Name: Meten van de stijfheid van Ex Vivo Mouse aortas met behulp van Atomic Force Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Leer hoe u de elasticiteitsmodulus van muizenaorta's ex vivo meet met Atomic Force Microscopy. Deze methode biedt inzicht in vasculaire biomechanica en cardiovasculaire ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AFM-analyse werd uitgevoerd op instrumentatie ondersteund door het Pennsylvania Muscle Institute en het Institute for Translational Medicine and Therapeutics, Perelman School of Medicine, de Universiteit van Pennsylvania. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies HL62250 en AG047373. YHB werd ondersteund door een post-doctoraal fellowship van de American Heart Association.

Animal werk in deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies van de Universiteit van Pennsylvania. De methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen uitgevoerd. 1. Voorbereiding van de muis en isolatie van de Aorta <ol><li> Verdoven een muis met ketamine (80 - 100 mg / kg), xylazine (8-10 mg / kg) en acepromazine (1-2 mg / kg) intraperitoneaal. Bevestig anesthesie met een staart pinch-test. Zodra de muis is volledig verdoofd, euthanaseren de muis door cervicale dislocatie. </li><li> Plaats de muis op zijn rug en speld de muis om een ​​dissectie board. Reinig de buik met 70% (v / v) ethanol doekjes. </li><li> Knijp de huid op het midden van de lijn en een kleine initiële incisie met middelgrote microchirurgie schaar op de buik. Houd de huid met een tang, gebruik middelgrote microchirurgische schaar om de huid en het buikvlies gesneden uit de buik tot het borstbeen. </li><li> Knip de ribben aan both kanten met middelgrote microchirurgie schaar. Verwijder voorzichtig de longen en de lever met een klein formaat microchirurgie schaar, en laat het hart en de aorta. Breng de muis en dissectie boord om een ​​dissectie microscoop. </li><li> Pak het vet rond de aorta met kleine tang en gebruik maken van kleine schaar om zorgvuldig weggesneden vet rond de aorta. </li><li> Voorzichtig pak de aorta met een tang, maak een model met klein formaat microchirurgische schaar op het begin van de aorta ascendens en een snede aan het einde van de neergaande aorta, net boven de abdominale aorta. </li><li> Breng de ontleed aorta een 60-mm schotel met 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; zonder calcium en magnesium). </li><li> Blijven om weg te ontleden alle resterende vetweefsel uit de aorta met behulp van kleine formaat microchirurgie schaar. Gebruik maken van kleine schaar om de aorta in de lengterichting te openen. </li><li> Met kleinschalige microchirurgische schaar om een ​​klein stukje (~ 2 x 4 mm) van de afdalende aorta en aorti gesnedenc boog voor AFM-analyse (figuur 1). Plaats het weefsel in een 60-mm kunststof schaal en het vochtig te houden in een druppel PBS. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54630/54630fig1.jpg" /> Figuur 1:. Een beeld dat de locatie van de verschillende Aorta segmenten in een muis De aorta werd geïsoleerd van het hart naar het membraan, en een klein deel van de neergaande aorta en de aortaboog werden gebruikt om de elastische moduli bepalen. Schaal bar, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54630/54630fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 2. Voorbereiden Tissue Monsters voor de AFM Metingen <ol><li> Verwijder de PBS voorzichtig met een lab-wipe zonder het aanraken van de aorta. Wees er zeker van dat de luminale zijde van het weefsel naar boven wijst. </li><li> Voorzichtig lijm elk uiteinde van de geopende aorta aan de plaat door de add<html> ing 5-10 pl cyanoacrylaat kleefmiddel met een gel-lading-punt (figuur 2). OPMERKING: De hoeveelheid lijm die nodig is om het weefsel vast bevestigt aan elk uiteinde moet empirisch worden bepaald. Het is essentieel dat de aorta niet tijdens dit proces wordt gerekt. </li><li> Controleer de gelijmde aorta om er zeker van dat het niet gevouwen of zweven. Na de lucht-drogen van de lijm op de aorta (30-60 sec), zachtjes toe te voegen PBS en dompel het monster. LET OP: Voorbereiding van de AFM (stappen 3-5) kunnen worden uitgevoerd terwijl het weefsel wordt voorbereid voor analyse. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54630/54630fig2.jpg" /> Figuur 2: cartoon van een aortasegment gelijmd op een 60 mm kweekschaal gebruikt cyanoacrylaat lijm Het cyanoacrylaat kleefmiddel wordt aangebracht op de rand van een aorta monster voorbereiding AFM metingen..com / files / ftp_upload / 54630 / 54630fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. 3. Het laden van de Probe <ol><li> Monteer een vloeistof sonde houder op de sonde belasting stand. </li><li> Met een pincet, schuift een siliciumnitride AFM probe (0,06 N / m cantilever) met een bolvormige top (We hebben gebruik gemaakt van een 1-um diameter SiO 2 deeltjes maar grotere afmetingen kunnen ook worden gebruikt) aan de houder probe. Zorg ervoor dat de AFM sonde stevig is bevestigd aan de houder van probe. </li><li> Schuif de sonde houder op de Z-scanner monteren van de AFM hoofd, en ervoor te zorgen dat de houder sonde stevig vastzit. </li></ol> 4. Het uitlijnen van de laser op de Probe <ol><li> Open de AFM software. Kies het experiment op de software; Experiment Categorie naar Contact Mode, Experiment Group naar Contact Mode in vloeistof en Experiment naar Contact Mode in vloeistof. Klik op Laden experiment in de software; dit zet de laser. </li><li> Voeg 3 ml gedestilleerd water tot een 50-mm glazen onderste schaal en leg de schotel op het stadium van de laser uitlijningeenheid. Deze eenheid vereenvoudigt het focusseren van de laserstraal op de achterzijde van de cantilever. </li><li> Monteer de AFM hoofd rechtop op de laseruitlijning eenheid en de stroomvoorziening op de laser uitlijning unit. Voeg ongeveer 50 ul gedestilleerd water om een ​​druppel op de AFM tip vormen. </li><li> Met behulp van de joystick, hoe lager de AFM hoofd, zodat de AFM tip contact met water in de schotel maakt. Als geen contact wordt gemaakt tussen de AFM tip en water in de schaal, voorzichtig verhogen de schotel totdat contact wordt gemaakt. Pas de scherpstelling, helderheid en XY-positie, zodat de AFM tip is met het oog op het LCD-scherm van de uitlijning unit. </li><li> Plaats de laserspot op de punt van de AFM probe door aanpassing van de laserpositionering knoppen van de AFM weg. Met behulp van de detector positionering knoppen op de AFM hoofd, stel de ponerenion van de fotodiode tot waarden tussen 0 en -1 V worden verkregen voor de vertikale afbuiging en ~ 0 V wordt verkregen voor de horizontale afbuiging. </li><li> Controleer de laser somsignaal wordt gemaximaliseerd. Herhaal eventueel stap 4.5 worden bijgestuurd de positie van de laserstraal op de AFM tip en de positie van de fotodiode de maximale somsignaal verkrijgen. Opmerking: Het kan nodig zijn de AFM probe hiervan op de houder probe maximaal somsignaal zelfs als stap 4,5 wordt herhaald verkrijgen. </li></ol> 5. Het kalibreren van de doorbuiging gevoeligheid en Spring Constant van de AFM Probe <ol><li> Maak een kras op een 60 mm cultuur schotel met een pincet en vul de schaal met gedestilleerd water. Plaats de cultuur schotel op het monster houder plaat. In dit geval zet de schaal op het gemotoriseerde XY scan fase van een omgekeerde microscoop. </li><li> Plaats een magneetplaat houder boven op de plaat te houden het veilig tijdens de beeldvorming. </li><li> Klik <strong&gt; &#39;Up&#39; pijl in het navigatiemenu op de software aan de AFM hoofd omhoog tot bijna de hoogste stand om ervoor te zorgen dat de AFM sonde het gerecht niet zal raken. OPMERKING: Deze stap is zeer belangrijk omdat het voorkomt dat het breken van de AFM tip. </li><li> Plaats de AFM hoofd op de microscoop podium. </li><li> Gebruik de microscoop te richten op de kras op de plaat. Gebruik de joystick, of klik op de pijl &#39;Down&#39; in het navigatiemenu te langzaam en voorzichtig laat de AFM sonde in de PBS. Plaats het hoofd iets boven de kras in de plaat. OPMERKING: als de beginpositie van de AFM kop dichter bij het monster, de tijd nemen wordt aanzienlijk verkort. </li><li> Alvorens, past de positie van de laserstraal op de AFM tip en de positie van de fotodiode het maximumbedrag signaal vergaren als nodig. </li><li> Selecteer een tip soort door te klikken op Wijzigen Probe in het menu Instellingen. </li&gt; <li> Klik op Controleer parameters en stel de parameters: scanformaat tot 0, Scan Rate tot 1 Hz, Sample / lijn naar 256 en doorbuiging Setpoint tot 20 nm. Klik Engage. Het venster Status Engage blijft open tot de sonde contact met het oppervlak van de plaat maakt. Na het inschakelen van de sonde, klik Ramp. </li><li> Klik Expanded Mode in het menu Scan Toolbar en stel de parameters: Ramp Size tot tussen 500 nm en 1 urn, Ramp Rate tot 2 Hz, aantal monsters 256, Tip Radius tot 500 nm, Sample Poisson Ratio tot 0,5 (gaat uit van het materiaal te meten is volkomen onsamendrukbaar), Tip Half Hoek op 0, Trigger Mode om Relatieve en Trigger Threshold om tussen 20 en 100 nm. </li><li> Klik Ramp Continue in het menu Ramp Toolbar te OBTAin een krachtenkromme op de plaat (figuur 3A). In deze kracht curve, ingesteld kanaal 1 tot en met afbuiging fout. LET OP: Dit zal de software om de resultaten als verticale afbuiging vs. z positie grafiek. <ol><li> Klik op de links of rechts uiteinden van de kracht curve en sleep de cursor naar een lineaire gebied van de kracht curve (figuur 3A, gestippelde rode lijnen) omvatten. Gebruik deze twee lijnen om de grenzen van de hellende regio te markeren om fit te zijn met een rechte lijn. </li></ol></li><li> Selecteer Ramp in de werkbalk en klik op Update gevoeligheid. Noteer de waarde en herhaal deze stap nog vier keer. Selecteer Calibrate in de werkbalk en klik vervolgens op Detector. Ingang een gemiddelde waarde van vijf metingen in het vak Deflection gevoeligheid. </li><li> Klik Trek 2-3 keer om de AFM hoofd op te tillen. Deze stap is belangrijk ter voorkominginteractie tussen de AFM tip en de plaat tijdens de thermische tune proces. Klik Thermal Stem af op de werkbalk. </li><li> Stel Thermal Tune Bereik van 1 - 100 kHz (Deze informatie kan worden verkregen uit de catalogus van de fabrikant) en de doorbuiging gevoeligheid Correctie op 1.144 voor v-vormige uitkragingen en 1.106 voor rechthoekige uitkragingen. </li><li> In de Thermal Tune menu op Acquire gegevens aan een thermische tune curve (Figuur 3B) te verkrijgen. Met de AFM software plaats rood stippellijnen aan weerszijde van de curve (zie figuur 3B) slepen met de muis van de rand van de grafiek om de grenzen definiëren voor montage. Selecteer de Lorentz (Air) of de eenvoudige harmonische oscillator (Fluid) model, afhankelijk van die beter past bij de data. </li><li> Klik Fit Data, dan berekenen Spring K en sla deze waarde. Opnieuwturf de veerconstante kalibraties meerdere malen en gebruik maken van de gemiddelde waarde. Klik Trek meerdere malen. </li><li> Verwijder de AFM hoofd van de microscoop podium en plaats het op de uitlijning unit. Haal de schotel uit de microscoop podium. </li></ol><img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54630/54630fig3.jpg" /> Figuur 3: AFM Force Curves gebruikt in de kalibratie van de AFM Probes. (A) Een representatief AFM krachtenkromme (a ijkkromme). De extensieportie van de krachtcurve tussen de verticale rode gestreepte lijnen gebruikt om de cantilever doorbuiging gevoeligheid te bepalen. (B) een eenvoudige harmonische oscillator fit grafiek gebruikt om de veerconstante van de cantilever zoals eerder beschreven 20 te berekenen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54630/54630fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.</a> Ex Vivo <ol><li> Plaats de 60-mm cultuur schotel met de aorta weefsel op de microscoop podium, en zet de plaat met de magnetische plaat houder. </li><li> Plaats de AFM hoofd op de microscoop podium. Zorg ervoor dat de AFM sonde niet contact met de aorta maakt maar voorzichtig contact maakt met PBS en vormt een meniscus. Indien nodig, plaats de AFM hoofd op de uitlijning apparaat en klik op Trek totdat er voldoende ruimte om contact te voorkomen, plaats dan de AFM hoofd op de microscoop podium. </li><li> Klik op Navigeren. Met behulp van de joystick of klikken op &#39;Down&#39; pijl, langzaam de AFM sonde naar de cantilever boven de aorta te lokaliseren. Pas de fotodiode positie met behulp van de detector positionering knoppen op de AFM hoofd indien nodig. </li><li> Klik Engage om de cantilever contact met de aorta te maken. </li><li> Zodra deaorta is geactiveerd, ervoor te zorgen dat het piëzo-centrum is stabiel en klik Ramp. Als het piëzo centrum fluctueert, kan dit het gevolg van een onjuiste ingrijping zijn. Trek de sonde en verhoging van de verticale verschuiving van de laser op de fotodiode door kleine stappen (~ 0,5 V) en opnieuw in te schakelen. <ol><li> Ook als de sonde is ver boven het monster oppervlak, handmatig de sonde verlagen dichter bij het monster oppervlak alvorens opnieuw aantrekkelijk. Als de vorige stappen niet de fluctuatie te elimineren, probeer dan het uitwisselen van de sonde. </li></ol></li><li> Stel de Ramp Size tot 3 pm, de Trigger Mode om Relatieve en de Trigger Threshold tot 100 nm en klik Ramp Continuous. Vast dat het contactpunt tussen de probe en het monster plaatsvindt bij ongeveer het midden naar de onderste ¾ van de Z helling cyclus. Als dit niet wordt nageleefd, los te maken van het monster, pas de Ramp grootte als nodig is, en opnieuw deel te nemen van het monster. </li><li>Klik Microscoop in de menubalk en vervolgens Engage instellingen. Verander de SPM Trek tot 30 pm. Klik Ramp Continue in het menu Ramp Toolbar. </li><li> Na het observeren van de kracht curve, klikt u op Opname in de menubalk en vervolgens Capture bestandsnaam. Voer een gewenste bestandsnaam met het einde &quot;0,000&quot; (dit zal toestaan ​​extra vastgelegde bestanden te verhogen in nummer 1). Selecteer een aangewezen-map en de gegevens op te slaan. </li><li> Klik op Capture in het Opnamewerkbalk menu. Klik op te trekken en vervolgens te navigeren. Gebruik de joystick of software bedieningselementen de cantilever stand via een ander gebied van de aorta (naast de eerste meetpunt, zie figuur 4). </li><li> Klik Engage, Ramp en Ramp Continu, respectievelijk. Na het observeren van de kracht curve, klikt u op Stoppen </strong&gt; en vervolgens Capture. </li><li> Herhaal stap 6,9-6,10. Capture ten minste 5 metingen per gebied zoals getoond in Figuur 4 Opmerking: Wij doorgaans laat 15-25 force curves 3-5 verschillende lokaties in elk weefsel zoals getoond in Figuur 4, respectievelijk.. </li></ol><img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54630/54630fig4.jpg" /> . Figuur 4: Beeldverhaal van een Cantilever nadert en inspringen het weefsel (Gebied 1) Dit AFM meting herhaald tot 15-25 keer 3-5 verschillende locaties (gebieden 1-5) in elke slagader om de stijfheid van de totale verwerven weefselmonster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54630/54630fig4large.jpg" target="_blank">klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 7. Data Analysis <ol><li> Open kracht curve analyse software. </li><li> click zoeken en openen in de menubalk, en dubbelklik op een bestand te analyseren. </li><li> Klik op Wijzigen Force Parameters in de werkbalk menu om de doorbuiging gevoeligheid, Spring Constant, Tip Radius, Tip halve hoek en Poisson-ratio te controleren. Het wijzigen van de parameters vink het vakje ernaast en voer de juiste waarden in de nieuwe waarde kolom. Klik vervolgens op Uitvoeren. </li><li> Als kracht curves zijn lawaaierig, klikt Boxcar Filter en stel ingangen voor Direction uit te breiden, Gemiddelde punten tot 3 en Filter Orde 0 Th. Klik op Uitvoeren om de gegevens glad. </li><li> Klik Baseline Correction in de menubalk en stel ingangen voor Direction uit te breiden, Plot Units te dwingen, Type in Separation, Correctie Orde 1 e en uitbreiden Baseline Source </strong&gt; om uit te breiden. Pas de verticale gestippelde blauwe lijnen op het vlakke gedeelte van kracht curve omvatten en klik vervolgens op Uitvoeren. </li><li> Klik Inspringen op de werkbalk menu en stel ingangen voor Active Curve Extended, Fit Method naar Contact Point Based, Contact Point Algoritme als Fit Variable Treat, Inclusief kleefkracht op Nee, Max Force Fit Boundary tot 30%, Min Force Fit Boundary aan 0% en Fit Model voor Hertz (Spherical). LET OP: In onze metingen, was significant hechting tussen de tip en sample (een negatieve uitslag van de cantilever in het terugtrekken curve) zelden waargenomen. In gevallen waarin een dergelijke hechting wordt waargenomen, moet het juiste model (DMT of JKR) worden gebruikt voor analyse 18,19. </li><li> Sla de waarden van de Young&#39;s modulus. Analyseer de Young (elastische) modulus van elk van de 3- 5 delen (5 werking curves per gebied) die op een kleine afstand van elkaar zoals weergegeven in figuur 4. OPMERKING: Om artefacten te verwijderen, uit te sluiten Young&#39;s modulus&gt; 100 kPa (normaal ~ 10% van de totale afmetingen) uit de analyse. </li><li> Berekenen van een gemiddelde Young&#39;s modulus voor elk van de 3-5 gebieden (die zijn gemeten) en deze waarden gebruiken die een gemiddelde elasticiteitsmodulus berekenen van de aorta als geheel. OPMERKING: Minimaal 3 vaker 4-6 afzonderlijke aorta&#39;s worden gebruikt voor een accurate bepaling van arteriële stijfheid te verkrijgen. De uiteindelijke resultaten zijn weergegeven als gemiddelde + SEM van &quot;n&quot; onafhankelijke experimenten. Het exacte aantal benodigde aorta zal uiteraard afhangen van de mate van nauwkeurigheid. </li></ol>

<ol><li>Kothapalli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+Protection+by+ApoE+and+ApoE-HDL+Linked+to+Suppression+of+ECM+Gene+Expression+and+Arterial+Stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening.</a> Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).</li>
<li>Liu, S. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-12+is+an+essential+mediator+of+acute+and+chronic+arterial+stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening.</a> Sci Rep. 5, 17189(2015).</li>
<li>Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+arterial+aging+and+the+epidemic+of+systolic+hypertension+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis.</a> J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).</li>
<li>Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+in+diabetes+and+the+metabolic+syndrome%3A+a+pathway+to+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease.</a> Diabetologia. 51, 527-539 (2008).</li>
<li>Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Stiffness+and+Increased+Pulse+Pressure+in+the+Aging+Cardiovascular+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System.</a> Cardiol Res Pract. 2011, 263585(2011).</li>
<li>Duprez, D. A., Cohn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+as+a+risk+factor+for+coronary+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis.</a> Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).</li>
<li>Mitchell, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+Stiffness+and+Cardiovascular+Events%3A+The+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study.</a> Circulation. 121, 505-511 (2010).</li>
<li>Sutton-Tyrrell, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Aortic+Pulse+Wave+Velocity%2C+a+Marker+of+Arterial+Stiffness%2C+Predicts+Cardiovascular+Events+in+Well-Functioning+Older+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults.</a> Circulation. 111, 3384-3390 (2005).</li>
<li>Klein, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Cycle+Control+by+Physiological+Matrix+Elasticity+and+In+Vivo+Tissue+Stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening.</a> Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).</li>
<li>Bae, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FAK-Cas-Rac-lamellipodin+signaling+module+transduces+extracellular+matrix+stiffness+into+mechanosensitive+cell+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+signal%22%5BJournal%5D)">A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling.</a> Sci signal. 7, ra57(2014).</li>
<li>Thyberg, J., Hedin, U., Sjölund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+differentiated+properties+and+proliferation+of+arterial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).</li>
<li>Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Regulation+of+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+in+Development+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Development and Disease.</a> Physiol Rev. 84, 767-801 (2004).</li>
<li>Huynh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Intimal+Stiffening+Enhances+Endothelial+Permeability+and+Leukocyte+Transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration.</a> Sci Transl Med. 3, 112ra122(2011).</li>
<li>Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Perspectives+on+Arterial+Stiffness+and+Pulse+Pressure+in+Hypertension+and+Cardiovascular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases.</a> Circulation. 107, 2864-2869 (2003).</li>
<li>Raffetto, J. D., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+vascular+remodeling+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease.</a> Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).</li>
<li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).</li>
<li>Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E3+Inhibits+Rho+to+Regulate+the+Mechanosensitive+Expression+of+Cox2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2.</a> PLoS ONE. 10, e0128974(2015).</li>
<li>Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Energy+and+the+Contact+of+Elastic+Solids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+A%22%5BJournal%5D)">Surface Energy and the Contact of Elastic Solids.</a> Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).</li>
<li>Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+contact+deformations+on+the+adhesion+of+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of contact deformations on the adhesion of particles.</a> J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).</li>
<li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+atomic-force+microscope+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Rev Sci Instrum. 64, 1868-1873 (1993).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+surface+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch+EJP%22%5BJournal%5D)">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).</li>
<li>Pogoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth-sensing+analysis+of+cytoskeleton+organization+based+on+AFM+data%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data.</a> Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).</li>
<li>Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+Enhances+Cell+Elastic+Behavior+and+Protects+against+Compressive+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress.</a> Biophys J. 107, 314-323 (2014).</li>
<li>Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco,, Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+relaxation+and+creep+on+living+cells+with+the+atomic+force+microscope%3A+a+means+to+calculate+elastic+moduli+and+viscosities+of+cell+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components.</a> Nanotechnology. 21, 445101(2010).</li>
<li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts%2C+chondrocytes%2C+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> J Biomech. 41, 454-464 (2008).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Elastic+Moduli+of+Thin+Layers+of+Soft+Material+Using+the+Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope.</a> Biophys J. 82, 2798-2810 (2002).</li>
<li>Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Käs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Probe-Based+Frequency-Dependent+Microrheology+of+Polymer+Gels+and+Biological+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Scanning Probe-Based Frequency-Dependent Microrheology of Polymer Gels and Biological Cells.</a> Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).</li>
<li>Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Testing+of+Mouse+Carotid+Arteries%3A+from+Newborn+to+Adult%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult.</a> J Vis Exp. , e3733(2012).</li>
<li>Laurent, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+document+on+arterial+stiffness%3A+methodological+issues+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications.</a> Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).</li>
<li>Plodinec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nanomechanical+signature+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">The nanomechanical signature of breast cancer.</a> Nat Nano. 7, 757-765 (2012).</li>
<li>Raman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nanomechanical+properties+of+live+cells+using+multi-harmonic+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy.</a> Nat Nano. 6, 809-814 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

AFM inspringing kan worden gebruikt om de stijfheid (elasticiteitsmodulus) van cellen en weefsels te karakteriseren. In dit document, bieden we uitvoerige stap-voor-stap protocollen de afdalende aorta en de aortaboog in de muis isoleren en bepalen de elastische moduli van deze slagaderlijke gebieden ex vivo. We hebben nu samen te vatten en bespreken de technische problemen en beperkingen van de in dit artikel beschreven methode. Verschillende technische problemen kunnen voordoen in ...

De biomechanische eigenschappen van slagaders zijn een cruciale determinant bij hart- en vaatziekten (CVD) en veroudering. Arteriële stijfheid, een belangrijke cholesterolonafhankelijke risicofactor en een indicator voor de progressie van CVD, neemt toe met vasculaire letsels, atherosclerose, leeftijd en diabetes1-8. Verstijfing van de arteriële wand is geassocieerd met verhoogde dedifferentiatie, migratie en proliferatie van vasculaire gladde spiercellen9-12. Bovendien is verhoogde arteriële stijfheid gekoppeld aan verhoogde macrofaagenhechting1, endotheliale permeabiliteit en leukocytentransmigratie13, en hermodellering van de vaatwand14,15. Dus, therapieën die arteriële verstijving bij CVD of veroudering kunnen voorkomen, zouden de beschikbare farmacologische interventies die CVD behandelen door het verlagen van het hoge cholesterolgehalte in het bloed kunnen aanvullen.
AFM is een krachtig analytisch hulpmiddel dat wordt gebruikt voor verschillende fysische en biologische toepassingen. AFM wordt steeds vaker gebruikt om afbeeldingen met hoge resolutie te verkrijgen en de biomechanische eigenschappen van zachte biologische monsters zoals weefsels en cellen1,2,10,16,17 met een grote mate van nauwkeurigheid op nanoschaal te karakteriseren. Een groot voordeel van AFM is het feit dat het kan worden gebruikt met levende cellen.
Dit artikel beschrijft onze methode voor het meten van de elastische modulus van muizenslagaders ex vivo met behulp van AFM. De beschreven methode laat zien hoe we 1) muizenslagaders (dalende aorta en aortaboog) correct isoleren en 2) de elastische modulus van deze weefsels meten met behulp van AFM. Metingen van onbelaste elastische modulus in slagaders kunnen helpen om veranderingen in de extracellulaire matrix (ECM) die optreden als reactie op vasculaire letsels, CVD en veroudering te verduidelijken.

<table><tbody><tr><td>BioScope Catalyst AFM system</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE 200 inverted microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon nitride AFM probe</td><td>Novascan Technologies</td><td>PT.SI02.SN.1</td><td>0.06 N/m cantilever; 1 &micro;m SiO2 particle</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Zie sectie 1.4</td></tr><tr><td>Dumont #5SF forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Zie sectie 1.8</td></tr><tr><td>Fine Scissors-ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Zie sectie 1.4 (middelgroot)</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml;bingen spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15008-08</td><td>Zie sectie 1.6 (klein)</td></tr><tr><td>60 mm TC-treated cell culture dish</td><td>Corning</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>Zonder calcium en magnesium</td></tr><tr><td>Krazy Glue instant all purpose liquid</td><td>Krazy Glue</td><td>KG58548R</td><td>Zie sectie 2.2</td></tr><tr><td>Gel-loading tips, 1 - 200 &micro;l</td><td>Fisher</td><td>02-707-139</td><td>Zie sectie 2.2</td></tr><tr><td>Tip Tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>78092-CP</td><td>Zie sectie 3.2</td></tr><tr><td>50-mm, clear wall glass bottom dishes</td><td>TED PELLA</td><td>14027-20</td><td>Zie sectie 4.4</td></tr></tbody></table>

meten van de stijfheid van<em&gt; ex vivo</em&gt; mouse aorta&#39;s met behulp van atomic force microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arteriële verstijving is een belangrijke risicofactor en biomarker voor cardiovasculaire ziekte en een kenmerk van veroudering. Atomic force microscopie (AFM) is een veelzijdig analytisch hulpmiddel voor het karakteriseren viscoelastische mechanische eigenschappen voor verschillende materialen, variërend van harde (plastic, glas, metaal, enz.) Oppervlakken van cellen op een substraat. Het is wijd gebruikt om de stijfheid van de cellen te meten, maar minder vaak gebruikt om de stijfheid van de aorta meten. In dit artikel zullen we de procedures voor het gebruik van AFM in contact modus om de ex vivo elasticiteitsmodulus van onbelaste muis slagaders te meten te beschrijven. We beschrijven onze procedure voor het isoleren van de muis aorta, en vervolgens gedetailleerde informatie voor de AFM analyse. Dit omvat stap-voor-stap instructies voor het richten van de laserbundel, kalibratie van de veerconstante en de doorbuiging gevoeligheid van de AFM sonde, en verkrijging van kracht curves. We bieden ook een gedetailleerd protocol voor data analysis van de kracht curves.

<html> Figuur 5A toont een fase contrast beeld van de dalende (thoracale) aorta van een 6 maanden oude mannelijke C57BL / 6 muis. De AFM cantilever is op zijn plaats direct boven het weefsel en klaar voor inspringen. Figuren 5B en 5C tonen representatieve kracht curves verkregen door AFM inkeping in contact mode. Groene lijnen getoond in figuren 5B en 5C geven de best passende curves verkregen met de Hertz model van een bol. In f...

We presenteren gedetailleerde protocollen voor het isoleren van aorta's uit muizen en het meten van hun elastische modulus met behulp van atoomkrachtmicroscopie.

Meten van de stijfheid van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorta&#39;s met behulp van Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Het algemene doel van dit protocol is het beschrijven van de procedures voor het gebruik van Atomic Force Microscopy om de ex vivo elastische modulus van muis aorta's te meten. Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de vasculaire biomechanica en ziektebeelden, zoals hart- en vaatziekten en veroudering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat AFM de biomechanische eigenschappen van zachte biologische monsters, zoals arteriën en cellen, met een hoge mate van nauwkeurigheid op nanoschaalniveau kan karakteriseren.Ik zal de AFM-procedures presenteren, en Dr. Shu-lin Liu, een onderzoeker uit ons laboratorium, zal laten zien hoe muis-aorta's worden geïsoleerd. Begin met het euthanaseren van een muis en ontleed deze tot aan de aorta, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Pak met een klein pincet het vet rondom de aorta vast en gebruik een kleine schaar om het vet rond de aorta voorzichtig weg te knippen.Pak vervolgens de aorta voorzichtig vast met een pincet en maak één incisie door het vat aan het begin van de aorta ascendens en een tweede incisie aan het einde van de aorta descendens, net boven de aorta abdominalis. Breng de gedisseceerde aorta over naar een schaal van 60 millimeter met PBS zonder calcium of magnesium. Verwijder in de schaal al het resterende vetweefsel van de aorta en open de aorta vervolgens in de lengterichting.Snijd vervolgens een stukje van 2 millimeter bij 4 millimeter uit de descenderende aorta en een stukje van dezelfde afmeting uit de aortaboog voor analyse met de Atomic Force Microscope. Plaats deze weefselstukjes in een schone plastic schaal van 60 millimeter en houd ze vochtig in een druppel PBS. Verwijder voorzichtig de PBS rondom het weefsel met een laboratoriumdoekje zonder de aorta aan te raken.Zorg ervoor dat de luminale zijde van het weefsel naar boven is gericht en gebruik vijf tot 10 µL cyanoacrylaatlijm om elk uiteinde van de geopende aorta voorzichtig op de plaat te lijmen. Het is essentieel dat de aorta tijdens dit proces niet wordt uitgerekt. Controleer na afloop of de gelijmde aorta niet is gevouwen of drijft.Nadat de lijm op de aorta 30 tot 60 seconden aan de lucht is gedroogd, wordt er voorzichtig PBS toegevoegd om het monster onder te dompelen. Schuif met een pincet een siliconitride AFM-probe met een bolvormige tip op de probehouder. Bevestig vervolgens de probehouder stevig aan de ZScanner-houder van de AFM-kop.Open vervolgens de AFM-software. Kies het type experiment door naar Experiment Category te gaan en Contact Mode te selecteren. Ga daarna naar Experiment Group en selecteer Contact Mode in Fluid, en ga tot slot naar Experiment en selecteer Contact Mode in Fluid.Zodra deze zijn geselecteerd, klikt u op Load Experiment. Hiermee wordt de laser ingeschakeld. Bereid vervolgens een monster voor om de laser uit te lijnen, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Plaats het monster op de AFM. Positioneer de laserstraal op de punt van de AFM-probe door de knoppen voor de laserpositionering aan te passen. Gebruik vervolgens de knoppen voor de detectorpositionering om de positie van de fotodiode aan te passen totdat de waarden voor de verticale afbuiging tussen nul en min één volt liggen en de horizontale afbuiging dicht bij nul volt ligt.Controleer vervolgens of het Sum Signal van de laser is gemaximaliseerd. Pas indien nodig de positie van de laserstraal op de AFM-tip en de positie van de fotodiode aan om het maximale somsignaal te verkrijgen. Selecteer om met de kalibratie te beginnen 'check parameters' en stel de parameter voor Scan Size in op nul.Stel de scansnelheid in op 1 Hz. Stel de Sample/Line in op 256 en het deflection setpoint op 20 nm. Selecteer vervolgens Engage.Zodra de probe contact maakt met het oppervlak van de plaat, klikt u op Ramp. Selecteer vervolgens de uitgebreide modus in het menu van de scantoolbalk en stel de parameters in zoals hier wordt getoond. Selecteer in de ramp-toolbalk 'ramp continuus' en verkrijg een krachtcurve op de plaat.Stel bij deze krachtcurve Kanaal 1 in op Deflection Error, zodat de software de resultaten kan weergeven als verticale afbuiging tegenover de Z-positie. Klik op de linker- of rechterkant van de krachtcurve en sleep de cursor om een lineair gebied van de krachtcurve te selecteren dat met de rechte lijn zal worden gefit. Selecteer vervolgens Ramp in de werkbalk en klik op Update Sensitivity.Noteer de huidige waarde. Selecteer vervolgens Calibreren en klik op Detector. Voer de gemiddelde waarde van de vijf metingen in het vak Deflectiegevoeligheid in.Klik twee tot drie keer op Withdraw om de AFM-kop op te tillen en interactie tussen de AFM-tip en de plaat tijdens het thermal tune-proces te voorkomen. Klik vervolgens op Thermal Tune in de werkbalk. Stel het Thermal Tune-bereik in op een waarde tussen 1 en 100 kilohertz, en stel de Deflection Sensitivity Correction in op 1,144 voor V-vormige cantilevers en 1,166 voor rechthoekige cantilevers.Klik in het menu Thermal Tune op Acquire Data om een thermische tune-curve te verkrijgen. Plaats vervolgens rode streepjes aan weerszijden van de curve en selecteer het Lorentzian-model of het model van de simpele harmonische oscillator, afhankelijk van welk model het beste bij de gegevens past. Klik daarna op Fit Data en selecteer Calculate Spring K om deze waarde op te slaan.Plaats een kweekschaal van 60 millimeter met het aortaweefsel op de microscooptafel en bevestig de schaal met de magnetische platenhouder. Zodra de aorta is gekoppeld aan de cantilever, dient u te controleren of het piëzocentrum stabiel is en vervolgens op Ramp te klikken. Stel de Ramp-grootte in op 3 µm, de trigger-modus op Relatief en de triggerdrempel op 100 nm.Select vervolgens 'ramp continuous'. Let erop dat het contactpunt tussen de probe en het monster zich bevindt op ongeveer het centrum tot de onderste drie kwarten van de Z-rampcyclus. Als dit niet wordt waargenomen, maak dan contact met het monster los, pas de rampgrootte naar behoefte aan en maak opnieuw contact met het monster.Klik vervolgens op Microscope in de menubalk en selecteer Engage Settings. Wijzig de SPM withdraw naar 30 micrometers en klik daarna op OK. Nadat de krachtcurve is geobserveerd, klikt u op Capture in de menubalk en selecteert u Capture Filename. Voer een gewenste bestandsnaam in die eindigt op OOO, selecteer een aangewezen map en sla de gegevens op.Om de analyse te starten, opent u de software voor force-curve-analyse, laadt u het te analyseren bestand en wijzigt en gladt u de gegevens af zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Selecteer vervolgens Baseline Correction in de menubalk en stel de invoerwaarden in zoals hier weergegeven. Pas daarna de verticale gestippelde blauwe lijn op de grafiek aan zodat deze het vlakke gedeelte van de force-curve omvat en klik op Execute.Klik vervolgens op Indentation in het menubalkmenu en stel de invoerwaarden in zoals hier getoond. Sla deze waarden op en analyseer de Young-modulus van elk van de gebieden van belang door vijf krachtcurven per gebied te meten die binnen een kleine afstand van elkaar worden genomen. Om de totale stijfheid van het weefselmonster te bepalen, moeten er tot 25 metingen worden verricht over vijf verschillende regio's van het monstergebied binnen het weefsel.Deze gebieden kunnen worden gebruikt om weefsel op verschillende locaties te vergelijken, zoals de aortaboog en de descenderende aorta. In deze grafieken worden representatieve krachtcurves van de descenderende aorta en de aortaboog getoond uit hetzelfde monster van een muis-aorta. Op basis van deze gegevens kan de elasticiteitsmodulus voor elke groep worden berekend en gebruikt worden om verschillende regio's of condities met elkaar te vergelijken.Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u de aorta van een muis correct isoleert en de elastische modulus meet met Atomic Force Microscopy. Na het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de AFM-meting onmiddellijk na de isolatie van het weefsel moet worden uitgevoerd. Zodra de techniek beheerst is, kan de isolatie van aorta's in ongeveer 45 minuten per muis worden voltooid, en de AFM-meting en analyse kan in anderhalf uur worden afgerond, mits dit correct wordt uitgevoerd.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunofluorescentie of proliferatie-assays, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot vasculaire remodellering of de proliferatie van vasculaire gladde spiercellen.

measuring-stiffness-ex-vivo-mouse-aortas-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De stijfheid van de extracellulaire matrix van grote invloed op meerdere gedragingen van hechtende cellen. Matrix stijfheid varieert ruimtelijk overal een weefsel, en ondergaat wijzigingen in de verschillende aandoeningen. Hier hebben we methoden ontwikkelen om de ruimtelijke variatie in stijfheid in normale en fibrotische muis longweefsel met behulp van atomic force microscopie microindentation karakteriseren.

Micro-mechanische karakterisatie van Lung weefsel met behulp van Atomic Force Microscopy

Hier beschrijven we de isolatie van volwassen muis cardiomyoctyes met behulp van een Langendorff perfusie-systeem. De resulterende cellen Ca2 +-tolerante, elektrisch rustende en kan gekweekt en getransfecteerd met adeno-of lentivirussen om genexpressie te manipuleren. Hun functionaliteit kan ook worden geanalyseerd met behulp van het MMSYS systeem en patch clamp technieken.

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

Deze paper toont een protocol om de mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren door middel van microindentation gebruik van een Atomic Force Microscope (AFM).

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

We beschrijven een techniek voor het meten van de aortica-stijfheid uit zijn druk-diameter relatie in vivo bij muizen. De diameter van de aorta wordt geregistreerd door middel van echografie en de aortadruk wordt invasief gemeten met een solid-state drukkatheter. De bloeddruk wordt incrementeel gewijzigd en de resulterende diameter wordt gemeten.

Meten Oplopend stijfheid van de aorta In Vivo In Muizen met behulp van echografie

Het huidige protocol beschrijft de concepten en technische toepassing van de tensometrische myograaftechniek met behulp van een meerkamermyograafsysteem in de experimentele ex vivo beoordeling van de aorta-endotheelfunctie van muizen.

Meting van endotheelafhankelijke vasorelaxatie in de thoracale aorta van de muis met behulp van tensometrische kamermyografie met klein volume

We presenteren een protocol om de elastische moduli van collageenrijke gebieden in normale en zieke lever te meten met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Het gelijktijdige gebruik van polarisatiemicroscopie biedt een hoge ruimtelijke precisie voor het lokaliseren van collageenrijke gebieden in de leversecties.

Meting van leverstijfheid met behulp van atomic force microscopie in combinatie met polarisatiemicroscopie

We hebben onlangs retinale capillaire verstijving geïdentificeerd als een nieuw paradigma voor retinale disfunctie geassocieerd met diabetes. Dit protocol werkt de stappen uit voor de isolatie van de retinale capillairen van muizen en de subendotheelmatrix uit retinale endotheelculturen, gevolgd door een beschrijving van de stijfheidsmeettechniek met behulp van atoomkrachtmicroscopie.

Isolatie van de retinale capillairen en subendotheliale matrix van muizen voor stijfheidsmeting met behulp van atoomkrachtmicroscopie

In dit protocol laten we zien hoe axolotlweefsel kan worden voorbereid op atoomkrachtmicroscopie (AFM) en hoe indrukmetingen kunnen worden uitgevoerd in intact en regenererend kraakbeen van ledematen.

Atoomkrachtmicroscopie Metingen van kraakbeen in intacte en regenererende axolotl-ledematen

Dit protocol visualiseert hoe cryosecties van muizenlongweefsel moeten worden voorbereid, experimenten met atoomkrachtmicroscopiekaarten kunnen worden uitgevoerd en de gegevens moeten worden geanalyseerd om Young's modulus van het inheemse muizenlongbasaalmembraan te bepalen.

Extractie van de Young's Modulus van inheemse muizen pulmonale basaalmembranen uit door atoomkrachtmicroscopie afgeleide krachtkaarten

We presenteren een protocol voor het buigen van draadvormige bacteriële cellen bevestigd aan een cover-slip oppervlak met een optische val van de cellulaire buigstijfheid te meten.

Het meten van de buigstijfheid van de bacteriële cellen Met behulp van een optische val

Leer hoe u de elasticiteitsmodulus van muizenaorta's ex vivo meet met Atomic Force Microscopy. Deze methode biedt inzicht in vasculaire biomechanica en cardiovasculaire ziekten.

Meten van de stijfheid van

Meer video's verkennen