Name: Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Leer een fluorescente test voor fosfolipide scramblase-activiteit met gereconstitueerde opsine in liposomen. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van eiwitgeïnduceerde lipidentransportmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de Velux Stiftung (A.K.M.), NIH-subsidie EY024207 (A.K.M.) en het project J3686 van de Austrian Science Fund (FWF) (B.P.).

1. Bereiding van liposomen en proteoliposomen <ol><li> liposoom Formation <ol><li> Met een glazen injectiespuit, voeg 1435 ul POPC (25 mg / ml in chloroform) en 160 gl POPG (25 mg / ml in chloroform) om een ​​rondbodemkolf tot 52,5 umol lipiden in een molaire verhouding van POPC verkrijgen: POPG = 9: 1. </li><li> Droog de lipiden gedurende 30 min onder toepassing van een rotatieverdamper bij een rotatiesnelheid van 145 rpm (geen waterbad nodig voor deze hoeveelheid oplosmiddel), breng de kolf met een vacuüm exsiccator gedurende tenminste 3 uur, of overnacht, bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Hydrateren gedroogde lipide film met 10 ml 50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl (hierna te noemen buffer A) door zachtjes omzwenken totdat een homogene, troebele suspensie resultaten; Opmerking: De concentratie aan lipiden in deze fase wordt verwacht dat 5,25 mM als geen verliezen zo ver moet hebben plaatsgevonden. </li><li> Ultrasone trillingen de suspensie in een waterbad gedurende 10 min bij kamertemperatuur met een frequentie of 40 kHz. De oplossing zal iets duidelijker kijken. </li><li> Onder toepassing van een extruder, passeert de suspensie 10 maal door een membraan met een 400 nm poriegrootte, gevolgd door een tweede cyclus van extrusie met 4 passages door een membraan met een 200 nm poriegrootte. OPMERKING: De gemiddelde diameter van de resulterende LUV is ~ 175 nm. Indien nodig kan de grootte en homogeniteit van de LUV&#39;s worden gecontroleerd door dynamische lichtverstrooiing volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Kwantificeren van de fosfolipide concentratie van de LUV suspensie zoals beschreven in paragraaf 1.2). LET OP: Als gevolg van de verliezen tijdens de extrusie, is de concentratie meestal rond de 3,6 mm. </li><li> Bewaar de LUV&#39;s bij 4 ° C gedurende ongeveer 2 weken Indien niet direct gebruikt. </li></ol></li><li> fosfolipiden kwantificering OPMERKING: De fosfolipideconcentratie van de LUV suspensie voor reconstitutie, evenals die van de proteoliposomen die uiteindelijk heeft gegenereerd, een deel van het monster is subjected oxidatie met perchloorzuur. Deze procedure breekt fosfolipiden anorganisch fosfaat dat vervolgens door een colorimetrische bepaling wordt gekwantificeerd ten opzichte van standaard 23 vrijgeven. <ol><li> Bereid een 40 mM voorraad oplossing van natriumfosfaat (Na 2 HPO 4) in gedeïoniseerd gedestilleerd water. </li><li> Verdun de voorraad oplossing met gedeïoniseerd gedestilleerd water tot 4 mm en 0,4 mm werkende oplossingen die als kalibratienormen zal dienen te verkrijgen. </li><li> De working oplossingen bereid normen in 13 x 100 mm glazen buizen 2 variërend van 0 tot 80 nmol natriumfosfaat in een eindvolume van 50 pi. </li><li> Neem 10 pi elk van de LUV en proteoliposoom monsters te kwantificeren en verdun met 40 ul van DDH 2 O in 13 x 100 mm 2 glazen buisjes. Opmerking: Als het lipide concentratie van de LUV proteo in het traject 2,5-5 uM, de 10 ul monster moet 25-50 nmol lipide fosfor.</li><li> Voeg 300 gl perchloorzuur aan alle standaarden en monsters en verwarm gedurende 1 uur bij 145 ° C in een verwarmingsblok. Zet knikkers op de buizen om verdamping te voorkomen. </li><li> Laat de buizen afkoelen tot kamertemperatuur en voeg 1 ml van DDH 2 O. </li><li> Voeg 400 ul elk vers bereide 12 g / l ammoniummolybdaat en 50 g / l natrium- ascorbaat en vortex te mengen. </li><li> Warmte gedurende 10 minuten bij 100 ° C met knikkers bovenop de buizen. Verwijder de buizen uit het verwarmingsblok en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. </li><li> Meet de absorptie van de monsters ten opzichte van de blanco (standaardmonster met 0 nmol natriumfosfaat) met een spectrometer bij een golflengte van 797 nm. </li><li> Bepaal het fosfaatgehalte van monsters tegen de kalibratie standaard curve. </li></ol></li><li> Reconstructie van Opsin Opmerking: Het is noodzakelijk om optimale omstandigheden voor reconstitutie zwelling te bepalen aangezien deze afhangen van de aard van het detergens, ende lipidesamenstelling en concentratie van de LUV&#39;s. Als LUV hun lichtverstrooiing eigenschappen veranderen zwellen van het proces kan worden gevolgd door meten van de absorptie (Figuur 2) zoals beoordeeld door Rigaud en Levy 24 en Geertsma et al. 25. <ol><li> Pipetteer 800 ul van LUV (uit paragraaf 1.1, als lipide herstel na extrusie is 70%, de verwachte concentratie van LUV is 3,6 mm fosfolipide) in een 2 ml microfugebuis. </li><li> Voeg 5,3 pl buffer A en 34,7 pl 10% (w / v) DDM opgelost in buffer A. </li><li> Incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur end-over-end mengen. </li><li> Ondertussen bereiden de polystyreen korrels: <ol><li> Gebruik 400 mg korrels per monster en wegen ze in een glazen beker. </li><li> Was ze tweemaal met methanol, driemaal met water en eenmaal met buffer A. Voor elke wasstap gebruik 5 ml vloeistof en roer langzaam gedurende 10 minuten. LET OP: Het is aanbevolen om het polystyreen te bereidenkralen voor meerdere monsters tegelijkertijd, bijvoorbeeld wegen 6 g kralen en wassen met 75 ml vloeistof. Excess kralen kunnen worden bewaard in een koelkast gedurende enkele dagen. </li></ol></li><li> Tijdens de laatste 30 minuten van blaasje destabilisatie droog de NBD-gelabelde fosfolipide in een schroefdop glazen buis ( &#39;reconstructie glazen buis&#39;): Per monster, 9,5 ui van NBD-PC (1 mg / ml in chloroform, hetgeen 0,4 mol% van de totale fosfolipiden) gedroogd onder een stroom van stikstof in een glazen buis en vervolgens in 45 pl 0,1% (w / v) in buffer A. DDM opgelost </li><li> Na 3 h vesicle destabilisatie voeg de opgeloste NBD-gemerkte fosfolipide, de DDM-oplosbaar eiwit en een buffer zodat de uiteindelijke volume van 1 ml bevat 0,36% (w / v), dat wil zeggen, 7 mM, DDM. <ol><li> Dus om eiwitvrij liposomen (gebruikt als controlemonster) voeg 45 ul van NBD-PC (opgelost in 0,1% DDM), 60 gl 0,1% DDM en 55 ui buffer A te genereren; voor proteoliposomen toe te voegen, voor examenple, 40 pi proteïne (een typische voorraadoplossing van ~ 110 ng / ul) in 0,1% DDM, 45 pl NBD-PC (opgelost in 0,1% DDM), 20 gl 0,1% DDM en 55 ui buffer A . LET OP: De volgorde van toevoeging moet zo worden vermeld. </li></ol></li><li> Meng het monster tegen uur over de kop bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 80 mg van de bereide polystyreen kralen en incuberen van het monster met eind-over-eind mengen gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Voeg vervolgens nog eens 160 mg polystyreen kralen en incubeer met eind-over-eind mengen gedurende nog eens 2 uur bij KT. </li><li> Breng het monster (waarbij de verbruikte polystyreenparels achter) een glazen schroefdop buis met 160 mg vers polystyreenkorrels en roer overnacht bij 4 ° C. OPMERKING: De gemakkelijkste manier om het monster over te dragen en te voorkomen zuigen korrels een Pasteur pipet die wordt geduwd naar de bodem van de glazen buis met een kleine positieve druk gebruikt. Zodra de punt van de pipet is stevig bij hetbodem van de buis, dat het monster kan gemakkelijk worden teruggetrokken zonder tussenkomst van de bolletjes. </li><li> De volgende ochtend, de overdracht van het monster aan een microfugebuis zonder over te dragen kralen en leg ze op ijs in voorbereiding op de scramblase activiteit assay. </li></ol></li></ol> 2. scramblase Activity Assay OPMERKING: De fluorescentie-intensiteit van liposomen of proteoliposomen verdund met buffer A in de tijd gevolgd bij toevoeging van dithioniet in een fluorescentie spectrometer. Om een ​​stabiele startintensiteit verkrijgen, wordt de fluorescentie genoteerd voor ten minste 50 seconden (of totdat een stabiel signaal bereikt) voor het toevoegen dithioniet een continu geroerde monster en wordt dan gevolgd gedurende ten minste 500 seconden na toevoegen van dithioniet. <ol><li> Voeg 1950 pl buffer A om een ​​plastic cuvet met een mini-bar roer. </li><li> Voeg 50 ul van de voorbereide Proteo (liposomen) en laat het monster equilibreren de fluorescentie spectrofotometermeter onder constant roeren gedurende enkele seconden. </li><li> Ondertussen bereiden een oplossing van 1 M dithioniet in 0,5 M ongebufferd Tris (bijvoorbeeld voor twee monsters Weeg 20 mg dithioniet in een microfugebuis en los op in 114 ul ijskoude 0,5 M Tris direct voor gebruik en bewaar op ijs voor de volgende monster). OPMERKING: De dithioniet oplossing moet worden bereid en mogen niet worden gebruikt meer dan 20 minuten na bereiding; Als vele metingen worden verricht, kunnen aliquots dithioniet worden gewogen en opgelost tevoren vlak voor gebruik. </li><li> Start de fluorescentie monitoren (excitatie 470 nm, emissie 530 nm, spleetbreedte 0,5 nm). </li><li> Voeg 40 ul van 1 M dithioniet oplossing van de cuvet 50 sec na aanvang van de fluorescentie opname (gebruik het septum in het deksel van de cuvette kamer indien mogelijk) en blijven de fluorescentie opnemen nog 400-600 sec. </li><li> Analyseer de gegevens zoals beschreven in paragraaf 3. </li></ol> 3.Gegevensanalyse <ol><li> Kinetiek van Scrambling <ol><li> Kenmerken de fluorescentie van elk spoor verkregen door scramblase activiteit testmonster door het definiëren van de initiële fluorescentie, Fj, voorafgaand aan het toevoegen dithioniet en het eindpunt fluorescentie, F, bereikt na&gt; 400 sec. F i wordt voor elk monster bepaald als de gemiddelde waarde van fluorescentie van de 30 seconden periode vóór toevoeging van dithioniet. </li><li> Bepaal het eindpunt gegevens betreffende de mate van fluorescentie vermindering, R = 100 • F / V i. Wij gebruiken de termen R L eiwitvrije liposomen en R P-opsine bevattende proteoliposomen. </li></ol></li><li> Het bepalen van de molecuulgewicht van het Functioneel Gereconstitueerd scramblase <ol><li> Zetten de gegevens fluorescentie reductie volgens de volgende vergelijking: p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (Rmax - R L) (Vergelijking 1) NOTITIE: Waar Rmax de maximale vermindering die wordt verkregen wanneer voldoende eiwit zodat alle blaasjes in het monster bezitten ten minste één functionele scramblase wordt gereconstitueerd en p de waarschijnlijkheid dat een bepaald blaasje in een gereconstitueerd monster &quot;scramblase actief&quot;, dat wil zeggen, bezit ten minste één functionele scramblase. De waarde van RL typisch 45% 3 dat Rmax typisch 82,5% 3, in plaats van de verwachte 100% (Rmax kan experimenteel worden bepaald voor opsin proteoliposomen met PPR van&gt; 1 mg / mmol). Zoals Rmax &lt;100% wordt aangenomen dat een subpopulatie van vesicles ongevoelig is voor reconstitutie. Voor Rmax = 82,5%, de fractie van vesicles die niet kan accepteren eiwit is 0,35. </li><li> Beschrijf de relatie tussen p (≥1 scramblase) en PPR (mg eiwit / mmol fosfolipide) door Poisson statistieken als volgt: p (≥1 scramblase) = 1 - e <sup&gt; -m = 1 - exp (-PPR / α) (Vergelijking 2) LET OP: Indien m = aantal scramblases per blaasje en α = mono-exponentiële fit constant in eenheden van mg eiwit / mmol fosfolipide. </li><li> Als een fractie van de vesicles niet bijdraagt ​​aan scrambling zelfs bij hoge PPR (zie bespreking), wijzigt de vergelijking: p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Vergelijking 3) OPMERKING: Indien PPR PPR * = / (1- f), waarbij f de refractaire populatie van vesicles of, in dit geval, PPR * = PPR / 0,65 (Vergelijking 4). OPMERKING: De pasvorm constante α wordt bepaald door het aanbrengen van een grafiek van p (≥1 scramblase) versus PPR * met een mono-exponentiële functie. Als opsin (molecuulgewicht 41,7 kDa) functioneel reconstrueert in 175-nm diameter vesikels (blaasjes heeft elke 280.000 fosfolipiden 26) als een monomeer, α = 0,187 mg mmol -1. Als opsin dimeriseert vóór reconstitutie 3 tot scramblase-actieve vesicles verkregen, dan α= 0,37 mg mmol -1. Als PPR plaats PPR * zouden worden gebruikt voor de analyse, dan zou de overeenkomstige α waarden 0,122 en 0,244 mg mmol -1 zijn. Deze voorspelde waarden van α veronderstellen dat alle opsin moleculen functioneel bevoegd. Als slechts een fractie van de moleculen bevoegd lipiden scramble dan de overeenkomstige waarden van α groter. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ernst, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+and+animal+rhodopsins%3A+structures%2C+functions%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms.</a> Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).</li>
<li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsin+is+a+phospholipid+flippase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol.+CB%22%5BJournal%5D)">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).</li>
<li>Goren, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+phospholipid+scramblase+activity+of+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor.</a> Nat. Commun. 5, 5115(2014).</li>
<li>Ernst, O. P., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scrambling+by+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci.+Off.+J.+Eur.+Photochem.+Assoc.+Eur.+Soc.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scrambling by rhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).</li>
<li>Sanyal, S., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flipping+lipids%3A+why+an%27+what%27s+the+reason+for%3F%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flipping lipids: why an' what's the reason for?</a> ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).</li>
<li>Bevers, E. M., Williamson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scramblase%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scramblase: an update.</a> FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).</li>
<li>Leventis, P. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+function+of+phosphatidylserine+in+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).</li>
<li>Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCA4+is+an+N-retinylidene-phosphatidylethanolamine+and+phosphatidylethanolamine+importer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer.</a> Nat. Commun. 3, 925(2012).</li>
<li>Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-binding+cassette+transporter+ABCA4+and+chemical+isomerization+protect+photoreceptor+cells+from+the+toxic+accumulation+of+excess+11-cis-retinal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).</li>
<li>Ben-Shabat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+nonaoxirane+from+A2E%2C+a+lipofuscin+fluorophore+related+to+macular+degeneration%2C+and+evidence+of+singlet+oxygen+involvement%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement.</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).</li>
<li>Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+meets+all-trans-retinal%3A+the+making+of+RPE+bisretinoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids.</a> J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).</li>
<li>Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodamage+to+human+RPE+cells+by+A2-E%2C+a+retinoid+component+of+lipofuscin%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).</li>
<li>Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM16+proteins%3A+unknown+structure+and+confusing+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions.</a> J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).</li>
<li>Mohammadi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FtsW+as+a+transporter+of+lipid-linked+cell+wall+precursors+across+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane.</a> EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).</li>
<li>Meeske, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MurJ+and+a+novel+lipid+II+flippase+are+required+for+cell+wall+biogenesis+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).</li>
<li>Ruiz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Flippases+for+Bacterial+Peptidoglycan+Biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Lipid+Insights%22%5BJournal%5D)">Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis.</a> Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).</li>
<li>Rick, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+wzxE+gene+of+Escherichia+coli+K-12+encodes+a+protein+involved+in+the+transbilayer+movement+of+a+trisaccharide-lipid+intermediate+in+the+assembly+of+enterobacterial+common+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen.</a> J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).</li>
<li>Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+phosphatidylserine+by+Xk-related+protein+family+members+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).</li>
<li>Suzuki, J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scrambling+on+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scrambling on the plasma membrane.</a> Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).</li>
<li>Alaimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+but+interchangeable+mechanisms+for+flipping+of+lipid-linked+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides.</a> EMBO J. 25, 967-976 (2006).</li>
<li>Ernst, C. M., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antimicrobial+peptide+restistance+by+MprF-mediated+aminoacylation+and+flipping+of+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbial%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids.</a> Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).</li>
<li>Vehring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flip-flop+of+fluorescently+labeled+phospholipids+in+proteoliposomes+reconstituted+with+Saccharomyces+cerevisiae+microsomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins.</a> Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).</li>
<li>Rouser, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+then+%5Bsic%5D+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5, 494-496 (1970).</li>
<li>Rigaud, J. -L., Lévy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).</li>
<li>Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+formation+and+transmembrane+protein+incorporation+using+octyl+glucoside%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside.</a> Biochemistry. 20, 833-840 (1981).</li>
<li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nat. Commun. 4, 2367(2013).</li>
<li>Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter+is+a+flippase+for+glucosylceramide+and+other+simple+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids.</a> Biochem. J. 389, 517-526 (2005).</li>
<li>Marek, M., Günther-Pomorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+Flippase+Activity+in+Proteoliposomes+Using+Fluorescent+Lipid+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives.</a> Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).</li>
<li>Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+purification%2C+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2%2C+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li>
<li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li>
<li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li>
<li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p%2C+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De scramblase activiteit test konden we oorspronkelijk om te bepalen dat opsin heeft fosfolipiden scramblase activiteit 2. De test konden we ook opsin&#39;s scramblase activiteit karakteriseren testen specificiteit (we gebruikten verschillende NBD-gelabelde reporter lipiden zoals NBD-fosfatidylethanolamine, gelabeld met NBD op acylketen zoals getoond NBD-PC in figuur 1A, of de kopgroep, NBD-sfingomyeline of NBD- fosfatidylserine 2) het effect van vesicle lipidesamenstelling (bi...

De fotoreceptor rhodopsine, een prototypisch G-eiwit gekoppelde receptor (besproken in bijvoorbeeld referentie 1), is het eerste fosfolipide scramblase worden vastgesteld en geverifieerd biochemisch 2,3. Scramblases zijn fosfolipiden transporters die de intrinsiek langzame transbilayer fosfolipiden beweging te verhogen tot fysiologisch passende niveaus in een bidirectionele, ATP-onafhankelijke wijze 4-6. Voorbeelden van hun acties te vinden in het endoplasmatisch reticulum en bacteriële cytoplasmatische membraan waarbij constitutief versluiering nodig voor membraan homeostase en groei, alsmede voor een verscheidenheid van glycosyleringsroutes 5. Gereguleerd fosfolipide versluiering nodig om fosfatidylserine (PS) op het oppervlak van apoptotische cellen bloot waar het als een &quot;eet-me&quot; -signaal voor macrofagen en 7 verschaft een procoagulant oppervlak op geactiveerde bloedplaatjes tot de productie van eiwit factor katalyserens die nodig zijn voor de bloedstolling. In fotoreceptor disc membranen heeft scrambling activiteit rhodopsine is voorgesteld om het fosfolipide onbalans tussen de twee membraanlagen folders van de bilaag die wordt gegenereerd door de ATP-afhankelijke unidirectionele lipide tegen flippase ABCA4 4,8,9 10-12. Ondanks het fysiologische belang van scramblases, hun identiteit ongrijpbaar gebleven tot rhodopsine werd gerapporteerd als scramblase in fotoreceptor schijven 2, leden van de eiwitfamilie TMEM16 geïdentificeerd als Ca2 + -afhankelijke scramblases nodig voor PS blootstelling bij de plasmamembraan (besproken in referentie 13), en de bacteriële eiwit FtsW voorgesteld als een lipide II scramblase vereist peptidoglycaansynthese 14. Deze ontdekkingen zijn gebaseerd op de reconstitutie van gezuiverde eiwitten in liposomen en demonstratie van scramblase activiteit in de verkregen proteoliposomen hand van de methode describHier ed. Andere potentiële scramblases 15-21 - de MurJ en AMJ eiwitten die betrokken zijn bij de biosynthese van peptidoglycaan, WzxE en verwante eiwitten betrokken bij scrambling O-antigen voorlopers, MPRF eiwit nodig om aminogeacyleerde phosphatidylglycerol verplaatsen over het bacteriële cytoplasma membraan en Xkr8 familieleden die zijn voorgesteld bloot PS op het oppervlak van apoptotische cellen - nog moeten biochemisch testen. Dit benadrukt het belang van een robuuste test te identificeren en te karakteriseren scramblase activiteit. Hier beschrijven we de bereiding van gezuiverde opsin het apo-eiwit van de fotoreceptor rhodopsine, in grote unilamellaire vesikels (LUV&#39;s) en daaropvolgende analyse van scramblase activiteit in de verkregen proteoliposomen met een op fluorescentie gebaseerde assay. Er zijn verscheidene goed beschreven protocols beschikbaar in de literatuur voor de heterologe expressie en zuivering van opsin, daarom zullen wij nietbeschrijven in dit protocol; We gebruiken het in Goren et al. 3 beschreven protocollen die FLAG-gemerkte, thermostabiel opsin levert ongeveer 100 ng / ul in 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM). Reconstitutie wordt bereikt door behandeling LUVs voldoende wasmiddel zodat zij zwellen maar niet oplossen. Onder deze omstandigheden, een membraaneiwit - in de vorm van eiwit-detergens micellen meebrengen - te integreren in de liposomen en wordt opgelost in de liposoommembraan na verwijdering detergens, waardoor proteoliposomen. Opsin te reconstitueren (verkregen als een gezuiverd eiwit in 0,1% (w / v) DDM), worden LUV&#39;s bereid uit een mengsel van POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine) en POPG (1- palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- [fosfo-rac- (1-glycerol)]) en verzadigd met DDM voor het toevoegen opsin en NBD-PC. Daarna wordt het detergens verwijderd door behandelen van het monster met polystyreen korrels. lass = &quot;jove_content&quot;&gt; Uitgangspunt van de fluorescentie-gebaseerde test wordt getoond in figuur 1B. LUV symmetrisch gereconstitueerd met een sporenhoeveelheid NBD-PC of andere NBD-gelabelde fluorescente fosfolipide reporter (Figuur 1A). Het toevoegen dithioniet, is een membraan-impermeant dianion, NBD-PC moleculen in de buitenste laag van de LUV&#39;s worden weergegeven niet fluorescerende als de nitro-groep NBD tot een niet-fluorescerende aminogroep. Aangezien noch NBD-PC moleculen of dithioniet kunnen migreren door de op de tijdschaal van het experiment (&lt;10 min) resulteert in 50% reductie van het fluorescentiesignaal. Indien de liposomen worden gereconstitueerd met een scramblase, NBD-PC moleculen in het binnenste leaflet kan snel scramble naar buiten waar zij worden gereduceerd. Dit resulteert in het totale verlies van fluorescentie in het ideale geval (figuur 1C). es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . Figuur 1: Schematische weergave van de scramblase activiteit assay De assay maakt gebruik van een fluorescent-gelabelde reporter NBD lipide; NBD-PC is afgebeeld (A). Grote unilamellaire blaasjes gereconstitueerd met een sporenhoeveelheid NBD-PC. Reconstitutie produceert symmetrische blaasjes met NBD-PC gelijk verdeeld in de buitenste en binnenste folders. Dithioniet (S 2 O 4 2-) chemisch reduceert de nitro-groep NBD een niet-fluorescerende aminogroep. Behandeling van eiwitvrije liposomen met dithioniet (B, boven) veroorzaakt een reductie 50% van de fluorescentie omdat alleen het NBD-PC moleculen in de buitenste laag gereduceerd: dithioniet is negatief geladen en kan het membraan reageren met NBD-PC moleculen niet overschrijden in het binnenste leaflet. Dithioniet behandeling van opsin bevattende proteoliposomen (B, onder), dat wil zeggen, scramblase-actieve proteoliposomen, resulteert in 100% verlies van fluorescence als opsin vergemakkelijkt beweging van NBD-PC tussen de binnenste en de buitenste laag. (C) toont geïdealiseerde fluorescentie sporen verkregen op de behandeling van eiwitvrije liposomen en-opsin bevattende proteoliposomen met dithioniet. De snelheid van fluorescentie verlies is hetzelfde in beide gevallen aangeeft dat de chemische reductie van NBD door dithioniet is snelheidsbeperkende, en dat klauteren gebeurt met een snelheid die gelijk is aan of groter is dan de snelheid van de chemische reactie. Sporen verkregen uit een eigenlijke experiment zijn weergegeven in figuur 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> De werkwijzen beschrijven we kunnen worden gebruikt voor het reconstitueren en andere testen gezuiverde eiwitten, alsmede mengsels van membraaneiwitten verkregen, bijvoorbeeld door extractie met detergens microsomen 22.

<table><tbody><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (natriumzout)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td>POPG</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810130C</td><td>NBD-PC</td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur</td><td>VWR Scientific</td><td>EM-5330</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 5 GM</td><td>DDM</td></tr><tr><td>Fluorimeter cuvettes</td><td>sigma</td><td>C0918-100EA</td><td>cuvettes</td></tr><tr><td>Spectrofluorometer</td><td>Photon Technology International, Inc.</td><td>fluorimeter</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydrosulfiet technische kwaliteit, 85%</td><td>Sigma</td><td>157953-5G</td><td>ditioniet</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 software</td><td></td><td></td><td>Prism</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX 10 ml extruder</td><td>Northern Lipids, Inc.</td><td></td><td>Extruder</td></tr><tr><td>Whatman, Drain disc, PE, 25 mm</td><td>Sigma</td><td>28156-243</td><td>Disc support</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0,4 &micro;m, 25 mm diameter</td><td>Sigma</td><td>WHA110607</td><td>400 nm membraan</td></tr><tr><td>Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0,2 &micro;m, 25 mm diameter</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td><td>200 nm membraan</td></tr><tr><td>natriumfosfaat</td><td>Sigma</td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>VWR Cultuurbuisjes, wegwerpbaar, borosilicaatglas, 13 x 100 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td><td>glazen buisjes</td></tr><tr><td>Perchloorzuur</td><td>Sigma</td><td>30755-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniummolybdaattetrahydraat</td><td>Sigma</td><td>A-7302</td><td>ammoniummolybdaat</td></tr><tr><td>(+)-Natrium L-ascorbaat</td><td>Sigma</td><td>A7631-25G</td><td>natriumascorbaat</td></tr><tr><td>Bio-Beads SM2 adsorbenten</td><td>Bio Rad</td><td>1523920</td><td>polystyreenkralen</td></tr><tr><td>2,0 ml Microtubes helder</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742</td><td>Reconstitutiebuisjes</td></tr><tr><td>Reconstitutie glasbuisje</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800</td><td>Reconstitutie glasbuisjes</td></tr><tr><td>ZetaSizer</td><td>Malvern</td><td></td><td>DLS</td></tr></tbody></table>

een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase activity

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases verplaatsen fosfolipiden over het membraan bilaag bidirectioneel in een ATP-onafhankelijke wijze. De eerste scramblase worden geïdentificeerd en biochemisch geverifieerd werd Opsin, de apo-eiwit van de fotoreceptor rhodopsine. Rhodopsine is een G-eiwit-gekoppelde receptor gelokaliseerd staaf fotoreceptor disc membranen van het netvlies waar het verantwoordelijk is voor de waarneming van licht. Rhodopsin&#39;s scramblase activiteit hangt niet af van zijn ligand 11- cis -retinal, dat wil zeggen, de apoproteïne opsin is ook actief als scramblase. Hoewel constitutief en gereguleerd fosfolipide versluiering een belangrijke rol spelen celfysiologie, slechts enkele fosfolipide scramblases dusver naast opsin geïdentificeerd. Hier beschrijven we een fluorescentie-gebaseerde test van scramblase activiteit opsin&#39;s. Opsin wordt opgelost in grote unilamellaire liposomen samengesteld uit fosfatidylcholine, fosfatidylglycerol en een spoor hoeveelheid fluorescent-NBD gelabelde PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazool-4-yl) amino] hexanoyl} - sn-glycero-3-fosfocholine). Scramblase activiteit wordt bepaald door de mate waarin NBD-PC moleculen in het binnenste leaflet van de vesicle in staat om de buitenste laag waar hun fluorescentie chemisch wordt geëlimineerd door een reductiemiddel dat het membraan niet kan passeren. De werkwijzen beschrijven we hebben algemene toepasbaarheid en kunnen worden gebruikt om scramblase activiteiten van andere membraaneiwitten identificeren en te karakteriseren.

We beschrijven de bereiding van opsin in LUV&#39;s zijn scramblase activiteit karakteriseren met behulp van een fluorescentie-gebaseerde test. We analyseren de resultaten aan een ondergrens te plaatsen op de snelheid van opsin gemedieerde fosfolipiden klauteren en de oligomere toestand waarin opsin functioneel reconstitutes in de blaasjes te bepalen. Optimale reconstitutie voorwaarden aangeeft, moet empirisch bepalen de hoevee...

We beschrijven een op fluorescentie gebaseerde assay om fosfolipide-scrambling in grote unilamellaire liposomen gereconstitueerd met opsine te meten.

Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Het algemene doel van deze procedure is om een typische G-eiwitgekoppelde receptor te reconstitueren in grote unilamellaire vesicles en om het vermogen ervan om onafhankelijke translocatie van fosfolipiden over een lipide dubbellaag uit te voeren te meten met behulp van een fluorescentie-gebaseerde assay. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van intercellulair lipidentransport, zoals wat de moleculaire identiteit is van eiwitten die lipiden kunnen scramblen en wat hun mechanisme is. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze zeer betrouwbaar en robuust is.Zodra uw reconstitutieprocedure is vastgesteld voor een bepaalde lipidensamenstelling en een voorkeursdetergens, kunt u deze procedure starten. Gebruik een glazen injectiespuit om 1435 µL van een 25 mg/mL oplossing van POPC en chloroform toe te voegen aan een rondbodemkolf. Voeg 160 µL van een 25 mg/mL oplossing van POPG en chloroform toe om 52,5 µmol lipiden te verkrijgen in een molaire verhouding van negen op één POPC ten opzichte van POPG.Droog vervolgens de lipiden gedurende 30 minuten met een rotatieverdamper die is ingesteld op 145 RPM. Zodra het drogen is voltooid, wordt de kolf gedurende drie uur bij kamertemperatuur in een vacuümexsiccator geplaatst. Voeg daarna 10 milliliters buffer A toe om de gedroogde lipidlaag te hydrateren.Wals voorzichtig met de fles totdat er een homogene troebele suspensie is gevormd. Sonicate de suspensie bij een frequentie van 40 kilohertz in een waterbad op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Laat vervolgens het monster met een extruder 10 keer door een membraan met een poriegrootte van 400 nanometer passeren.Volg dit met een tweede extrusiecyclus door het monster vier keer door een membraan met een poriegrootte van 200 nanometer te persen. Zet de resulterende, zichtbaar helderdere suspensie apart, die grote unilamellaire fosfolipidevesikels van ongeveer 175 nanometer in diameter bevat. Bereid, nadat de extrusie is voltooid, standaarden voor in glazen buisjes van 13 bij 100 millimeter, zoals beschreven in het tekstprotocol.Voeg vervolgens 10 µL van elk LUV- en proteoliposoommonster toe aan een aparte glazen buis en verdun dit met 40 µL gedeïoniseerd gedestilleerd water. Voeg 300 µL perchloorzuur toe aan elke buis en verhit deze gedurende één uur bij 145 °C in een heating block. Plaats een knikker op elke buis om verdamping te voorkomen.Laat de buizen vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur en voeg aan elk een milliliter gedeïoniseerd gedestilleerd water toe. Voeg aan elk 400 µL toe van een vers bereide oplossing die 12 g/L ammoniummolybdaat en 50 g/L natriumascorbaat bevat, en meng dit door te vortexen. Verhit de buizen 10 minuten lang bij 100 °C, waarbij knikkers worden gebruikt om verdamping te voorkomen.Verwijder vervolgens de buisjes uit het warmteblok en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Stel een spectrometer in op 797 nanometer en stel een kalibratiecurve op met behulp van de standaarden. Meet daarna de absorbentie van de monsters ten opzichte van de blanco en bepaal het fosfaatgehalte.Begin met het pipetteren van 800 µL van elke geëxtrudeerde LUV-suspensie in een aparte microfuse-buis van 2 mL. Voeg aan elke buis 5,3 µL buffer A en 34,7 µL 10% m/v DDM, opgelost in buffer A, toe. Incubeer de monsters vervolgens gedurende drie uur bij kamertemperatuur onder end-over-end menging.Terwijl de monsters incuberen, weegt u 400 milligram kralen per monster af in een glazen bekerglas. Was de kralen met vijf milliliter methanol per monster, terwijl u 10 minuten lang langzaam roert. Herhaal deze wasstap één keer met methanol, drie keer met water en één keer met buffer A. Gedurende de laatste 30 minuten van de monsterincubatie droogt u 9,5 microliter NBD-gelabeld fosfolipide per monster in een glazen schroefnaalbuis onder een stroom stikstof.Voeg vervolgens per monster 45 µL 0,1% m/v DDM in buffer A toe om het gedroogde fosfolipide op te lossen. Nadat de incubatie is voltooid, wordt de opgeloste MBD-gelabelde fosfolipide-oplossing aan elk monster toegevoegd. Voeg vervolgens 0,1% DDM, buffer A en de DDM-gesolubiliseerde opsine in de gewenste hoeveelheid toe, in die volgorde, om een eindvolume van 1 mL te verkrijgen met een concentratie van 7 mM DDM.Reconstitutie van een membraaneiwit wordt bereikt door vesikels te behandelen met voldoende detergent, zodanig dat de zwelling niet zal oplossen. Onder deze condities, die empirisch bepaald moeten worden voor elke lipidensamenstelling en elk detergent, zal het eiwit in de liposomen worden geïntegreerd. Meng de monsters gedurende één uur bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 80 milligram van de geprepareerde polystyreenkraaltjes toe aan elke buis en incubeer opnieuw gedurende één uur bij kamertemperatuur met end-over-end menging. Voeg nog eens 160 milligram polystyreenkraaltjes toe aan elk monster en incubeer twee uur bij kamertemperatuur met end-over-end menging. Wanneer de incubatie is voltooid, worden de monsters, waarbij de kraaltjes achterblijven, overgebracht naar schone glazen buisjes die elk 160 milligram verse kraaltjes bevatten.Meng de monsters gedurende de nacht door middel van end-over-end rotatie bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht. Draag vervolgens de monsters, zonder de kraaltjes, over naar unieke microfuse-buisjes. Plaats de buisjes op ijs ter voorbereiding op de scramblase-activiteitsanalyse.Begin met het toevoegen van 1950 µL buffer A aan een plastic cuvet met daarin een plastic roerstafje. Voeg vervolgens 50 µL van het voorbereide protealiposome-monster toe. Laat het monster vijf seconden lang equilibreren in de fluorescentiespectrometer onder constant roeren.Terwijl het monster equilibreert, bereidt u een oplossing van één molar dithioniet in 0,5 molar ongebufferde tris. Start de fluorescentiemonitoring met een excitatie van 470 nanometer, een emissie van 530 nanometer en een spleetbreedte van 0,5 nanometer. Registreer gedurende 50 seconden om een stabiel signaal te verkrijgen.Voeg vervolgens 40 µL van een 1 M dithionietoplossing toe aan de cuvet. Registreer de fluorescentie gedurende ten minste 500 seconden. Analyseer tot slot de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol.Voor een volledige analyse van de fluorescentiedata, wanneer de fractie vesikels die niet gereconstitueerd kunnen worden moet worden bepaald. Het herstel van eiwitten en lipiden in de gereconstitueerde vesikels en tevens de grootteverdeling van de vesikels. In deze studie wordt opsine gereconstitueerd in grote unilamellaire vesikels om de scramblase-activiteit ervan te karakteriseren met behulp van een fluorescentie-gebaseerde assay.Vesikels worden gereconstitueerd met NBD-PC, dat zich gelijkmatig verdeelt over de buitenste en binnenste leaflets. Dithioniet reduceert de nitrogroep van NBD aan de buitenkant van de vesikel tot niet-fluorescerende aminogroepen, wat resulteert in een reductie van 50% van de fluorescentie in eiwitvrije liposomen. Wanneer opsine echter de beweging van NBD tussen de binnenste en buitenste leaflet faciliteert, treedt een volledig verlies van fluorescentie op.De representatieve resultaten van deze aanpak bij verschillende eiwit-fosfolipideverhoudingen zijn hier te zien. De mate van fluorescentiereductie neemt toe met de hoeveelheid opsine die in blaasjes is gereconstitueerd, variërend van nul tot 4,95 micrograms. Dithioniet werd op het aangegeven tijdstip toegevoegd en de NBD-fluorescentie werd gedurende 400 seconden gemonitord.De afname van de fluorescentie is significanter bij hogere eiwit-fosfolipideratio's, waarbij de grootste afname 85% bedraagt. De fluorescentiereductie aan het eindpunt wordt vervolgens gebruikt om de waarschijnlijkheid van scramblase-activiteit te bepalen, oftewel de kans dat blaasjes ten minste één scramblase bevatten met behulp van de statistiek van Polson. De rode curve vertegenwoordigt een mono-exponentiële fit voor opsine. De grijze stippellijnen vertegenwoordigen mono-exponentiële fits voor de reconstitutie van opsine in blaasjes als monomeren, vooraf gevormde dimeren of vooraf gevormde tetrameren.De methode die we beschrijven kan eenvoudig worden aangepast aan verschillende behoeften. De procedures zijn veelzijdig en kunnen in de toekomst worden gebruikt om de fosfolipide-scramblase-activiteit van andere membraanproteïnen te identificeren en te karakteriseren. De reconstitutieprocedure kan op elk membraanproteïn worden toegepast.Deze techniek stelde ons in staat om opsine te identificeren als de eerste biochemisch geverifieerde fosfolipiden-scramblase en stelde ons vervolgens in staat om de activiteit van verschillende conformationele toestanden van het eiwit en het vermogen om verschillende lipiden te transporteren te karakteriseren.

a-fluorescence-based-assay-of-phospholipid-scramblase-activity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We introduceren een snelle fluorescentie-gebaseerde test die de mate van fluorescentie quenching als een maat voor gramicidine kanaal activiteit monitoren. De gramicidine kanalen worden gebruikt als moleculaire krachtopnemers op veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen als waargenomen door bilaag spanning eiwitten controleren.

Gramicidine op basis van fluorescentie test, voor het bepalen van kleine moleculen Potentieel voor het wijzigen van lipide bilaag Properties

Om de interactie van een proteïne test met haar doel lipide gebruikten we MACS en Annexine V-geconjugeerde magnetische kralen en lipide vesicles gesynthetiseerd uit het doel lipiden en Annexine V-bindend fosfatidylserine. Eiwitten gebonden aan de doelgroep lipide zijn co-gezuiverd en geanalyseerd na elutie van de kralen.

Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze

This video discusses the fluorescence leakage assay to study the interactions of cell-penetrating peptides with cell membranes using cell membrane mimics — large unilamellar vesicles, or LUVs, encapsulated with a fluorescent dye and a quencher.

Fluorescence Leakage Assay to Study Cell-Penetrating Peptide Interaction with Membrane

In this video, we demonstrate protein-phosphoinositide interactions in a microfluidic pattern using the pH modulation assay, using pH-sensitive fluorescent dye tagged to phosphatidylethanolamine lipid of a supported lipid bilayer, called a microfluidic platform. The modulations in pH after protein binding to phospholipid cause fluorescence quenching.

pH Modulation Assay on Supported Lipid Bilayers to Detect Protein-Phosphoinositide Interactions

We presenteren een nieuwe techniek om de laterale diffusie van een oppervlakteactieve soort op het vloeistof-vloeistof grensvlak te meten door een druppel monolaag samen te voegen met een platte monolaag.

Fluorescentie herstel na het samenvoegen van een druppel op de twee-dimensionale Verspreiding van een Phospholipid monolaag Meet

PI (4,5) P2 regelt diverse cellulaire functies, maar de nanoschaal organisatie in de cel plasmamembraan wordt slecht begrepen. Etikettering PI (4,5) P2 met een dubbele-color fluorescent probe gefuseerd met het Pleckstrin homologie domein beschrijven we een nieuwe benadering voor het bestuderen PI (4,5) P2 ruimtelijke verdeling in het plasmamembraan op nanometerschaal .

Single-molecule Super-resolutie beeldvorming van fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat in het plasmamembraan met Novel Fluorescerende Probes

Hier presenteren we een ondersteunde lipid bilayer in het kader van een microfluïdisch platform om eiwit-fosfoinositide interacties te bestuderen met behulp van een etiketvrije methode op basis van pH-modulatie.

PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

Dit protocol beschrijft de fabricage van liposomen en hoe deze kunnen worden geïmmobiliseerd op een oppervlak en afzonderlijk worden afgebeeld op een massale parallelle manier met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit zorgt voor de kwantificering van de grootte en compositorische inhomogeniteit tussen enkele liposomen van de populatie.

Een kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom test voor het opsporen van de compositorische Inhomogeniteit tussen individuele liposomen

De fluorescentielekkagetest is een eenvoudige methode die het onderzoek van peptide / membraaninteracties mogelijk maakt om hun betrokkenheid bij verschillende biologische processen te begrijpen en vooral het vermogen van cel-penetrerende peptiden om fosfolipiden bilayers te verstoren tijdens een direct cellulair translocatieproces.

Fluorescerende lekkagetest om membraan destabilisatie door cel-penetrerend peptide te onderzoeken

Hier beschrijven we protocollen met behulp van fluorescerende lipidesensoren en liposomen om te bepalen of een eiwit fosfatidylserine of fosfatidylinositol 4-fosfaat in vitroextraheert en transporteert .

Fluorescentie-gebaseerde metingen van fosfatidylserine / fosfatidylinositol 4-fosfaatuitwisseling tussen membranen

We presenteren een kosteneffectieve methode voor het beoordelen van liposomale membraanpermeabiliteit met een superieure gevoeligheid en resolutie ten opzichte van conventionele technieken. Met behulp van een nieuwe ingekapselde ligandsubstitutiereactie detecteert deze techniek fosfolipase A 2-geïnduceerde veranderingen in modelmembranen. Deze toegankelijke benadering kan eenvoudig worden geïntegreerd met standaardanalyses en verbetert de resolutie voor het bestuderen van membraanbiofysica en...

Een liposoommembraanpermeabiliteitstest voor het onderzoeken van de effecten van fosfatidylinositolfosfaatgroepen op de membraneutrope werking van gif PLA2

Leer een fluorescente test voor fosfolipide scramblase-activiteit met gereconstitueerde opsine in liposomen. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van eiwitgeïnduceerde lipidentransportmechanismen.

Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity

Meer video's verkennen