Name: Empirische, Metagenomic en computationele technieken verlichten de mechanismen door welke fungiciden compromis Bee gezondheid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Ontdek hoe fungiciden de gezondheid van hommelkoloniën beïnvloeden door microbiële symbiosen in stuifmeel te verstoren. Deze methode combineert veldexperimenten en metagenomische analyse om bijendemografie en microbiële gemeenschappen te onderzoeken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteur (s) bedanken de Universiteit van Wisconsin biotechnologie Center DNA Sequencing faciliteit voor het verstrekken van versterking en sequencing faciliteiten en diensten, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto en Max Haase voor het verlenen van technische bijstand met moleculaire analyse. Dit werk werd gesteund door de USDA-agrarische zoekservice uitgetrokken middelen (huidige Research Information System #3655-21220-001). Verdere steun werd voorzien door de National Science Foundation (onder Grant nr. DEB-1442148), het DOE grote meren bio-energie Research Center (DOE Office van wetenschap BER DE-FC02-07ER64494), en de USDA nationale Instituut voor voeding en landbouw (Hatch project 1003258). C.T.H. is een geleerde van de Pew in de Biomedische Wetenschappen en een Alfred Toepfer faculteit Fellow, ondersteund door de Pew Charitable Trusts en de Alexander von Humboldt Foundation, respectievelijk.

1. onderzoeken van het Effect van Fungicide blootstelling op de Bumble Bee kolonie succes met behulp van veld kooi experimenten <ol><li>Set van tien mesh kooien in een veld beplant met haver. Graven van een greppel rond elke kooi, en alle vier randen van de mesh-kooi graven in de grond om ervoor te zorgen dat de bijen niet kunnen ontsnappen. Voorraad van de kooien met, bloeiende potplanten waarvan bekend is dat aantrekkelijk voor bijen (bijvoorbeeld boekweit, bernagie, alyssum, kosmos en zonnebloemen) ( Figuur 2).</li>
	<li>Vormen een aanvulling van de kooien met een enkele lade (36 x 42 cm) van in-bloei klaver. Floral clusterbronnen binnen een van de hoeken van de kooi, een ruimte van ongeveer 2.5 m x 1 m. Vegetate de resterende kooioppervlakte te bezetten door de haver.</li>
	<li>Willekeurig toewijzen de bumble bee kolonies, elk met werknemers en een enkele koningin, een behandeling (fungicide heden/afwezig, N = 5 kolonies per behandeling, 10 kolonies totale), plaats ze binnen de kooi van een veld (N = 1/kooi) 29 dagen (23 juni -21 juli 2014).</li>
	<li>Oriënteren de kolonie vakken zodanig dat de kolonie &#39; s openingen wijst naar het zuiden tot de bijen voorzien optimale navigatie omstandigheden. Het subsidiëren van de kolonies met suiker water blazen, geplaatst in de vakken van de component te vullen nectar beschikbaarheid.</li>
	<li>Toepassen chloorthalonil gebaseerde fungicide op een veld-relevante niveau (20 g/L) voor bloeiende planten in de vijf fungicide behandeling kooien, met behulp van een hand gehouden pesticiden sproeien, tweemaal tijdens de studie (dag 0 en 13). De bloemen uniform jas zodanig dat geen verdere vloeistof aan floral oppervlakken ( Figuur 3 voldoet).</li>
	<li>Aan het einde van de studie van de kooi veld, met de hand verwijderen van de kolonies van B. impatiens van de kooien, de kasten door te plaatsen in de vriezer -20 ° C gedurende 20 minuten afkoelen</li>
	<li>Verwijderen van bijen steriel pincet gebruiken en registreren het aantal larven, poppen, volwassen vrouwtjes (Ik. e. foragers), en volwassen mannetjes. De droog-gewicht van de moeder koningin, larven, poppen, volwassen vrouwtjes (d.w.z. foragers) en volwassen mannetjes met behulp van een analytische balans opnemen.</li>
</ol> 2. Onderzoeken van de effecten van Fungicide blootstelling op microbiële gemeenschappen in de stuifmeel-bepalingen van In Vivo proeven Bumble Bee nesten met behulp van laboratorium op basis <ol><li>Pulverize commercieel gekocht stuifmeel tot een fijn poeder met behulp van een standaard laboratorium bal-molen. Steriliseren poedervorm stuifmeel in onderdompelen in 70% ethanol, waardoor het te verdampen 's nachts onder UV-licht. Controleert u de steriliteit van stuifmeel van plating ~0.5 mg op algemene agarmedia.
	<ol><li>Aan de droge, gesteriliseerde stuifmeel, met behulp van gesteriliseerde pipetten, toevoegen veld relevante dosering van fungicide: propiconazool op 14,3%; azoxystrobin 22,9% voor behandelingen (0.74 µL en 0,65 µL respectievelijk / dag / component). Meng goed met behulp van gesteriliseerde houten stokken.</li>
	</ol></li> <li>Plaats 6 experimentele netelroos (n = 3 voor controle en behandeling) in een schone, hygiënische laboratorium benchtop op kamer temperatuur gehouden. Elke dag Weeg 4,27 g van stuifmeel 34 , 35 gemengd met fungiciden (voor behandelingen) of steriel water (voor het besturingselement) binnen een kap met behulp van standaard aseptische techniek.
	<ol><li>Met behulp van de deuren van de val geboden door de kant van de kartonnen doos bijvoeging van de bijenkasten, voeren het stuifmeel in de kasten. Een aanvulling op de kasten met gesteriliseerde suikeroplossing elke week. Blijven voeden regime voor vier weken.</li>
	</ol></li> <li>Bij de conclusie van de studie lab gebaseerde, cool de kasten door te plaatsen in de vriezer-20 ° C gedurende 20 minuten Scrape uit de stuifmeel-bepalingen binnen brood kamers met behulp van gesteriliseerde pincet en spatels en plaats in steriele opslag buizen. Winkel bij-80 ° C. graaf en record het gewicht van de werknemers en de koningin-moeder aan het begin en einde van het experiment (stap 1.7).</li>
	<li>DNA uit stuifmeel-bepaling monster met behulp van commercieel verkrijgbare DNA isolatie isoleren kits (Zie materialen tabel voor details).
	<ol><li>Toevoegen 0,25 g van stuifmeel-bepaling met de aardgaswinning buizen, kort vortex te mengen.</li>
		<li>Maak een 200 mg/mL lysozym oplossing in gedeïoniseerd gedestilleerd water, genoeg voor 50 µL/monster. Schud krachtig om volledig formulieroplossing.</li>
		<li>50 µL van de lysozym oplossing toevoegen aan de extractie buizen met monster in het, en meng goed door meerdere malen omkeren. Incubeer de buis gedurende 10 minuten bij 37 ° C in een waterbad. Als neerslag heeft gevormd, Verwarm de oplossing tot 60 ° C tot vóór gebruik opgelost.</li>
		<li>Toevoegen 70 µL van lysis van de waterige oplossing voor extractie buizen, veilige horizontaal op een flatbed vortex pad met tape, en vortex voor 10 min. Centrifuge buizen bij 10.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Het supernatant overbrengen in een schone 2 mL collectie buis. Voeg 250 µL van eiwit neerslag oplossing en vortex voor 5 s. Incubate bij 4 ° C gedurende 5 minuten in een ijsbad. 
		Opmerking: Verwacht tussen 400 µL tot 500 µL van bovendrijvende substantie. Supernatant kan nog steeds sommige deeltjes bevatten.</li>
		<li>De buizen bij kamertemperatuur voor 1 min bij 10.000 x g centrifugeren en maximaal 600 µL van supernatans overbrengen in een schone 2 mL collectie buis. Voeg 200 µL van waterige remmer verwijdering oplossing, vortex kort, en Incubeer bij 4 ° C gedurende 5 min. Centrifuge de buizen bij kamertemperatuur voor 1 min op 10.000 x g. Pipetteer tot 750 µL van de bovendrijvende substantie in een tube van de verzameling schone 2 mL.</li>
		<li>Toevoegen 1200 µL van waterige bind oplossing voor de bovendrijvende substantie, en vortex voor 5 s. laden ongeveer 675 µL van het supernatant op een spin filter, en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Negeren van de stroom door.</li>
		<li>Herhaal 2.4.7. tweemaal. 
		Let op: Een totaal van drie lasten voor elk monster verwerkt zijn verplicht.</li>
		<li>Voeg toe 500 µL ethanol en centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 30 s bij 10.000 x g. negeren van de stroom door, en Centrifugeer nogmaals bij kamertemperatuur voor 1 min op 10.000 x g. plaats spin filter in een tube van de verzameling schone 2 mL.</li>
		<li>Voeg 100 µL van elutie buffer naar het midden van het membraan filter. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 30 s bij 10.000 x g. negeren de filter van de draai. Winkel verzamelde DNA tussen-20 ° C en -80 ° C</li></ol></li> <li>gebruik geïsoleerd DNA voor het rangschikken.
	<ol><li>Quantify, en geïsoleerde DNA naar 2 ng/µL normaliseren door fluorimetrische analyses.
		<ol><li>Voorbereiden reacties in drievoud voor elk uitgepakte monster om de relatieve hoeveelheden van 28 te vergelijken (plant), analyseren zijn (schimmel), en de (bacteriële) onderdelen 16S van elke stuifmeel-bepaling monster 36. Ervoor zorgen dat elke reactie 10 bevat ng van totale DNA, 2 x voor asymmetrische cyanine kleurstof gebaseerd master mix en 2.5 µL van voorwaartse en omgekeerde inleidingen paren 28KJ/28B 37 voor plant- en ITS1/ITS5.8R voor schimmel DNA 38 .</li>
		</ol></li> <li>Versterken DNA met de volgende parameters: pre denaturatie van de 2 min bij 50 ° C, de eerste denaturatie 2 min bij 95 ° C, 40 cycli van (15 s bij 98 ° C, 15 bij 58 ° C, 60 s s bij 72 ° C), gevolgd door een curve smelt.</li>
		<li>Bereiden een 2-step, geneste PCR protocol met behulp van de volgende generatie sequencing bibliotheken gericht op het 16S rRNA V3/V4 variabele regio en ITS / 5.8s rRNA spacer regio.
		<ol><li>Toevoegen 12,5 µL van DNA tot en met 5 pmol van elke primer en 2 x master mix. Maak aparte reacties voor elke regio (16S of ITS; Zie tabel 1). Wijzigen regio specifieke primers als eerder beschreven 39 ,, 40 sequencer-specifieke adapter overstek nucleotidesequenties toevoegen aan de gen-specifieke opeenvolgingen.</li>
			<li>Uitvoeren van eerste versterking met behulp van de volgende parameters: 3 min eerste denaturatie bij 95 ° C, 25 cycli van (30 s bij 95 ° C, 30 bij 55 ° C, 30 s s bij 72 ° C), de laatste uitbreiding van de 5 minuten op 72 ° C.</li>
			<li>Volgende eerste amplificatie, Controleer of bibliotheek grootte en hoeveelheid door elektroforetische mobiliteit en schoon met een 1 x volume vaste fase omkeerbare immobilization kralen om resterende inleidingen en reactie reagentia te verwijderen. Zwembad 16S en haar waarbij kwantitatief over in een enkele amplicon-adresgroep voor elk monster maken.</li>
			<li>Toevoegen van sequencer specifieke adapters en proef van de specifieke dual indexen met behulp van de volgende inleidingen (Zie tabel 1). 2.5 µL van versterkte DNA aan 5 pmol van elke primer en 2 x master mix toevoegen. Uitvoeren van versterking van de bibliotheek met behulp van de volgende parameters: 3 min eerste denaturatie bij 95 ° C, 8 cycli van (30 s bij 95 ° C, 30 bij 55 ° C, 30 s s bij 72 ° C), de laatste uitbreiding van de 5 minuten op 72 ° C.</li>
		</ol></li> <li>Volgende PCR, schoon afgewerkte bibliotheken met behulp van een 1 x volume van vaste fase omkeerbare immobilisatie parels. Beoordelen van de kwaliteit en kwantiteit van de afgewerkte bibliotheken met elektroforetische mobiliteit en fluorometry, respectievelijk. Standaardiseren van bibliotheken tot 2 µM en zwembad vóór sequencing.</li>
		<li>Volgende-generatie sequencing uitvoeren op een platform analoog aan de adapters die zijn toegevoegd in de secundaire PCR, met een passende lengte ter dekking van de gehele amplicon 41.</li>
	</ol></li> <li>Volgnummer annotatie en microbiële samenstelling analyse.
	<ol><li>Combineren paar-sequencing endgegevens (R1 en R2) in één contigs voor alle gesequenceerd bibliotheken. Na het samenvoegen van zowel R1 en R2 bestanden, ontstaat een enkele fasta bestand voor elk van de bibliotheken. 
		Opmerking: Deze stap en de processen die hieronder worden beschreven (tenzij anders vermeld) worden uitgevoerd in Mothur versie 1.38.0 38.</li>
		<li>Scherm elk bestand fasta Schakel dubbelzinnig bases, onverwachte lange sequenties, en lange homopolymeren. 
		Opmerking: De parameters voor screening, en verwijdering van de reeks zijn maxambig = 0, maxlength = 600, en maxhomop = 8 voor beide genen. Verwijderen van identieke sequenties, maar houden een contingence tabel afzonderlijk voor alle bibliotheken (alias graaf tabel in Mothur).</li>
		<li>Uitlijnen unieke reeksen van de bibliotheek van de gene 16S tegen de SILVA databaseversie 123, en de bibliotheek ITS gen tegen de verenigen zijn database 42. 
		Opmerking: Sequenties moeten worden aantekeningen van het Koninkrijk niveau naar het niveau van het geslacht.
		<ol><li>Vervolgens cluster sequenties uitgelijnd met de functie pre.cluster met behulp van diff = 5, en verwijderen van chimaera.</li>
		</ol></li> <li>Classificeren sequenties met behulp van de methode Wang 43 gebaseerd op de SILVA (voor gene 16S) en de ITS verenigen (voor gene ITS) taxonomie bestanden (cutoff waarde van 80%).</li>
		<li>Laden in R 44 de tabellen van de contingence (één per gene) gegenereerd tijdens het classificatieproces in Mothur. Op elk taxonomische niveau, het verkrijgen van relatieve overvloed per bibliotheek voor verdere analyse van microbiële gemeenschap veranderingen. 
		Opmerking: Op elk taxonomische niveau worden samengevoegd taxonomische groepen als relatieve overvloed minder dan 2% voor alle herhalingen van de experimentele is.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Onderzoek naar de effecten van fungiciden op de gezondheid van de bijen zijn een understudied aspect van strategieën voor het beheer van pest gebleven. Onze studie streeft naar het overbruggen van deze kennis met behulp van een suite van complementaire technieken die expliciet het isoleren van de potentiële factoren rijden bee dalingen. De planning, beweegredenen en weergave van deze experimenten zijn hieronder.
Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat geen bijen zijn toegestaan om te ontsnap...

Beheerd en wilde bijen soorten ondervindt wijdverbreide dalingen, met grote gevolgen voor zowel natuur- en landbouw systemen1. Ondanks gezamenlijke inspanningen om te begrijpen van de oorzaken van dit probleem, zijn de factoren rijden honing honingbij dalingen nog steeds niet goed begrepen2,3,4. Voor bepaalde soorten van wilde, inheemse bijen, is de situatie geworden dire5,6. Als de bijenvolken kunnen niet worden gehandhaafd wanneer ze elkaar met de industriële landbouw snijden, hun bevolking zal blijven dalen en de gewassen waarvoor bestuivers (35% van de wereldwijde productie7) zal doorstaan verminderd oogsten.
Terwijl vele potentiële factoren zoals bestrijdingsmiddelen blootstelling, ziekte en habitat verlies1,4,8,9,10 zijn betrokken bij de daling van de bijen van de honing, relatief is weinig bekend over de interactieve effect van deze stressoren op inheemse bijen gezondheid, binnen of in de buurt van landbouwsystemen. Veel huidige onderzoeksinspanningen blijven richten op insecticiden (bijv, neonicotinoids11,12), hoewel afgelopen onderzoek wijst uit dat fungiciden ook een rol in de daling van de bee spelen kunnen door afbreuk te doen aan Geheugenvorming, olfactorische receptie13, nest erkenning14, enzymactiviteit en metabolische functies15,16,17. Wereldwijd blijven de Fungiciden op bloeiende gewassen worden toegepast tijdens de bloei. Recente studies hebben gedocumenteerd dat bijen brengen vaak fungicide residuen terug naar de korf18, inderdaad, studies hebben aangetoond een groot aantal geteste bijenkasten bevatte fungicide residuen19,20. Verdere werkzaamheden is gebleken dat fungicide residu wordt geassocieerd met hoge tarieven van honing honingbij larvale sterfte21,22,23 en de aanwezigheid van "entombed pollen" binnen de koloniën, die hoewel niet-toxisch, is verstoken van microbiële activiteit en voedingswaarde gecompromitteerde24. Ondanks het feit dat fungiciden hebben lang beschouwd als "bee-safe", blijkt nu dat de blootstelling aan fungicide alleen kan leiden tot ernstige kolonie verliezen in een inheemse bumble bee soorten, Bombus impatiens25.
Om het oorzakelijk verband tussen blootstelling van de fungicide en kolonie sterfte, de werkwijze van deze chemische stoffen moeten worden bepaald. Blijkens in bodems26, sedimenten27en28van het aquatisch milieu, gericht op schimmels, fungiciden waarschijnlijk veranderen schimmel overvloed en diversiteit binnen de stuifmeel-bepalingen, waardoor het inroepen van een grote gemeenschap die verschuiving kan sterk gunst bacteriën. Zonder schimmel concurrenten of antagonisten, kunnen bepaalde pathogene bacteriën vermenigvuldigen relatief ongecontroleerde, vergemakkelijking van het bederf van stuifmeel-bepalingen. Afgelopen onderzoek heeft aangetoond dat micro-organismen, met name de gisten en filamenteuze schimmels, dienen als voeding symbionten voor bijen29,30,31, beschermen tegen parasieten en pathogenen32 ,33, en op lange termijn behoud van stuifmeel winkels bieden. Fungiciden, daarom kunnen niet indirect schade toebrengen aan onrijpe bijen door het verstoren van de microbiële Gemeenschap die nodig is om deze services te verstrekken en/of door het verhogen van de gevoeligheid voor opportunistische pathogenen en parasieten12. Met de toenemende eisen op de productie van levensmiddelen, zijn gewassen die wereldwijd wordt gespoten jaarlijks met fungiciden tijdens bloei, onderstrepen de noodzaak om te begrijpen de omvang van dergelijke fungicide-geïnduceerde effecten.
Tot op heden, de lacunes in de primaire kennis met betrekking tot inheemse honingbij microbiële ecologie kan worden vertegenwoordigd door de volgende vragen: in welke mate verandert fungicide de microbiële Gemeenschap in bijen stuifmeel-voorzieningen? Wat zijn de downstream effecten van de consumptie van stuifmeel met een ingrijpend gewijzigde microbiële Gemeenschap? Houden met deze ecologisch germane vragen, experimenten werden ontwikkeld met de belangrijkste doelstellingen van het openbaren van 1) dat alleen fungicide-residu kan leiden tot daling van de strenge kolonie in een inheemse honingbij soorten; 2) de mate waarop microbiële gemeenschappen in stuifmeel-bepalingen worden gewijzigd door fungiciden, en 3) hoe bee gezondheid wordt beïnvloed door een sterk veranderde microbiële Gemeenschap. De experimentele doelstellingen werden gedefinieerd om aan te pakken van de bovenstaande vragen met behulp van een combinatie van laboratorium en veld-gebaseerde experimenten. Met behulp van state-of-the-art metagenomic en moleculaire technieken naast traditionele methoden van veld observatie, dit onderzoek heeft tot doel om samen stuk van de potentiële gezondheidseffecten van fungiciden bee.
De eerste doelstelling van deze studie is om aan te tonen dat fungicide blootstelling alleen leiden aanzienlijke kolonie verliezen onder inheemse honingbij soorten tot kan. Een studie waarbij grote veld kooien werd gebruikt voor het onderzoeken van de effecten van fungicide blootstelling op de groei van de kolonie van Bombus impatiens, een alomtegenwoordige, overvloedige inheemse honingbij in de VS (afbeelding 1, afbeelding 2, Figuur 3). Het was veronderstelde dat bijenkasten fungicide-behandeld voorleggen aan het zou lagere fitness en atypische demografie in vergelijking met niet-blootgesteld kasten. Gegevens die zijn verkregen uit dit experiment ondersteund deze hypothese, aan te tonen dat residuen van het fungicide binnen stuifmeel de enige oorzaak van diepe kolonie verliezen in een inheemse bumble bee soorten25kunnen zijn. De tweede doelstelling van deze studie is om te onderzoeken van de reactie van de stuifmeel-microbiome fungicide blootstelling. Het is veronderstelde dat de samenstelling van de Gemeenschap van microben in stuifmeel-bepalingen blootgesteld aan fungiciden van die van onbehandeld stuifmeel afwijken zullen. Terwijl schimmel overvloed diversiteit naar verwachting aanzienlijk afnemen, zal bacteriën en/of een één dominante schimmel soort waarschijnlijk groeien ongecontroleerde bij gebrek aan andere concurrerende schimmels. Door een reeks van in-vivo proeven, zal deze verschuivingen in microbiële Gemeenschap samenstelling worden geanalyseerd met behulp van metagenomics.

<table><tbody><tr><td>Natupol Beehive</td><td>Koppert</td><td>USRESM1</td><td>16 bijenkorven</td></tr><tr><td>Propiconazole 14.3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propiconazole 14,3%</td></tr><tr><td>Abound</td><td>Syngenta</td><td>4033540</td><td>Azoxystrobin 22,9%</td></tr><tr><td>Chlorothalonil</td><td>Syngenta</td><td>3452</td><td>Fungicide gebruikt voor proeven</td></tr><tr><td>Pollenkorrels</td><td>Geredde bij</td><td>B004D5650C</td><td>3X 16oz flessen, pollen voor proeven</td></tr><tr><td>Bacteriestammen voor inoculatie</td><td>Currie Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gistsoorten voor inoculatie</td><td>Hittinger lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primerparen</td><td>UW Biotech Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA-isolatiekit</td><td>Mo Bio</td><td>12830-50</td><td>Commerciële DNA-isolatiekit</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td>DNA-kwantificeringstool</td></tr><tr><td>Select Master Mix voor CFX</td><td>Thermo Fisher</td><td>4472952</td><td>Gebaat om real-time PCR uit te voeren met behulp van SYBR GreenER kleurstof.</td></tr><tr><td>Real-Time PCR-detectiesysteem</td><td>Bio Rad</td><td>1855196</td><td>Instrument gebruikt voor PCR-amplificatie</td></tr><tr><td>PCR Clean-Up Kit,</td><td>Axygen</td><td>10159-696</td><td>Gebaat voor efficiënte verwijdering van niet-geïntegreerde dNTP's, zouten en enzymen</td></tr><tr><td>DNA 1000 Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>Gebaat voor het bepalen van de grootte en analyse van DNA-fragmenten</td></tr><tr><td>MiSeq-sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td>Gebaat voor next-generation sequencing</td></tr><tr><td>Diverse glazen artikelen (kolven, flessen, pipetten, testbuizen, repietters)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

empirische, metagenomic en computationele technieken verlichten de mechanismen door welke fungiciden compromis bee gezondheid

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Kwekers gebruiken vaak fungicide sprays tijdens bloei te beschermen gewassen tegen ziekte, die bijen fungicide residuen blootstelt. Hoewel beschouwd als "bee-safe", is er montage bewijs dat fungicide residuen in stuifmeel gekoppeld bee dalingen (voor zowel de honing en de bumble bee-soorten zijn). Terwijl de mechanismen nog relatief onbekend, hebben onderzoekers gespeculeerd dat bee-microbe symbiose zijn betrokken. Microben spelen een centrale rol in het behoud en/of de verwerking van stuifmeel, dat als voeding voor larvale bijen fungeert. Door een wijziging van de microbiële Gemeenschap, is het waarschijnlijk dat fungiciden deze microbe-mediated diensten en verstoren waardoor compromis gezondheid van de bijen. Dit manuscript beschrijft de protocollen voor het onderzoeken van de indirecte mechanism(s) door die fungiciden wordt veroorzaakt door de daling van de kolonie. Cage experimenten bloot bijen aan fungicide-behandelde bloemen hebt al het eerste bewijs dat fungiciden diepgaande kolonie in een inheemse bumble bee (Bombus impatiens verliezen) opgegeven. Met behulp van veld-relevante doses van fungiciden, een reeks experimenten zijn ontwikkeld om te voorzien van een fijnere beschrijving van microbiële Gemeenschap dynamiek van stuifmeel fungicide-blootgesteld. Verschuivingen in de structurele samenstelling van schimmel en bacteriële assemblages binnen de stuifmeel-microbiome worden door de volgende-generatie sequentie en metagenomic analyse onderzocht. Experimenten ontwikkeld hierin zijn ontworpen om een mechanistische begrip van de invloed van fungiciden op de microbiome van stuifmeel-bepalingen. Uiteindelijk, deze bevindingen moeten licht werpen op de indirecte route waarlangs fungiciden wordt veroorzaakt door dalingen van de kolonie.

Veld kooi studie:
Gegevens die zijn verkregen uit de kooi experimenten bleek dat de bijenvolken bumble had een significante reactie fungicide blootstelling. De kasten fungicide-behandelde geproduceerd aanzienlijk minder werknemers (12.2 ± 3,8, gemiddelde ± SE) dan de controle kasten (43,2 ± 11.2, F1,9= 6,8, p = 0,03) (Figuur 4). Bovendien, was de honingbij biomassa...

Microbiële consortia binnen bumble bee-hives verrijken en behouden van pollen voor larven van de honingbij. Met behulp van de volgende generatie sequencing, samen met laboratorium en veld gebaseerde experimenten, dit manuscript wordt beschreven protocollen gebruikt om te testen van de hypothese dat fungicide residuen veranderen de stuifmeel microbiome, en de kolonie demografie, uiteindelijk leidde tot de kolonie verlies.

Empirische, Metagenomic en computationele technieken verlichten de mechanismen door welke fungiciden compromis Bee gezondheid

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Het algemene doel van dit multidisciplinaire project is om de specifieke mechanismen te isoleren waardoor fungicideresten op pollen koloniaal verval bij hommels kunnen veroorzaken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot de hoge sterfte onder hommelpopulaties als gevolg van de door fungiciden veroorzaakte verstoring van symbioses van bijenmicroben. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de indirecte effecten van fungiciden op bijen onderzoekt door het bijhouden van bijenpopulaties naast veranderingen in de microbiële gemeenschappen in het pollen van bijen.Hoewel deze methoden inzicht bieden in de gezondheid van inheemse bijen, kunnen ze ook worden toegepast op andere bestuivers zoals honingbijen, die wereldwijd een cruciale rol spelen bij de bestuiving van gewassen, waardoor de nadruk wordt gelegd op het verstandig gebruik van fungiciden op bloeiende gewassen. Het demonstreren van de procedures in dit samenwerkingsonderzoek zal worden gedaan door Prarthana Dharampal, Luis Diaz-Garcia en Caitlin Carlson. Om te beginnen, zet gaaskooien op in een veld met rogge.Maak er een per replicaat van. Plan om er ten minste 10 te maken voor een enkel behandelingsexperiment. Graaf eerst een greppel rond elke kooi en graaf alle vier de randen van de gaaskooi in de grond om ervoor te zorgen dat de bijen niet kunnen ontsnappen.Bevoorraad vervolgens de kooien met potplanten die bekend staan als aantrekkelijk voor bijen, zoals boekweit, borage, alyssum, kosmos en zonnebloemen. Vul elke kooi ook aan met een enkele lade met in bloei staande klaver. Bundel alle bloemenbronnen in één hoek van de kooi, die ongeveer 2,5 vierkante meter beslaat.Begroei het resterende oppervlak van de kooi met rogge. Voordat u de kolonies in de veldkooien laadt, moet u ervoor zorgen dat ze werksters en een enkele koningin bevatten. Laad vervolgens één kolonie per kooi gedurende een periode van 29 dagen.In de kooi, oriënteer de kolonieboxen zodanig dat de openingen van de kolonie naar het zuiden wijzen om de bijen optimale navigatievoorwaarden te bieden. Breng vervolgens de experimentele behandeling aan op de helft van de kooien. Gebruik in dit geval een handbediende spuit om chlorothalonil-gebaseerde fungicide toe te dienen op een voor het veld relevant niveau op de bloeiende planten.Deze behandeling wordt toegepast op dag nul en opnieuw op dag 13. Bekleed de bloemen gelijkmatig zodat er geen extra vloeistof aan de bloemoppervlakken blijft kleven. Aan het einde van de onderzoeksperiode verwijdert u de kolonies uit de kooien en verdooft u de bijen door de kolonies gedurende 20 minuten in een vriezer van min 20 graden Celsius te plaatsen.Eenmaal verdoofd, verwijdert u de bijen met steriele pincetten en noteert u het aantal larven, poppen, volwassen vrouwtjes en volwassen mannetjes, en de moederkoningin. Gebruik vervolgens een analytische weegschaal en noteer het droge gewicht van de moederkoningin en andere bijenklassen. Om te beginnen, vermaalt u commercieel verkregen pollen tot een fijn poeder met behulp van een standaard laboratoriumkogelmolen.Om het poedervormige pollen te steriliseren, weekt u het in 70 procent ethanol. Laat de ethanol een nacht onder UV-licht in een bioveiligheidskast verdampen. Controleer de volgende dag de steriliteit van het pollen door een kleine hoeveelheid op algemeen doel agarmedium te plaatsen met behulp van steriele tandenstokers.Incubeer de plaat 28 graden Celsius gedurende 48 uur en gebruik het alleen als er geen groei is. Voeg vervolgens met behulp van steriele pipetten een voor het veld relevante dosis fungicide toe aan het gesteriliseerde pollen en meng de twee grondig met steriele houten stokken. Gebruik sterieel water voor een controle.Bereid nu de bijenkorven voor het experiment voor in steekproefgroottes van minimaal drie. Bereid dagelijks aseptisch de pollenaliquotten voor elke bijenkorf voor. Breng vervolgens het pollen via de valdeur in de doos die elke bijenkorf omsluit binnen.Naast het pollen, voorziet u elke bijenkorf wekelijks van gesteriliseerde suikeroplossing. Voer dit voedingsregime vier weken lang uit. Anesthetiseer de bijenkorven aan het einde van de testperiode.Pry vervolgens heel voorzichtig de ingang van de woning open en graaf de inhoud op zonder dat het pollen of de larvale bijen dieper in het nest vallen. Voer dezelfde telling en wegingsmetingen uit voor de bijenkorf als voorheen, maar schraap ook het pollen dat zich in de broedkamers bevindt met behulp van gesteriliseerde pincetten. Verzamel het pollen in steriele buisjes en bewaar het vervolgens op min 80 graden Celsius voor latere analyse.Gegevens verkregen uit de kooiexperimenten toonden aan dat de hommelkolonies een significante reactie hadden op fungicide-blootstelling. De met fungiciden behandelde bijenkorven produceerden significant minder werksters dan de controle-bijenkorven. De totale biomassa was ook verminderd in bijenkorven behandeld met fungiciden, inclusief het gewicht van de moederkoningin.Het aantal en de massa van larven, poppen en volwassen mannetjes werd niet beïnvloed. De laboratoriumexperimenten bevestigden de resultaten uit het veld. Samen genomen zijn deze resultaten consistent met eerder gepubliceerde resultaten en geven ze aan dat blootstelling aan fungiciden de koloniefitness beïnvloedt.Onze gegevens tonen aan dat de microbiële diversiteit en evenwichtigheid verminderd waren in de met fungiciden behandelde bijenkorven. Metagenomisch onderzoek van pollenvoorraden werd gebruikt om veranderingen in de microbiële gemeenschappen van met fungiciden behandelde bijenkorven te analyseren. Er was een enorme afname in de abundantie van vaak geïsoleerde Streptomycetales en Enterobacteriales in de met fungiciden behandelde bijenkorven, terwijl bacteriële leden van de orde Rickettsiales, waaronder veelvoorkomende pathogenen van geleedpotigen, in veel grotere abundantie voorkwamen in de met fungiciden behandelde bijenkorven.Met fungiciden behandelde bijenkorven hadden ook een lagere abundantie van schimmels behorend tot de ordes Eurotiales, Sordariales en Saccharomycetales, ter

empirical-metagenomic-computational-techniques-illuminate-mechanisms

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Dit manuscript beschrijft meerdere protocollen voor het toedienen van farmacologische middelen aan de bijen, waaronder eenvoudige niet-invasieve methoden voor vrij vliegende bijen, evenals meer invasieve varianten die precies gelokaliseerde behandeling van ingehouden bijen mogelijk.

Neurofarmacologische Manipulatie van ingetogen en vrij vliegende Honingbijen,<em&gt; Apis mellifera</em

Hier presenteren we een methode om zowel een individuele honingbij als een bijenkolonie voedsel te geven dat besmet is met pesticiden. De procedure evalueert het effect van pesticiden op individuele honingbijen door in vivo voeding van een basislarvenvoeding en ook op de natuurlijke toestand van de bijenkolonie.

Het evalueren van het effect van Environmental Chemicals over Honey Bee ontwikkeling van het individu naar Colony Level

Het verlies van honingbijkolonies is een uitdaging om de bestuivingsdiensten te bestuderen. Huidige beschermingspraktijken van de bestuderende instanties garanderen een alternatieve aanpak om het contact van honingbijen tegen schadelijke pesticiden met behulp van afweermiddelen te beperken. Hier bieden we gedetailleerde methodes voor een visuele tracking protocol om afschermingen voor bijen te screenen.

Video Tracking Protocol voor Screen Deterrent Chemistries voor Honingbijen

Subletale doses van pesticiden kunnen van invloed zijn op de kolonies op manieren die moeilijk op te sporen met behulp van alleen visuele of periodieke methoden. Methoden voor het meten van de totale volwassen bee massa, brood en voedselbronnen door weging netelroos en korf onderdelen en frames te fotograferen, en installeren sensoren, worden geleverd. Data-analyse wordt ook behandeld.

Toezicht op de gevolgen van de kolonie-niveau van blootstelling van de subletale bestrijdingsmiddelen voor bijen

Fungicide sprays op tweezaadlobbige planten kunnen Solitaire bijen aan hoge concentraties van stuifmeel overgedragen fungicide residuen blootstellen. Met behulp van laboratorium gebaseerde experimenten waarbij in vitro-gefokte bijen larven, deze studie onderzoekt de interactieve effecten van de consumptie van fungicide-behandelde stuifmeel afkomstig van planten van de host en niet-host.

In Vitro Fokken van Solitaire bijen: een instrument voor de beoordeling van larvale risicofactoren

Dit protocol is ontwikkeld om het begrip te vergroten van hoe agrochemicaliën de reproductie van honingbijen(Apis mellifera)beïnvloeden door methoden vast te stellen om honingbijenkoninginnen en hun werkverzorgers bloot te stellen aan agrochemicaliën in een gecontroleerde, laboratoriumomgeving en zorgvuldig hun relevante reacties te volgen.

Beoordeling van agrochemisch risico voor gepaarde honingbijenkoninginnen

Het huidige protocol legt een methode uit om met pesticiden verontreinigde voorzieningen te voeren aan de larven van de solitaire bijen, Osmia excavata. De procedure onderzoekt de ecotoxiciteit van het bestrijdingsmiddel voor de larven van de solitaire bijen.

Evaluatie van het effect van pesticiden op de larven van de solitaire bijen

Producten op basis van glyfosaat (GBP) zijn wereldwijd de meest voorkomende breedspectrumherbiciden. In dit artikel introduceren we algemene richtlijnen om het effect van GBP op microbiomen te kwantificeren, van veldexperimenten tot bioinformatica-analyses.

Kwantificering van de potentiële impact van producten op basis van glyfosaat op microbiomen

We demonstreren een geteste methode voor het veilig omgaan met in het veld verzamelde bijen. Deze methode maakt snelle manipulatie, identificatie, genetische bemonstering en bevestiging van plant-insect-interacties mogelijk via stuifmeel dat tijdens de bemonstering is verzameld. Deze aanpak is gemakkelijk aan te passen en biedt een kosteneffectieve, niet-dodelijke manier om zeldzame insectengroepen te bestuderen.

Een snelle methode om bijen in het veld op te sluiten en veilig te hanteren

Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle procedure voor het detecteren van DNA van bijenpathogenen, zoals Lotmaria passim en Nosema ceranae, met behulp van een amplificatie-ready cellysis, recombinasepolymeraseamplificatie en CRISPR/Cas12a-assays.

On-site DNA-detectie van trypanosomatide parasieten en Nosema ceranae door middel van alkalische lysis gekoppeld aan RPA/CRISPR/Cas12a-systeem

Ontdek hoe fungiciden de gezondheid van hommelkoloniën beïnvloeden door microbiële symbiosen in stuifmeel te verstoren. Deze methode combineert veldexperimenten en metagenomische analyse om bijendemografie en microbiële gemeenschappen te onderzoeken.

Empirische, Metagenomic en computationele technieken verlichten de mechanismen door welke fungiciden compromis Bee gezondheid

Meer video's verkennen