Meten van de stijfheid van Ex Vivo Mouse aorta's met behulp van Atomic Force Microscopy

Het algemene doel van dit protocol is om de procedures te beschrijven voor het gebruik van Atomic Force Microscopy om de Ex Vivo elastische modulus van muis aortas te meten. Deze methode helpt om sleutelvragen te beantwoorden in het veld van vasculaire biomechanica en ziekten, zoals cardiovasculaire ziekten en veroudering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de AFM de biomechanische eigenschappen van zachte biologische monsters zoals slagaders en cellen karakteriseert met een grote mate van nauwkeurigheid op Danoscale niveaus.

Ik zal de AFM-procedures presenteren, en Dokter Shu-lin Liu, een onderzoeksmedewerker van ons laboratorium, zal laten zien hoe muis aortas worden geïsoleerd. Om te beginnen, euthanaseeër een muis en verwijder de aorta zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Gebruik een paar kleine pincetten om het vet rond de aorta te grijpen en gebruik een klein schaar om voorzichtig het vet rond de aorta weg te snijden.

Grasp vervolgens voorzichtig de aorta met pincetten en maak een snede door het vat aan het begin van de ascenderende aorta en nog een snede aan het einde van de aflopende aorta, net boven de abdominale aorta. Breng de gedissecteerde aorta over naar een 60 millimeter schaal met PBS zonder calcium of magnesium. In de schaal, blijf elk overgebleven vetweefsel van de aorta verwijderen en open vervolgens de aorta longitudinaal.

Snijd vervolgens een stuk van 2 millimeter bij 4 millimeter uit de aflopende aorta en een stuk van dezelfde grootte uit de aortaboog voor analyse met behulp van de Atomic Force Microscope. Plaats deze stukken weefsel in een nieuwe 60 millimeter plastic schaal en houd ze vochtig in een druppel PBS. Verwijder voorzichtig het PBS rond het weefsel met behulp van een labdoek zonder de aorta aan te raken.

Zorg ervoor dat de luminale zijde van het weefsel naar boven wijst en gebruik vijf tot tien microliter cyanoacrylaatlijm om elke uiteinde van de geopende aorta voorzichtig aan de plaat te lijmen. Het is cruciaal dat de aorta niet wordt uitgerekt tijdens dit proces. Controleer na voltooiing of de gelijmde aorta niet is gevouwen of drijft.

Laat de lijm op de aorta 30 tot 60 seconden drogen, voeg voorzichtig PBS toe en dompel het monster onder. Gebruik een pincet om een siliconen nitraat AFM-sonde met een bolvormige tip op de sondehouder te schuiven. Bevestig vervolgens de sondehouder stevig aan de ZScanner-montage van de AFM-kop.

Open vervolgens de AFM-software. Kies het type experiment door naar de Experimentcategorie te gaan en Contact Mode te selecteren. Ga vervolgens naar Experimentgroep en selecteer Contact Mode in Vloeistof, en ga tenslotte naar Experiment en selecteer Contact Mode in Vloeistof.

Zodra deze zijn geselecteerd, klik op Experiment laden. Dit zal de laser inschakelen. Bereid vervolgens een monster voor om de laser uit te lijnen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Plaats het monster op de AFM. Positioneer de laserstip op de punt van de AFM-sonde door de laserpositioneringsknoppen aan te passen. Gebruik vervolgens de detectorpositioneringsknoppen om de positie van de fotodiode aan te passen tot de waarden voor Verticale Deflectie tussen nul en min één volt zijn, en de Horizontale Deflectie dicht bij nul volt ligt.

Controleer vervolgens of het laser-somsignaal is gemaximaliseerd. Indien nodig, pas de positie van de laserstraal op de AFM-tip en de positie van de fotodiode aan om het maximale somsignaal te verkrijgen. Om met kalibratie te beginnen, selecteer controleparameters en stel de parameter voor Scangrootte in op nul.

Stel de Scansnelheid in op één hertz. Stel de Steekproef/Lijn in op 256 en de Deflectiesetpoint op 20 nanometer. Selecteer vervolgens Engage.

Zodra de sonde contact maakt met het oppervlak van de plaat, klik op Ramp. Selecteer vervolgens uitgebreide modus in het scanwerkbalkmenu en stel de parameters in zoals hier getoond. Selecteer in de rampwerkbalk ramp continuus en verkrijg een krachtcurve op de plaat.

Stel in deze krachtcurve Kanaal 1 in op Deflectiefout om de software toe te staan de resultaten te weergeven als verticale deflectie versus Z-positie. Klik aan de linker- of rechterkant van de krachtcurve en sleep de cursor om een lineair gebied van de krachtcurve te omvatten dat zal worden aangepast met de rechte lijn. Selecteer vervolgens Ramp in de werkbalk en klik op Gevoeligheid bijwerken.

Noteer de huidige waarde. Selecteer vervolgens Calibreren en klik op Detector. Voer een gemiddelde waarde in van de vijf metingen in het Deflectiegevoeligheidsvak.

Klik twee tot drie keer op Terugtrekken om de AFM-kop te verhogen en interactie tussen de AFM-tip en de plaat tijdens het thermische afstemmen te voorkomen. Klik vervolgens op Thermisch afstemmen in de werkbalk. Stel het Thermisch afstembereik in op tussen een en 100 kilohertz en stel de Correctie van de Deflectiegevoeligheid in op 1.144 voor V-vormige cantilevers en 1.166 voor rechthoekige cantilevers.

Klik in het menu Thermisch afstemmen op Gegevens verwerven om een thermische afstemmingscurve te verkrijgen. Plaats vervolgens rode streepjeslijnen aan beide zijden van de curve en selecteer ofwel het Lorentziaanse model of het eenvoudige harmonische oscillatormodel, afhankelijk van welke het beste past bij de gegevens. Klik vervolgens op Gegevens aanpassen en selecteer Veerconstante K berekenen om deze waarde op te slaan.

Plaats een 60 millimeter kweekschaal met het aortaweefsel op het microscoopplatform en bevestig de plaat met de magnetische plaathouder. Zodra de aorta betrokken is met de cantilever, zorg ervoor dat het piezocentrum stabiel is en klik op Ramp. Stel de Rampgrootte in op drie micrometer, de Triggermodus op Relatief en de Triggerdrempel op 100 nanometer.

Selecteer vervolgens ramp continuus. Observeer dat het contactpunt tussen de sonde en het monster ongeveer in het midden tot de onderste driekwart van de Z-rampcyclus voorkomt. Als dit niet wordt waargenomen, ontkoppel van het monster, pas de rampgrootte aan zoals nodig en herkoppel het monster.

Klik vervolgens op Microscoop in de menubalk en selecteer Engage-instellingen. Verander de SPM-terugtrekking naar 30 micrometer en klik vervolgens op OK. Na het observeren van de krachtcurve, klik op Vastleggen in de menubalk