Name: Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Leer fluorescentie-anisotropie om eiwit-eiwitinteracties te kwantificeren tussen SBDS en EFL1. Deze methode biedt zowel kwantitatieve als kwalitatieve inzichten voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Auteurs erkennen de financiële steun van CONACyT-projectnummers 167359 en 177138, en van DGAPA-UNAM-projectnummer IN201615.

1. SBDS-flash Tag Protein Expressie en zuivering OPMERKING: Bij de experimenten anisotropie, een FLASH-tag die overeenkomt met de sequentie Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys werd aan de C-terminus van de menselijke SBDS coderende sequentie met PCR toegevoegd. Dit construct werd gesubkloneerd in de expressievector pRSET-A en getransformeerd in Escherichia coli C41 cellen aan een eiwit dat codeert voor een N-eindstandig hexahistidine tag (His-tag) expressie, het humane SBDS coderende sequentie en een C-terminus Flash tag 10. <ol><li> SBDS-flash eiwitexpressie <ol><li> Transformeer competente E. coli C41 cellen met het plasmide pRSET-HisSBDS-flitser met een standaard heat shock-protocol 19. Plaat de cellen in vaste Luria-Bertani (LB) medium aangevuld met 100 ug / ml ampicilline. LB vaste media samenstelling bestaat uit 10 g NaCl, 5 g gistextract, 10 g trypton en 20 g agar voor 1 L volume. </li><li> Cultuur getransformeerde bacteriën bij 37 ° C totabsorptie bij 600 nm (600 A) bereikt 0,5-0,7 in 1 L LB vloeibaar medium aangevuld met 100 ug / ml ampicilline. </li><li> Eiwitexpressie induceren door toevoeging van 0,5 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside 1 aan de kweek en de incubatie voort gedurende nog 5 uur. </li><li> Verzamel de bacteriële suspensie door centrifugeren bij 3800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Op dit punt, hetzij slaan de celpellet bij -20 ° C of het gebruik ervan voor eiwitzuivering. </li></ol></li><li> SBDS-flash eiwitzuivering Opmerking: Alle chromatografische stappen worden uitgevoerd met een snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) -systeem of een peristaltische pomp. Ni 2+ Affiniteit chromatografie maakt gebruik van een 5 ml snelle doorstroming kolom. Anionische uitwisselingschromatografie maakt gebruik van een 5 ml sterke sulfopropyl kationenwisselaar kolom. Een stroomsnelheid van 3 ml / min werd gebruikt voor alle chromatografische stappen. <ol><li> Resuspendeer de cellen in 35 ml Lysis b SBDSUffer (50 mM fosfaatbuffer pH 7,5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool) aangevuld met 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en lyseren door sonicatie gedurende een totale tijdsduur van 4 min met cycli van 10 seconden aan en 30 seconden uit, bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer het monster bij 9000 xg gedurende 50 min bij 4 ° C. </li><li> Houd de bovenstaande vloeistof en gooi de pellet om cellulaire vuil te verwijderen. </li><li> Evenwicht van de Ni 2+ affiniteitskolom met 3 kolomvolumes (CV) van SBDS lysisbuffer en de hele geklaarde supernatant op de kolom te introduceren. </li><li> Verwijder ongebonden eiwit door wassen met 3 CV van SBDS Lysis buffer en geëlueerd met 3 CV van SBDS elutiebuffer (50 mM fosfaatbuffer pH 7,5, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool). </li><li> Verdun het geëlueerde eiwit 6-maal met 50 mM fosfaatbuffer pH 6,5 en verwijder eventuele aggregaten door filtratie door een 0,22 urn cellulose membraan. </li><li> Evenwicht de sulfopropyl kationenwisselaar kolom met 3 CV van Low zout S kolombuffer (50 mM fosfaatbuffer pH 6,5, 50 mM NaCl) en het eiwit introduceren monster van de vorige stap. </li><li> Wassen van ongebonden materiaal met 3 CV van buffer Zoutarme S kolom en elueer het eiwit in één stap met 50 mM fosfaatbuffer pH 6,5, 1 M NaCl. </li><li> Verdun het geëlueerde eiwit 3,3-voudig met 50 mM fosfaatbuffer pH 6,5. Concentreer het eiwit met ultrafiltratie inrichtingen door centrifugeren bij 3800 xg gedurende 15 min. Flash bevriezen het eiwit in vloeibare stikstof en het op -80 ° C tot verder gebruik. </li><li> Controleer de zuiverheid van het eiwit door SDS-PAGE-analyse en Coomassie kleuring 20. </li></ol></li></ol> 2. EFL1 Protein Expressie en zuivering LET OP: EFL1 werd tot expressie gebracht onder de regulering van de Gal 1/10 divergente promotor 21 en de Saccharomyces cerevisiae MAT Een 3&#39;UTR in de vector pRS426. Het recombinante eiwit codeert het humane isovorm EFL1 1 gefuseerd aan een Tobacco Etch Virus protease (TEV) herkenningsplaats en een hexahistidine tag aan het C-terminus. <ol><li> EFL1 eiwitexpressie <ol><li> Transformeer S. BCY123 cerevisiae cellen met het plasmide pRS426-EFL1TevHis met een standaard lithium acetate protocol 22. Plaat alle getransformeerde cellen synthetische uitval medium zonder uracil (SD-URA) aangevuld met 2% (w / v) glucose. Samenstelling van het SD-URA media bestaat uit 8 g gist stikstofbase zonder aminozuren, 11 g casaminozuren, 55 mg adenine sulfaat, 55 mg tyrosine, leucine en 60 mg 60 mg tryptofaan 1 L volume. </li><li> Kweken van de getransformeerde gisten bij 30 ° C tot 600 A 1,8 in 1 liter SD-URA medium aangevuld met 0,5% (w / v) glucose bereikt. </li><li> Eiwitexpressie induceren door toevoeging van 2,8% (w / v) galactose aan de kweek en de incubatie gedurende nog 18 uur voortgezet bij 30 ° C. </li><li> Verzamel de gistsuspensie door centrifugeren bij 3800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.Op dit punt, hetzij slaan de celpellet bij -20 ° C of het gebruik ervan voor eiwitzuivering. </li></ol></li><li> EFL1 eiwitzuivering Opmerking: Alle chromatografische stappen worden uitgevoerd met een FPLC-systeem of een peristaltische pomp. Ni2 + Affiniteit chromatografie maakt gebruik van een 5 ml Fast Flow kolom bij een stroomsnelheid van 3 ml / min. Gelpermeatiechromatografie gebruikt een 125 ml kolom vooraf gepakt met Superdex 200 hars bij een stroomsnelheid van 1 ml / min. <ol><li> Resuspendeer de cellen in 50 ml EFL1 Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool, 5 mM MgCl2, 10% glycerol) aangevuld met 1 mM PMSF en 1 mM benzamidine en verstoren de cellen door wrijving op een bead beater gebruikt glasparels (Ø = 0,5 mm) voor een totale tijd van 6 min met cycli van 2 minuten aan en 15 minuten uit, bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer het monster bij 9000 xg gedurende 50 min bij 4 ° C. </li><li> Houd de bovenstaande vloeistof en gooi de pellet om cellulaire vuil te verwijderen. </li&gt; <li> Equilibreren de affiniteitskolom Ni2 + met 3 CV van EFL1 lysisbuffer en voeren alle geklaarde supernatant op de kolom. </li><li> Verwijder ongebonden eiwit door wassen met 3 CV van EFL1 Lysis buffer en geëlueerd met 3 CV van EFL1 elutiebuffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool, 5 mM MgCl2, 10% glycerol). </li><li> Equilibreren de gelfiltratiekolom met 1,5 CV anisotropie buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 5 mM β-mercaptoethanol). </li><li> Concentreren 1 ml EFL1 het eiwit geëlueerd uit de Ni2 + affiniteitskolom met ultrafiltratie inrichtingen door centrifugatie bij 3800 xg om het gewenste volume. Voeren het monster op de gelfiltratiekolom. </li><li> Verzamel de geëlueerde eiwit en concentreren door ultrafiltratie tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 30 uM. Flash bevriezen het eiwit in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot verder gebruik. Controleer the zuiverheid van het eiwit door SDS-PAGE-analyse en Coomassie kleuring 20. </li></ol></li></ol> 3. Etikettering van SBDS-flitser met de Flash-fluorescerende kleurstof 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-vl) Fluoresceïne <ol><li> Meng 3 nmol van de SBDS-FLASH eiwit met 3 nmol van de 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluoresceïne kleurstof in 5 ui volume anisotropie buffer. </li><li> Laat de reactie verlopen gedurende 8 uur bij 4 ° C. Dialyseren het monster tegen Anisotropy buffer &#39;s nachts naar de vrije kleurstof te verwijderen. </li><li> Gebruik de Lambert-Beer wet om het% van gemerkt eiwit te kwantificeren. Meet de absorptie bij 280 nm en 508 nm in een spectrofotometer met een kwarts cuvet van passende omvang. LET OP: Houd rekening met de volgende molaire absorptie coëfficiënten (M -1 cm -1): <img alt="Equation1B" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1B.jpg" /></li><li> Bereken de concentratie van gelabeld SBDS-flash-eiwit met behulp van Vergelijking 2. <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq2.jpg" /></li><li> Bereken de concentratie van de totale SBDS eiwit met behulp van Vergelijking 3 door het vervangen van de berekende C SBDS-flits van vorige stap. <img alt="Equation3" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq3.jpg" /></li><li> Bereken het percentage gemerkte eiwitten met behulp van vergelijking 4. <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq4.jpg" /></li></ol> 4. Fluorescentie anisotropie Experimenten OPMERKING: Anisotropie experimenten werden uitgevoerd in een spectrofluorometer uitgerust met een polarisatie toolbox en gegevensverzameling werd uitgevoerd met het programma anisotropie verschaft in de software van de apparatuur. De excitatiegolflengte werd ingesteld op 494 nm met een spectrale bandbreedte van 8 nm en de emissie werd opgenomen met een banddoorlaatfilter van 530 ± 25 nm. Metingen werden uitgevoerd bij 25 ° C in 200 gl cuvet met een lengte 5 mm pad 10. <ol><li><html> In een fluorescentie cuvette, plaats 200 ul 30 nM SBDS-flitser in de anisotropie buffer en titreer 2 pl 30 uM EFL1. Meng goed en laat de reactie staan ​​voor 3 minuten voor het meten van de anisotropie waarde. </li><li> Herhaal stap 4,1 tot een totaal volume van 40 gl EFL1 toegevoegd. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Bij de data op de juiste binding model met behulp van een lineaire kleinste kwadraten regressie algoritme. Vergelijkingen voor de meest voorkomende bindingsmodellen worden in tabel 1. </li><li> Evalueer het beste model dat de interactie tussen de eiwitten beschreven door inspectie van de residuen van de pasvorm 23. Ondersteuning van het gekozen model met extra experimenten. </li></ol> Tabel 1. Gemeenschappelijke eiwit-eiwit interactie binding modellen en de wiskundige vergelijkingen die ze beschrijven.0 / 54640table1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze tabel te bekijken. <img alt="tafel 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640table1.jpg" />

<ol><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li>
<li>Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+of+protein-fragment+complementation+assays+for+studying+and+dissecting+large-scale+and+dynamic+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).</li>
<li>Snider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+protein+interaction+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of protein interaction network mapping.</a> Mol Syst Biol. 11 (12), 848(2015).</li>
<li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFersht%2C+A+%22Structure+and+mechanism+in+protein+science%3A+a+guide+to+enzyme+catalysis+and+protein+folding%22">Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding</a>. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).</li>
<li>Menne, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shwachman-Bodian-Diamond+syndrome+protein+mediates+translational+activation+of+ribosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast.</a> Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).</li>
<li>Boocock, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+SBDS+are+associated+with+Shwachman-Diamond+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome.</a> Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).</li>
<li>Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Guanine+Nucleotide+Exchange+in+the+Elongation+Factor-like+1+%28EFL1%29+GTPase+by+Mutations+in+the+Shwachman-Diamond+Syndrome+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein.</a> J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).</li>
<li>Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanine+nucleotide+exchange+in+the+ribosomal+GTPase+EFL1+is+modulated+by+the+protein+mutated+in+the+Shwachman-Diamond+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy%22">Principles of fluorescence spectroscopy</a>. , Third, Springer US. (2010).</li>
<li>Nishigaki, T., Treviño, C. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNishigaki%2C+T+%22Tools+to+understand+protein-protein+interactions%22">Tools to understand protein-protein interactions</a>. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).</li>
<li>Johnson, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+I+%22The+Molecular+Probes+Handbook%3A+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).</li>
<li>Sabnis, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSabnis%2C+RW+%22Handbook+of+Fluorescent+Dyes+and+Probes%22">Handbook of Fluorescent Dyes and Probes</a>. , Wiley. (2015).</li>
<li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications.</a> J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li>
<li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281 (5374), 269-272 (1998).</li>
<li>Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+labeling+of+proteins%3A+techniques+and+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches.</a> Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li>
<li>West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL1-GAL10+divergent+promoter+region+of+Saccharomyces+cerevisiae+contains+negative+control+elements+in+addition+to+functionally+separate+and+possibly+overlapping+upstream+activating+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences.</a> Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).</li>
<li>Eftink, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+methods+for+studying+equilibrium+macromolecule-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions.</a> Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Substrates+to+the+Central+Pore+of+the+Vps4+ATPase+Is+Autoinhibited+by+the+Microtubule+Interacting+and+Trafficking+%28MIT%29+Domain+and+Activated+by+MIT+Interacting+Motifs+%28MIMs%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs).</a> J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).</li>
<li>Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+natively+unfolded+HIF-1alpha+ODD+domain+to+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53.</a> Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).</li>
<li>Trusch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Region+of+the+Ubiquitin+Regulatory+X+%28UBX%29+Domain-containing+Protein+1+%28UBXD1%29+Modulates+Interdomain+Communication+within+the+Valosin-containing+Protein+p97%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97.</a> J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).</li>
<li>Kamp, F., Beyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+alpha-synuclein+affects+the+lipid+packing+in+bilayers+of+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemsitry%22%5BJournal%5D)">Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles.</a> The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).</li>
<li>Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Intensity%2C+Anisotropy%2C+and+Transient+Dynamic+Quenching+Stopped-Flow+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Spectroscopic+Methods+of+Analysis%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics.</a> Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).</li>
<li>Asano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+between+EFL1+and+SBDS+is+mediated+by+an+intrinsically+disordered+insertion+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain.</a> Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen en hebben geen concurrerende financiële belangen.

De meeste biochemische experimenten eiwitten vereisen niet alleen zuivere eiwit, maar ook grote hoeveelheden daarvan, ongeacht de gebruikte techniek. Daarom worden de voor dit type experimenten eiwitten verkregen door heterologe expressie, zoals het geval was gepresenteerd. Fluorescentie spectroscopie vereist de aanwezigheid van een fluorofoor in het onderzochte molecuul. Aromatische resten vormen de intrinsieke fluoroforen van een eiwit, maar met behulp van hun signaal eiwit-eiwitinteracties compliceert de analyse omda...

Cellen een veelheid van biomacromoleculen die voortdurend met elkaar. Deze associatie ontstaat complexen die deelnemen aan de cellulaire routes die verantwoordelijk zijn voor hun functioneren in signaaltransductie, regulatie van genexpressie en celmigratie onder andere. Alle proteïne-proteïne interacties die optreden in een cel omvatten een netwerk, bekend als interactoom. In Saccharomyces cerevisiae is aangetoond dat meer dan 70% van de eiwitten interagerende partners 1 hebben. Inzicht in de interactoom van een cel en hun functies relevante informatie over de complexiteit en diversiteit van levende organismen. Verschillende methoden zijn beschreven geïdentificeerd en gekarakteriseerd eiwit-eiwit interacties. Verschillende hoog door te zetten methoden zoals gist two-hybrid 2, eiwit-fragment complementatie assays 3, affiniteitszuivering 4 gekoppeld aan massaspectrometrie en eiwitten microarrays worden gebruikt om een interactie 5,6 identificeren. Eenmaal geïdentificeerd, is het nodig om het te bevestigen en kan variëren van geval tot geval. Kenmerkend voor deze experimenten omvatten het verstoren van de interactie zelf op het niveau van de individuele leden van de interactie paar, bijvoorbeeld door gen deletie of overexpressie van één van de eiwitten, en vervolgens naar veranderingen in de eigenschappen of functie van het andere lid van het cellulair niveau. Vervolgens biofysische technieken 7 worden gebruikt om de eiwit-eiwit interactie te karakteriseren op moleculair niveau. Daartoe is de structuur van eiwitcomplexen worden bepaald door röntgenkristallografie, kernspinresonantie en cryo-elektronenmicroscopie terwijl calorimetrie en fluorescentie spectroscopie worden gebruikt om ze kwantitatief en mechanistisch beschrijven. In dit werk werd fluorescentie anisotropie gebruikt als een techniek om de wisselwerking karakteriseren tussen de GTPase EFL1 en SBDS-eiwit. Deze eiwitten deel aan de synthese van ribosomen door het bevorderen van de afgifte van eukaryote initiatie factor 6 van het oppervlak van de 60S ribosomale subeenheid 8. De SBDS eiwit is gemuteerd in een ziekte bekend als de Shwachman-Diamond Syndroom 9 en fungeert als een guanine nucleotide exchange factor voor EFL1 verlagen van de affiniteit voor guanosinedifosfaat 10,11. Disease mutaties in SBDS afschaffing van de interactie met EFL1 en daarmee te voorkomen dat de activering. Fluorescentie anisotropie wordt algemeen gebruikt in biologische toepassingen eiwit-peptide of eiwit-nucleïnezuur interacties te bestuderen. Het is gebaseerd op het principe dat een fluorofoor geëxciteerd met gepolariseerd licht resulteert in een gedeeltelijk gepolariseerde emissie. Fluorescentie anisotropie wordt gedefinieerd door Vergelijking 1: <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1.jpg" /> waar ik vv en ik VH zijn defluorescentie-intensiteiten van de verticaal (VV) en horizontaal (VH) gepolariseerde emissie wanneer het monster is enthousiast met verticaal licht 12 gepolariseerd. Fluorescentie anisotropie is gevoelig voor factoren die de snelheid van de rotatiediffusie van de fluorofoor beïnvloeden en derhalve afhankelijk van de temperatuur, de viscositeit van de oplossing en de schijnbare molecuulgrootte van de fluorofoor. De schijnbare grootte van een eiwit dat een fluorofoor toeneemt bij interactie met een ander eiwit en dergelijke veranderingen kunnen vervolgens worden beoordeeld als een verandering van anisotropie. Meer specifiek zal een fluorofoor die langzaam roteert in oplossing ten opzichte van de fluorescentie levensduur grote I VV waarde en kleine ik VH waarde en dus een relatief grote anisotropie vertonen. Voor fluoroforen die snel in verhouding tot hun fluorescerende leven tuimelen, ik vv en ik VH zal vergelijkbaar zijn en hun anisotropie waarde klein zijn 12 </sup&gt; (Figuur 1). Bovendien, voor een goede anisotropie signaal geluidsmeting, is het noodzakelijk om een ​​fluorofoor een fluorescentie levensduur vergelijkbaar met de rotatiecorrelatietijd van het molecuul van belang hebben. Anders is het niet mogelijk om het verschil in anisotropie tussen vrij proteïne en dat in het complex een accurate. Bijvoorbeeld, de anisotropie van een fluorescerende probe met een levensduur bijna 4 nsec zoals fluoresceïne of rhodamine bevestigd aan een laag gewicht verbinding met 100 Da molecuulgewicht is 0,05. Binding aan een molecuul van 160 kDa zal de anisotropie waarde te verhogen tot 0,29; een verschil dat nauwkeurig kan worden gemeten. Daarentegen zullen dezelfde fluorescerende probe betrokken in een bindingsreactie waarvan de toename van moleculaire grootte varieert van 65 tot 1000 kDa alleen tot een verandering anisotropie van 0,28 tot 0,3, die te klein nauwkeurig te meten. In dit scenario zou een sonde met een levensduur van 400 nanoseconden meer geschikt 12 zijn. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische weergave van de gebruikte fluorescentie anisotropie en de procedure meetapparatuur. Schematische weergave van de gebruikte om een eiwit-eiwit interactie experiment meten van fluorescentie anisotropie te voeren apparatuur. Fluoroforen dat snelle weergave kleine anisotropie die toeneemt bij binding aan een interactie partner tuimelen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Fluorescentietoepassingen vereisen de aanwezigheid van een fluorofoor in elk van de moleculen bestudeerd. Bestuderen eiwit-eiwit interacties zijn er drie type fluoroforen: 1) het tryptofaan residuen in de eiwitten, 2) chemisch gebonden fluoroforen en 3) fluorescerende fusiepartners zoals groen fluorescent eiwit (GFP) en derivatieven. De meeste eiwitten hebben tryptofaan residuen van de structuur, waardoor de gemakkelijkste manier om een ​​interactie te meten is door het bewaken van de veranderingen in de overeenkomstige fluorescentie spectra of door het bewaken veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van het tryptofaan residuen. Evenwel tryptofaan residuen in beide eiwitten compliceert de analyse. Anderzijds, een fluorofoor de fluorescerende eigenschappen veranderen als gevolg van een interactie moet worden op of vlakbij de bindingsplaats en het kan interfereren met de interactie zelf. Dit heeft speciale aandacht nodig bij het gebruik van omvangrijke fluoroforen zoals GFP. Als geen van deze fluoroforen kunnen worden gebruikt voor bindingsstudies moet dan extrinsieke fluoroforen voeren aan die van de betrokken eiwitten. Vele chemisch gesynthetiseerde fluoroforen aanwezig en kunnen covalent worden gehecht aan proteïnen via hun reactieve groepen zoals aminogroepen (zijketen van lysines of N-terminus) en de thiolgroepen in cysteine. Fluorophore derivaten met isothiocyanaat en succinimidyl esters reageren met amidegroepen terwijl joodacetamide en maleimide zijn thiol-reactieve groepen 13. De meest voorkomende kleurstoffen in fluorescentietoepassingen zijn derivaten van de fluoresceïne en de rhodamine groene kleurstoffen, coumarines, BODIPY fluoroforen en Alexa Fluor kleurstoffen. Een gedetailleerde lijst van in de handel verkrijgbare fluoroforen en het gebruik ervan kan worden gevonden in de referenties 14,15. Voor succesvolle labeling, moet de reactieve groep wordt blootgesteld aan het oppervlak van het proteïne, maar door het grote aantal reactieve functionele groepen typisch in polypeptiden is het erg moeilijk om plaatsspecifieke modificatie krijgen. Het eiwit van belang in dit onderzoek SBDS bevat 5 cysteïnes vrij en 33 lysines die kunnen leiden tot multisite labeling. Niet-uniforme etikettering kan de binding beïnvloeden en zal data-analyse compliceren als verschillende fluorofoor moleculen verschillende fluorescentie-intensiteit signalen bij binding kan uitlokken. om overcome dit probleem, gebruikten we de flitser fluorofoor, 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-vl) fluoresceïne aan de site-directe label de SBDS eiwit. Dit is een arseenoxide kleurstof met een hoge affiniteit voor vier cysteïnen gescheiden in een motief bekend als flash-tag bestaat uit de sequentie CCXXCC waarbij X elk aminozuur behalve cysteïne 16,17. Dit tetracysteine ​​motief wordt toegevoegd aan de N- of C-terminus van het eiwit door genetische manipulatie met een geschikte linker aan de verstoring van de algehele vouw van het eiwit te voorkomen. Het paar bestaande uit Flash kleurstof en flash-tag werd oorspronkelijk ontworpen om plaatsspecifieke label eiwitten in levende cellen 17 maar het kan ook worden gebruikt om gezuiverde eiwitten in vitro labelen zoals hier toegelicht. Daarnaast zijn ook enzymatische strategieën ontwikkeld om plaatsspecifieke functionalisering van eiwitten 18 mogelijk. In dit manuscript beschrijven we de bruikbaarheid van een fluorescentie anisotropiesa instrument om eiwit-eiwitinteracties. Binding kan worden beoordeeld door een eenvoudige inspectie van de binding curve vorm, terwijl kwantitatieve informatie kan worden verkregen bij de pasvorm van de experimentele gegevens.

<table><tbody><tr><td>0.5 mm Glass beads</td><td>Biospec Products</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td>Ultra zuiver</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>dye 4&rsquo;,5&rsquo;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>LC6090</td><td>Deze kit bevat de kleurstof om een FlAsH-label te plaatsen</td></tr><tr><td>Ampiciline</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB02040</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose Anhydrous</td><td>Formedium</td><td>GLU03</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Galactose</td><td>Formedium</td><td>GAL03</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Formedium</td><td>DOC0157</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptofan&nbsp;</td><td>Formedium</td><td>DOC0189</td><td></td></tr><tr><td>Bezamidine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-5G</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Gold Biotechnology, Inc</td><td>P-470-25</td><td>Fenylmethylsulfonyl fluoride</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Formedium</td><td>NAC02</td><td>Natrium Chloride&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Tecsiquim, S.A. de C.V.</td><td>GT1980-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>1725711000</td><td>Magnesium Chloride</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Kaliumfosfaat dibasisch</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139-500G</td><td>Natriumfosfaat monobasisch</td></tr><tr><td>Yeast nitrogen base without amino acids</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Formedium</td><td>YEM03</td><td>Micro gegranuleerd</td></tr><tr><td>L-Tyroisne</td><td>Formedium</td><td>DOC0193</td><td></td></tr><tr><td>Adenine sulphate</td><td>Formedium</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>Formedium</td><td>CAS03</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB49182</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>IPTG025</td><td></td></tr><tr><td>Filtration units</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>UFC901096</td><td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL membraan, 10&nbsp;kDa</td></tr><tr><td>Membrane Filter</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>GSWP04700</td><td>Membraanfilter, gemengde cellulose esters, Hydrofiel, 0.22&nbsp;&micro;m, 47&nbsp;mm, wit, vlak</td></tr><tr><td>Ni2+ affinity column</td><td>QIAGEN</td><td>30760</td><td>Cartridge vooraf gevuld met 5&nbsp;ml Ni-NTA Superflow</td></tr><tr><td>Strong Sulfopropyl cation exchanger column</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5157-01</td><td>HiTrap SP Sepharose FF 5 ml</td></tr><tr><td>Size Exclusion column</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>Fluorescence cell</td><td>Hellma Analytics</td><td>111-057-40</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6860AA</td><td>Cary 60 UV-Vis</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>SHKA4000-7</td><td>MaxQ 4000 Benchtop temperatuurbereik Ambient-15&deg; tot 60&deg;C</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004271</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td></tr><tr><td>FPLC</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>Discontinued</td><td>FPLC systeem geleidbaarheid UV-MM II monitor P500 pomp fractie</td></tr><tr><td>Spectrofluorometer</td><td>Olis</td><td>Geen toepassing</td><td>Olis DM 45 met polarisatie Toolbox</td></tr></tbody></table>

fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Eiwit-eiwit interacties spelen een essentiële rol in de functie van een levend organisme. Zodra een interactie geïdentificeerd en gevalideerd moet worden karakteriseren de structurele en mechanistische niveau. Verschillende biochemische en biofysische methoden bestaan ​​voor een dergelijk doel. Onder hen, fluorescentie anisotropie is een krachtige techniek bijzonder gebruikt wanneer de fluorescentie-intensiteit van een fluorofoor gemerkt eiwit constant op eiwit-eiwit interactie blijft. In deze techniek, een fluorofoor-gemerkte eiwit wordt geëxciteerd met verticaal gepolariseerde licht van een geschikte golflengte die selectief exciteert een deel van de fluoroforen volgens hun relatieve oriëntatie van de inkomende straal. De resulterende emissie heeft ook een richtingsgevoeligheid wiens relatie in de verticale en horizontale vlakken definieert anisotropie (r) als volgt: r = (I -I VV VH) / (I + 2I VV VH), waarin I en I VV <sub&gt; VH de fluorescentie-intensiteiten van de verticale en horizontale componenten resp. Fluorescentie anisotropie is gevoelig voor de rotatiediffusie van een fluorofoor, namelijk de schijnbare molecuulgrootte van een fluorofoor gekoppeld aan een eiwit, die wordt veranderd van eiwit-eiwit interactie. In de onderhavige tekst wordt het gebruik van fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwitinteracties werd geïllustreerd met de binding tussen het eiwit gemuteerd in de Shwachman-Diamond Syndroom (SBDS) en elongatiefactor like-1 GTPase (EFL1) adres. Conventioneel, labeling van een eiwit met een fluorofoor op de thiolgroepen (cysteine) of de aminogroepen (de N-eindstandige amine of lysine) van het eiwit uitgevoerd. Echter, SBDS bezit meerdere cysteïnes en lysinen die niet gerichte etikettering ervan toestond. Als een alternatieve techniek, de kleurstof 4, werd 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluoresceïne gebruikt om specifiek label een tetracysteine ​​motief, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetisch gemanipuleerde in de C-terminus van het recombinante eiwit SBDS. Montage van de experimentele gegevens kwantitatieve en mechanistische informatie over de binding mode tussen deze eiwitten.

Om anisotropie experiment uitvoert is het belangrijk uit te sluiten grote veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van de fluorofoor aangezien de waargenomen anisotropie van een mengsel van species wordt vertegenwoordigd door Vergelijking 5: <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq5.jpg" /> waarin F i de fractionele fluorescen...

Eiwit interacties vormen de kern van de functie van een cel. Calorimetrische en spectroscopische technieken worden gewoonlijk gebruikt om ze te karakteriseren. Hier beschrijven we fluorescentie anisotropie als middel om de interactie tussen het eiwit gemuteerd in de Shwachman-Diamond Syndroom (SBDS) en elongatiefactor-1 achtige GTPase (EFL1) te bestuderen.

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Het algemene doel van dit experiment is om de interactie tussen twee eiwitten van belang te evalueren en te kwantificeren met behulp van fluorescentie-anisotropie. Deze metingen kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de eiwitbiochemie en eiwitbiofysica, zoals bij eiwitten waarvan de interacties essentieel zijn voor de cellulaire functie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we zowel kwantitatieve als kwalitatieve informatie over de eiwit-eiwitinteractie kunnen verkrijgen. Om gezuiverd SBDS-FlAsH-eiwit te verkrijgen, bereid eerst één liter LB vloeibaar medium voor, aangevuld met 100 µg/mL ampicilline. Kweek daarin de getransformeerde bacteriën bij 37 °C totdat de optische dichtheid bij 600 nm een waarde van 0,5 tot 0,7 bereikt.Induceer de expressie van het SBDS-FlAsH-eiwit door 0,5 millimol IPTG aan de kweek toe te voegen en zet de incubatie voort voor nog vijf uur. Verzamel vervolgens de bacteriële suspensie door centrifugatie bij 3800 ×g gedurende tien minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant.Resuspendeer de cellen in 35 milliliters SBDS lysisbuffer aangevuld met één millimolair PMSF. Lyseer door middel van sonicatie gedurende een totale tijd van vier minuten, met cycli van tien seconden aan en 30 seconden uit bij vier graden Celsius. Centrifugeer vervolgens het monster bij 9.000 times G gedurende 50 minuten bij vier graden Celsius.Bewaar het supernatant en verwijder de pellet om celdebris te elimineren. Nadat de nikkelaffiniteitskolom is geëquilibreerd met drie kolomvolumes SBDS lysisbuffer, wordt het volledige geklaarde supernatant op de kolom aangebracht. Verwijder het ongebonden eiwit door te wassen met drie kolomvolumes SBDS lysisbuffer.Elueer na het wassen van de kolom het gebonden eiwit met drie kolomvolumes SBDS-elutiebuffer. Om het eiwit verder te zuiveren, wordt de sulfopropyl-kationenwisselaar kolom geëquilibreerd met drie kolomvolumes Low salt S-kolombuffer. Verdun het eiwit zesvoudig met 50 millimolair fosfaatbuffer pH 6,5 en breng dit aan op de kolom.Was het ongebonden materiaal met drie kolomvolumes Low salt S column buffer. Elueer vervolgens het eiwit in één stap door 50 millimolar fosfaatbuffer pH 6,5 met één molar natriumchloride op de kolom toe te voegen. Verdun het eluaat drievoudig met 50 millimolar fosfaatbuffer pH 6,5.Concentreer vervolgens het eiwit met ultrafiltratie-apparatuur door centrifugatie bij 3800 ×g gedurende vijftien minuten. De kwaliteit van de eiwitten die in dit type experiment worden gebruikt, is zeer kritisch. De interpretatie van de gegevens wordt bemoeilijkt als de gebruikte eiwitmonsters niet van hoge zuiverheid zijn.Verifieer de zuiverheid van het SBDS-FlAsH-eiwit via SDS-PAGE-analyse en Coomassie-kleuring. Bevries het eiwit snel in vloeibare stikstof en bewaar het bij -80 °C tot aan verder gebruik. Om gezuiverd EFL1-eiwit te verkrijgen, wordt eerst getransformeerde gist gekweekt bij 30 °C in één liter synthetisch drop-out medium zonder uracil, aangevuld met 0,5% glucose, totdat de optische dichtheid bij 600 nm 1,8 bereikt.Induceer de eiwitexpressie door 2,8 procent galactose aan de cultuur toe te voegen en zet de incubatie voort gedurende 18 uur bij 30 °C. Verzamel de gist-suspensie door centrifugatie bij 3800 ×g gedurende tien minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant na centrifugatie.Resuspendeer de cellen in 50 milliliters EFL1 lysiebuffer aangevuld met één millimolar PMSF en één millimolar benzamidine. Disrupt de cellen door wrijving in een bead-beater met glaskralen gedurende een totale tijd van zes minuten, waarbij cycli van twee minuten aan en vijftien minuten uit worden gebruikt bij vier graden Celsius. Centrifugeer vervolgens het monster bij 9 000 times G gedurende 50 minuten bij vier graden Celsius.Bewaar het supernatant en gooi het pellet weg om celresten te verwijderen. Equilibreer vervolgens de nikkelaffiniteitskolom met drie kolomvolumes EFL1-lysebuffer. Breng het volledige geklaarde supernatant aan op de geëquilibreerde kolom.Nadat ongebonden eiwit is verwijderd door de kolom te wassen met drie kolomvolumina EFL1 lysisbuffer, wordt het gebonden eiwit geëlueerd met drie kolomvolumina EFL1 elutiebuffer. Om het EFL1-eiwit verder te zuiveren, wordt de grootte-uitsluitingskolom geëquilibreerd met 1,5 kolomvolumina Anisotropy-buffer. Concentreer het van de nikkelaffiniteitskolom geëlueerde EFL1-eiwit tot één milliliter met ultrafiltratieapparaten door centrifugatie bij 3800 ×g. Breng vervolgens het geconcentreerde monster aan op de grootte-uitsluitingskolom.Verzamel het geëlueerde eiwit en concentreer dit door ultrafiltratie tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 30 micromolar. Verifieer de zuiverheid van het EFL1-eiwit via SDS-PAGE-analyse en Coomassie-kleuring. Vries het eiwit snel in met vloeibare stikstof en bewaar het bij minus 80 graden Celsius tot verder gebruik.Meng drie nanomool SBDS-FlAsH-eiwit met drie nanomool lumio-groene kleurstof in een volume van vijf micrometer anisotropiebuffer. Laat de reactie acht uur lang plaatsvinden bij vier graden Celsius. Dialyseer het monster na acht uur gedurende de nacht tegen de anisotropiebuffer om de vrije kleurstof te verwijderen.Meet de absorptie bij 280 nanometer en 508 nanometer in een spectrophotometer met behulp van een kwartscuvet. Gebruik vervolgens de wet van Lambert-Beer om het percentage gelabeld eiwit te kwantificeren, zoals beschreven in het tekstprotocol. Voordat de anisotropiewaarde wordt gemeten, moet elke filtratiestap van de eiwitfractie zorgvuldig worden uitgevoerd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de volledige monsterhoeveelheid in de oplossing wordt gebracht en homogeen wordt.Plaats 200 µL 30 nM SBDS-FlAsH in anisotropiebuffer in een fluorescentiecuvette en titreer twee µL 30 µM EFL1. Meng grondig en laat de reactie drie minuten staan voordat de anisotropie- en fluorescentiewaarde worden gemeten. Herhaal dit proces totdat er in totaal een volume van 40 µL EFL1 is toegevoegd.Als laatste stap worden de gegevens gefit aan een verondersteld bindingsmodel, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om elk anisotropie-experiment uit te voeren, is het belangrijk om grote veranderingen in de fluorescentie-intensiteit uit te sluiten. Zoals hier getoond, verandert de fluorescentie van SBDS-FlAsH niet merkbaar bij binding aan EFL1.Titratie van EFL1 in een kwartscuvet met SBDS-FlAsH resulteert in een toename van de initiële waargenomen anisotropie. Verschillende toevoegingen van EFL1 beschrijven de bijbehorende bindingscurve, die middels niet-lineaire kleinste-kwadratenregressie kan worden gefit aan een verondersteld bindingsmodel. In dit geval beschrijft een model met één bindingsplaats de experimentele gegevens niet adequaat.In plaats daarvan beschrijft een model met twee niet-identieke bindingsplaatsen de experimentele gegevens wel adequaat. Zodra de techniek onder knie is, kan het fluorescentie-anisotropie-bindingsexperiment in drie uur worden voltooid, mits het correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om over grote hoeveelheden gezuiverd eiwit te beschikken.Parallel aan deze procedure kunnen andere methoden, zoals een fragment-gebaseerde complementatie-assay of fluorescentie-anisotropie met verschillende domeinen van het bestudeerde eiwit, worden uitgevoerd om het passende bindingsmodel te ondersteunen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van een bindingsexperiment gevolgd door fluorescentie-anisotropie.

fluorescence-anisotropy-as-tool-to-study-protein-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

This video demonstrates the use of fluorescence fluctuation spectroscopy to detect the interaction among cell surface proteins at cell-cell contacts. By expressing the transmembrane adhesion receptor of interest labeled with a fluorescent protein and mixing two different cell populations harboring two spectrally separated fluorescent labels, the trans-interaction between the receptors of two neighboring cells with different-colored fluorescence is assessed via cross-correlation in the...

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Interaction at Cell Contacts

This video demonstrates the technique of fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) to study protein homo-oligomerization. Fluorescently-labeled proteins in a sample are dimerized using an agent when studying protein oligomerization using FFS. Using a confocal microscope, as the proteins move in and out of the small observation volume, the analysis of the fluctuations in the brightness of the fluorescent molecules is performed to determine the oligomeric state of the proteins.

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Homo-Oligomerization

In this video, we describe the fluorescence anisotropy technique to study the interactions between the fluorophore-tagged Shwachman-diamond syndrome (SBDS) protein and the elongation factor-like 1 GTPase (EFL1). On incubating SBDS proteins with gradually increasing concentrations of EFL1, a steady increase in anisotropy is observed, indicating a successful interaction between the two proteins.

Fluorescence Anisotropy-Based Detection of Protein-Protein Interactions

This video describes high-performance fluorescence anisotropy that helps to monitor the interaction between transcription factors and DNA. The assay monitors the interactions of a fluorophore-labeled DNA molecule with its specific transcription factor by measuring the degree of polarization due to molecular rotation or anisotropy of the fluorophore-labeled DNA.

Fluorescence Anisotropy to Determine Transcription Factor-DNA Binding Affinity

Hier presenteren we een protocol om gegevens van de drie kleuren smFRET en haar analyse met een 3D ensemble verborgen Markov Model te verkrijgen. Met deze benadering kunnen wetenschappers kinetische informatie ophalen uit complexe eiwit systemen, met inbegrip van Allosterie of gecorreleerde interacties.

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Dit protocol beschrijft een kalibratie-vrije aanpak voor het kwantificeren van eiwit homo-oligomerisatie in vitro op basis van fluctuatiemarges Fluorescentiespectroscopie met behulp van commerciële licht scanning microscopie. De juiste overname-instellingen en de analysemethoden worden weergegeven.

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee fluorofoormoleculen kan worden gebruikt voor het bestuderen van eiwitinteracties in de levende cel. Hier wordt een protocol gegeven over hoe FRET in levende cellen kan worden gemeten door het detecteren van gesensibiliseerde emissie van de acceptor en het blussen van het donormolecuul met behulp van confocale laserscanmicroscopie.

Beoordeling van eiwitinteracties in levende cellen met FRET-gesensibiliseerde emissie

We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Hier presenteren we het protocol om de lokale flexibiliteit en dynamiek van biomoleculen te bestuderen met behulp van tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie op het niveau van één molecuul in confocale microscopiemodus.

Tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie van afzonderlijke moleculen voor het karakteriseren van lokale flexibiliteit in biomoleculen

Leer fluorescentie-anisotropie om eiwit-eiwitinteracties te kwantificeren tussen SBDS en EFL1. Deze methode biedt zowel kwantitatieve als kwalitatieve inzichten voor celbiologisch onderzoek.

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Meer video's verkennen