of+polycythemia+induced+in+mice+by+JAK2+V617F%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F.</a> PloS One. 1, e18(2006).</li>
<li>Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+murine+JAK2V617F-positive+myeloproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease.</a> Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).</li>
<li>Marty, C., Pecquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarty%2C+C+%22Calreticulin+mutants+in+mice+induce+an+MPL-dependent+thrombocytosis+with+frequent+progression+to+myelofibrosis%22">Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis</a>. , Blood. (2015).</li>
<li>Klampfl, T., Gisslinger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> N. Engl. J. Med. 369 (25), 2379-2390 (2013).</li>
<li>Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAraki%2C+M+%22Blood%22">Blood</a>. , (2016).</li>
<li>Limón, A., Briones, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Titer+Retroviral+Vectors+Containing+the+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Gene+for+Efficient+Expression+in+Hematopoietic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells.</a> Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Replication-Defective+Retrovirus+by+Transient+Transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li>
<li>Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Hematopoietic+Stem+Cell+Identification+And+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis.</a> Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).</li>
<li>Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+side+population+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Bio.+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse side population cells.</a> Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).</li>
<li>Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD150-+side+population+cells+represent+a+functionally+distinct+population+of+long-term+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+myeloproliferative+neoplasms%3A+JAK+of+all+grades%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades.</a> Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).</li>
<li>Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloproliferative+neoplasm+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol.+Oncol.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Myeloproliferative neoplasm animal models.</a> Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26 (5), 1065-1081 (2012).</li>
<li>Scil animal care company GmbH. , Source: 
 <a target="_blank" href="http://www.scilvet.us/company-downloads">http://www.scilvet.us/company-downloads</a> (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van het beenmerg transplantaties uitgevoerd bij muizen een essentiële trombocytemie-achtige ziekte met progressie herhalen om myelofibrose met CALRdel52 mutatie als de bestuurder van ziekte. Succesvolle transplantatie van cellen die CALRdel52 resulteert in verhoogde bloedplaatjes, uitbreiding van megakaryocyten en beenmerg fibrose. Beenmerg transplantatie een meerstaps proces is het belangrijk om stappen waarbij technische fout kan worden vermeden slechte engraftment va...

Transductie-transplantatie is een bruikbare methode voor hematologische maligniteiten model bij muizen. Deze techniek is bijzonder waardevol voor het bestuderen van myeloïde maligniteiten die teruggaat tot de eerste demonstratie dat ectopische expressie van BCR-ABL1 trouw kon recapituleren chronische myeloïde leukemie in muizen 1 geweest. Deze techniek is vervolgens vergemakkelijkt de uitgebreide studie van JAK2 V617F en MPL W515K / L gemuteerd myeloproliferatieve aandoening (MPN). MPN zijn een groep van hematologische kwaadaardigheden welke door de overproductie van rijpe myeloïde cellen en beenmerg fibrose. Deze ziekten meestal voort uit de klonale expansie van een hematopoietische stamcel die een somatische mutatie in beide Jak2, MPL of CALr heeft verworven. Transductie-transplantatie JAK2 V617F en MPL W515K / L-modellen vertonen de klinische kenmerken van polycytemie vera en myelofibrosis 2-5 &lt;/ Sup&gt;. Onlangs heeft een muismodel van calreticuline gemuteerde MPN is ook gemaakt met de transductie-transplantatie methode 6. Deze muizen ontwikkelen een essentiële trombocytemie-achtige ziekte met verhoogde bloedplaatjes, verhoogd aantal megakaryocyten en beenmerg fibrose. Samen hebben deze modellen niet alleen de gelegenheid om inzicht te krijgen in de moleculaire pathogenese van MPN, maar ook het vermogen ontwikkelen en therapie te bestuderen in een pre-klinische setting. Dit manuscript geeft een gedetailleerde beschrijving van transductie-transplantatie methode met een focus op de CALRdel52 mutatie. Deze techniek houdt transplantatie van retroviraal getransduceerde beenmergcellen expressie het mutante construct in bestraalde syngene ontvangende muizen.

<table><tbody><tr><td>Cellijnen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>293T cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>3T3 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Plasmiden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoPak, ook bekend als pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>12371</td><td>Retrovirale verpakkende cellijnen, zoals EcoPack 2-293, kunnen in plaats van het EcoPak-plasmide en standaard 293T-cellen worden gebruikt. Aanvullende &gamma;-retrovirus envelop en verpakking plasmiden zijn verkrijgbaar bij Addgene en anderen.</td></tr><tr><td>MSCV-IRES-GFP (MIG)</td><td>Addgene</td><td>20672</td><td>Aanvullende &gamma;-retrovirale transfer plasmiden zijn verkrijgbaar bij Addgene en anderen.</td></tr><tr><td>Verbruiksartikelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2" naalden</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Corning</td><td>MT-35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine/L-glutamine</td><td>Corning</td><td>MT-30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05%)</td><td>Corning</td><td>MT-25-052-CI</td><td>Kan zelfgemaakt worden</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>10 cm schalen</td><td>Fisher</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conische buizen</td><td>Fisher</td><td>12565268</td><td></td></tr><tr><td>60 mm schalen</td><td>Fisher</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Polybreen</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td></td></tr><tr><td>5-FU</td><td>Fisher</td><td>A13456-06</td><td></td></tr><tr><td>100 &#181;m cel zeefjes</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische buizen</td><td>Fisher</td><td>12565270</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Fisher</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>FACS buizen</td><td>Fisher</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu;m spuitfilters</td><td>Fisher</td><td>0974061B</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>ACK buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Kan zelfgemaakt worden</td></tr><tr><td>Recombinant muur IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant muur IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant muur SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365809001</td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>1,5 ml centrifugebuizen</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-ray bestraler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transductie-transplantatie mouse model van myeloproliferatieve aandoening

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Transductie-transplantatie is een snelle en efficiënte manier om hematologische kwaadaardige ziekten bij de mens in muizen te modelleren. Deze techniek resulteert in expressie van het gen van belang in hematopoëtische cellen en kan worden gebruikt om de rol van het gen in normale en/of kwaadaardige hematopoëse te bestuderen. Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe transductie-transplantatie kan worden uitgevoerd met behulp van calreticulin (CALR) mutaties, die onlangs zijn geïdentificeerd in myeloproliferatieve neoplasma's (MPN), als voorbeeld. In dit protocol worden hele beenmergcellen van donormuizen, behandeld met 5-fluorouracil (5-FU), getransduceerd met een retrovirus dat mutaties in CALR codeert en getransplanteerd in levensgevaarlijk bestraalde syngeneïsche gastheren. Donorcellen die mutaties in CALR tot expressie brengen, zijn gemarkeerd met groen fluorescent eiwit (GFP). Getransplanteerde muizen ontwikkelen een MPN-fenotype, inclusief verhoogde bloedplaatjes in het perifere bloed, expansie van megakaryocyten in het beenmerg en beenmergfibrose. We geven een stapsgewijze beschrijving van hoe retrovirus te genereren, het virale titer te berekenen, hele beenmergcellen te transduceren en te transplanteren in bestraalde ontvangermuizen.

De transductie-transplantatietechniek resulteert in hematopoietische reconstitutie van de ontvangende muizen met cellen het gen van belang tot expressie brengen. Figuur 1 toont een overzicht van de transductie-transplantatie muismodel van calreticuline gemuteerde MPN. Kort samengevat, retrovirus expressie CALRwt of CALRdel52 wordt gebruikt om BM cellen te infecteren van een C57B / 6 donormuis. Getransduceerde cellen worden getransplanteerd in bestraalde C57B / 6 ontvange...

Dit manuscript geeft een beschrijving van de methodologie die wordt gebruikt om muizenmodellen voor transductie-transplantatie te vestigen. Er wordt een gedetailleerd overzicht gegeven van technische fouten die moeten worden vermeden bij het uitvoeren van beenmergtransplantaties. Er moet een duidelijk begrip worden verkregen van het belang van hoog viraal titer, transfectie/transductie en bestraling.

Transductie-Transplantatie Mouse Model van myeloproliferatieve aandoening

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

Het algemene doel van deze procedure is om muizen te genereren die het gen van interesse tot expressie brengen in hematopoëtische cellen met behulp van de transductie-transplantatiemethode. Binnen een korte periode kan deze methode helpen vast te stellen of uw gen van interesse een hematologische maligniteit induceert. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot therapie of diagnoses van hematologische maligniteiten, vanwege de versnelde ontwikkeling van muismodellen waarmee potentiële therapeutica getest kunnen worden.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in hematologische maligniteiten, kan deze ook worden gebruikt om de rol van een specifiek gen van belang voor de normale hematopoëse te bestuderen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met dit experiment moeite hebben, aangezien het meerdere stappen vereist. Daarnaast is het genereren van een virus met een hoge titer cruciaal voor het succes van dit experiment.Een visuele demonstratie van deze procedure is belangrijk, aangezien het werken met muizen moeilijk kan zijn en oefening vereist. Nadat een muis is gebisteld en de diepte van de anesthesie is gecontroleerd volgens het tekstprotocol, wordt de muis op zijn zij geplaatst en wordt het dier met de duim en wijsvinger vastgehouden zodat het oog enigszins uit het hoofd steekt. Om 150 milligram per kilogram 5-fluorouracil, of 5-FU, via een retro-orbitale injectie toe te dienen, wordt een 27-gauge halve-inch naald in een hoek van 45 graden ingebracht, met de schuine zijde naar boven in mediale richting, waarbij gestopt wordt wanneer de naald halverwege is ingebracht.Injecteer de oplossing langzaam en verwijder vervolgens voorzichtig de naald. Controleer de muis op tekenen van letsel, zoals zwelling of bloedingen, en zorg ervoor dat de muis herstelt en weer begint te lopen. Vijf dagen later, na het opofferen van het dier volgens het tekstprotocol, steriliseert u de muis met 70% ethanol door ruim te sprayen tot de vacht nat is.Maak met dissectieschaar een incisie in de huid en dissecteer de fascia van de beenspieren. Dissecteer vervolgens het been weg van de muis door het femur bij de heup en het tibia bij de enkel door te snijden. Buig het been in een L-vorm en gebruik de dissectieschaar om elk beenbot te scheiden door in het kniegewricht te knippen.Schraap vervolgens voorzichtig de spier richting één uiteinde van het dijbeen totdat het kraakbeen is losgekoppeld. Spoel daarna elk dijbeen met behulp van een spuit met een 27-gauge naald van een halve inch, met PBS aangevuld met 2% FBS, door een nylon membraan van 100 micrometer in een conische buis van 50 milliliter, tot het bot wit wordt, om het aantal geoogste cellen te maximaliseren. Druk de cellen met de zuiger van een spuit door het nylon membraan in de conische buis van 50 milliliter om een enkelcellige suspensie te verkrijgen.Herhaal dit met het andere muizenpootje. Centrifugeer de geoogste cellen 10 minuten bij 400 ×g bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant. Voeg vervolgens vijf milliliter ammoniumchloride-kalium, of ACK, toe om het beenmerg opnieuw te suspenderen.Incubeer de celsuspensie 10 minuten op ijs om de rode bloedcellen te lyseren. Vul de buis aan met PBS om de lysering te stoppen. Centrifugeer de cellen vervolgens opnieuw en verwijder het supernatant.Resuspendeer de cellen met vijf milliliter PBS en tel de cellen met een hemocytometer middels Trypan blauw-exclusie. Voeg vervolgens 2x pre-stem cocktail toe om de cellen te resuspenderen op een concentratie van twee keer 10^6 cellen per milliliter. Zaai daarna twee milliliter uit in de putjes van zes-wells platen.Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende de nacht. Voeg na de incubatie twee milliliter viraal supernatant toe aan elke put, gevolgd door acht microgram per milliliter polybrene. Centrifugeer de platen bij 1500 ×g bij 30 °C gedurende 90 minuten.Plaats de platen vervolgens gedurende de nacht terug in de incubator. Pipetteer de celstuspensie in conische buizen en centrifugeer bij 400 ×g bij 4 °C gedurende 10 minuten. Gebruik 2x pre-stem cocktail per putje om de cellen opnieuw te resuspenderen en zaai deze opnieuw uit in de oorspronkelijke putjes.Nadat de ontvangende muizen volgens het tekstprotocol zijn voorbereid op transplantatie, worden de getransduceerde donorcellen geoogst uit de zes-wells platen door het supernatant voorzichtig met een pipet in conische buizen over te brengen. Gebruik één milliliter PBS om elke well te wassen en verzamel de resterende cellen in de buizen. Voeg 0,5 milliliter 0,05%trypsine toe aan de wells en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.Voeg vervolgens één milliliter D-10 toe aan de wells en laat eventuele resterende cellen los door voorzichtig te pipetteren. Voeg daarna de cellen toe aan de respectievelijke buisjes en centrifugeer deze bij 400 ×g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Was de cellen vervolgens opnieuw met PBS.Resuspendeer na het centrifugeren de cellen in vijf milliliter PBS en tel ze met behulp van Trypanblauw-uitsluiting en een hemocytometer. Voor injectie in muizen worden vijf keer 10^5 tot twee keer 10^6 cellen geresuspendeerd in 50 tot 100 µL PBS. Plaats de muis op zijn zij en fixeer deze met de duim en wijsvinger, zodat het oog iets uit het hoofd steekt.Steek de naald met de schuine zijde naar boven onder een hoek van 45 graden lateraal ten opzichte van de mediale canthus in en injecteer. Controleer na de injectie de muis op tekenen van letsel, zoals zwelling of bloedingen op de injectieplaats, en raadpleeg het tekstprotocol voor aanvullende nazorg na de injectie. Analyseer tot slot de GFP-expressie in het bloed, overeenkomstig het tekstprotocol.Deze figuur illustreert hoe de relatieve virale titer wordt berekend, waarbij het GFP-percentage wordt bepaald op basis van events verzameld uit de live cell-gate. Hier wordt een titer getoond met meer dan één viraal deeltje per cel, en deze monsters vertegenwoordigen titers met enkele virale deeltjes per cel. Idealiter zou bij een verdunning van 1:30 van het viraal supernatant ten minste 50% GFP-positieve cellen worden gedetecteerd.In dit experiment wordt een succesvolle transplantatie-ontvanger gepresenteerd, waarbij CALRdel52-muizen een MPN-fenotype vertonen met verhoogde bloedplaatjes, een toename van megakaryocyten in het beenmerg en beenmergfibrose. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in acht dagen worden uitgevoerd, mits correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om elke stap van het protocol nauwgezet te volgen.Na de ontwikkeling heeft deze techniek onderzoekers de weg vrijgemaakt om de effecten van specifieke genen in de hematopoëse te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u muizen kunt produceren die uw gen van belang tot expressie brengen in hematopoëtische cellen.

transduction-transplantation-mouse-model-myeloproliferative

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video demonstrates the induction of intestinal graft-versus-host disease, GvHD, in a lethally-irradiated recipient mouse using allogeneic hematopoietic stem cells and GvHD-inducing splenic alloreactive T lymphocytes. This protocol helps establish a severe acute intestinal GvHD model to understand the mechanism of the disease and develop innovative therapeutic options.

Induction of Graft Versus Host Disease in Mouse Models via Allogeneic Bone Marrow and Splenic Cell Transplantation

We presenteren een snel en flexibel protocol voor een enkelvoudig T-celreceptor (TCR) retroviraal-gebaseerd in vivo expressiesysteem.  Retrovirale vectoren worden gebruikt om beenmerg-progenitorchellen te transduceren om T-celontwikkeling en functie van een enkele TCR in vivo te bestuderen als een alternatief voor TCR-transgene muizen.

Retrovirale Transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van T-cel Receptor Retrogenic Muizen

Hier gebruiken we bioluminescente, X-ray, en het positron-emissie tomografie/berekend tomography imaging te bestuderen hoe remmende mTOR activiteit beïnvloedt het beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in een xenograft model. Dit zorgt voor fysiologisch relevante, niet-invasieve en multimodale analyses van het effect van de anti-myeloma van therapieën gericht op beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in vivo.

Multimodale bioluminescente en positronisch-emissie tomografie/computationele Tomography Imaging van Multiple Myeloma beenmerg Xenografts in NOG muizen

We beschrijven het gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) te beoordelen van de kwaadaardige potentieel van genetisch gemanipuleerde hematopoietische cellen. HSCT is handig voor de evaluatie van verschillende kwaadaardige hematopoietische cellen in vivo , alsmede het genereren van een grote cohort van muizen met myelodysplastic syndromes (MDS) of leukemie ter evaluatie van nieuwe therapieën.

Gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom

Graft-versus-host ziekte is een belangrijke complicatie na allogene beenmergtransplantatie. Dendritische cellen spelen een cruciale rol in de pathogenese van graft-versus-host ziekte. Het huidige artikel beschrijft een nieuw beenmergtransplantatieplatform om de rol van dendritische cellen te onderzoeken bij de ontwikkeling van graft-versus-host ziekte en het graft-versus-leukemie-effect.

Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken

We beschrijven de intraparenchymale transplantatie van menselijke neurale voorlopercellen getransduceerd met een dual reporter vector die luciferase-groen fluorescerend eiwit (GFP) in de hersenen van muizen tot expressie brengt. Na transplantatie wordt het luciferasesignaal herhaaldelijk gemeten met behulp van in vivo bioluminescentie en GFP-tot expressie brengende getransplanteerde cellen geïdentificeerd in hersensecties met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Intracerebrale transplantatie en in vivo bioluminescentie tracking van menselijke neurale voorlopercellen in de hersenen van de muis

Dit protocol beschrijft de isolatie van dubbelnegatieve thymocyten uit de thymus van de muis, gevolgd door retrovirale transductie en co-cultuur op het delta-achtige 4-tot expressie brengende beenmerg stromale cellijn co-cultuursysteem (OP9-DL4) voor verdere functionele analyse.

Co-cultuur en transductie van murine thymocyten op delta-achtige 4-tot expressie brengende stromale cellen om oncogenen in T-cel leukemie te bestuderen

Hier wordt intra-peritoneale injectie van leukemiecellen gebruikt om acute myeloïde leukemie (AML) bij muizen vast te stellen en te verspreiden. Deze nieuwe methode is effectief bij de seriële transplantatie van AML-cellen en kan dienen als een alternatief voor diegenen die problemen en inconsistenties kunnen ervaren met intraveneuze injectie bij muizen.

Intra-peritoneale transplantatie voor het genereren van acute myeloïde leukemie bij muizen

Het huidige protocol beschrijft de ontwikkeling van een reproduceerbaar muizenmodel van ruggenmergglioom door tumorcellen in de tussenwervelruimte te injecteren, wat een effectievere en minder invasieve benadering biedt voor onderzoek en therapeutische ontwikkeling.

Chirurgische transplantatie van tumorcellen in het ruggenmerg van muizen

Het protocol heeft tot doel een muismodel te beschrijven voor het genereren van recidieven van acute lymfatische leukemie, gebaseerd op de dynamiek van de respons op inductiechemotherapie.

Muismodel van leukemie Terugval naar inductiechemotherapie voor acute lymfoblastische leukemie

Leer de transductie-transplantatiemethode voor het genereren van muismodellen met genexpressie in hematopoëtische cellen. Deze techniek helpt onderzoekers bij het bestuderen van hematologische maligniteiten en normale hematopoëse.

Transductie-Transplantatie Mouse Model van myeloproliferatieve aandoening

Meer video's verkennen