Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow
4 november 2016
Wij rapporteren een protocol met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering met plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) met hoge zuiverheid uit het beenmerg van lupus-muizen gevoelig voor functionele studies pDC isoleren.
Het algemene doel van dit experiment is om plasmacytoide dendritische cellen, of PDC, met een hoge zuiverheid te isoleren uit het beenmerg van lupus-gevoelige muizen voor de studie van hun functie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot de kenmerken van een specifieke immuuncelpopulatie, zoals interferon-alfa producerende PDC tijdens het late stadium van lupusontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een tot meerdere doelpopulaties kunnen worden verrijkt tot een hogere zuiverheid dan met magnetische kralensortering.
Na het oogsten, breng de achterpootbotten en vier milliliter compleet medium over in een mortel. Voeg zes milliliter vers compleet medium toe om het totale volume op 10 milliliter te brengen. En breek de botten voorzichtig met een stamper.
Roer voorzichtig met de stamper om het beenmerg vrij te maken. Breng vervolgens al het medium over door een 70 micron zeef in een 50 milliliter conische buis op ijs. Voeg 10 milliliter vers compleet medium toe aan de mortel.
En filter het supernatant nog twee keer totdat de botten wit lijken. Centrifugeer vervolgens de beenmergcellen en suspendeer het pellet in 10 milliliter vers compleet medium. Breng vervolgens de cellen aan op vijf milliliter vers bereid dichtheidsgradiëntmedium in een 15 milliliter conische buis, zorg ervoor dat de lagen niet worden verstoord.
En scheid de cellen door centrifugatie. Vervolgens verwijdert u voorzichtig de bovenste acht milliliter van de oplossing en verzamelt u de twee milliliter buffycoat op de grensvlak. Voeg 12 milliliter ijskoud compleet medium toe aan de geïsoleerde mononucleaire cellen en sluit de buis om te mengen door omdraaiing.
Pellet vervolgens de cellen door centrifugatie. Om de cellen te kleuren voor FACS, suspendeer ze opnieuw in 100 microliter CD1632FC-blokkerend antilichaam bij vier graden Celsius. Was de cellen na 10 minuten in vier milliliter ijskoud sorteerbuffer en label de cellen met 100 microliter van het juiste celoppervlak kleuringsantilichaamcocktail.
Gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in het donker. Was de cellen in vier milliliter ijskoud sorteerbuffer om eventuele ongebonden fluorescentie geconjugeerde antilichamen te verwijderen. Suspendeer vervolgens het pellet in 500 microliter FACS-laadoplossing en breng het monster over in een FACS-buis op ijs.
Om de compensatiecontroles te kleuren, verdeel eenmaal 10 tot zesde splenocyten per buis. Was de cellen met vier milliliter sorteerbuffer en suspendeer de pellets in 100 microliter sorteerbuffer. Voeg vervolgens het juiste fluorescentie geconjugeerde antilichaam van de master celoppervlak antilichaamcocktail toe aan elke bijbehorende compensatiebuis en schud de buizen om te mengen.
Na 15 minuten in het donker, bij vier graden Celsius, was alle monsters met sorteerbuffer en suspendeer de pellets in 500 microliter ijskoude sorteerbuffer. Behalve de DAPI-buis, die wordt gesuspendeerd in 500 microliter FACS-laadoplossing. Om de doelcelpopulatie te zuiveren door middel van door fluorescentie geactiveerde celsortering, laad collectiebuizen met 500 microliter FBS aangevuld met antibiotica onder de sorteerkleppen.
Laad vervolgens de ongekleurde buis en verzamel 10.000 gebeurtenissen om de negatieve poort voor elke fluorescentie-intensiteit in te stellen. En 10.000 gebeurtenissen in de enkele kleuringscompensatiebuizen om de positieve poort voor elke fluorescentie-intensiteit in te stellen. Verzamel 3.000 gebeurtenissen van het experimentele monster om de poorten van de gesorteerd celpopulatie in te stellen.
Gebruik de fluorescentie-intensiteiten als de parameters van de X- en Y-toegangsgrafiek om handmatig de doelcelpopulatie te richten. Sorteer vervolgens de doelcelpopulatie in de collectiebuis. Voeg aan het einde van het sorteren tot vier milliliter ijskoud compleet medium toe aan de cellen.
Dicht vervolgens de buis af en meng de cellen door omdraaiing. Centrifugeer de gezuiverde cellen, aspireer alles behalve de laatste 200 microliter van het supernatant. Suspendeer vervolgens het pellet in één milliliter ijskoud compleet medium en breng de cellen over in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis voor een tweede centrifugatie.
Aspireer tenslotte alles behalve de laatste 100 microliter van het supernatant en bewaar de gesorteerd celpopulatie op ijs tot gebruik. Magnetische geactiveerde celsortering van beenmerg plasmacytoide dendritische cellen van lupus-gevoelige muizen resulteert in slechts een zuiverheid van 7,75% na de verrijking. FACS verrijkte plasmacytoide dendritische cellen tonen echter een zuiverheid van wel 96,4% na sortering.
Om een hoge zuiverheid te garanderen, worden de mononucleaire beenmergcellen eerst gepoort en gescheiden van puin door voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsparameters. Met behulp van voorwaartse verstrooiingsbreedte versus voorwaartse verstrooiingshoogte en zijwaartse verstrooiingsbreedte versus zijwaartse verstrooiingshoogte, worden de enkele cellen verder gepoort om de valse positieve signalen te vermijden die worden geproduceerd door aggregaten. De levende enkele DAPI-negatieve cellen worden vervolgens gepoort op basis van hun CD11c-positieve, CD11B-negatieve celoppervlakte-expressie, waardoor verdere poorting van de B220-positieve, PDCA-1-positieve doelbeenmergplasmacytoide dendritische celpopulatie mogelijk is.
De gesorteerd PDC-populatie is niet alleen van hoge zuiverheid, maar ook functioneel normaal met de capaciteit om IFNalpha te produceren bij CPG-stimulatie in vitro. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de botten te breken en het vrijgemaakte beenmerg voorzichtig te roeren om de cellevensvatbaarheid te behouden. Volgend op deze procedure kunnen andere methoden zoals RNA-sequencing of in vitro cultuur en stimulatie worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de genexpressie of functie van verrijkte celpopulaties te beantwoorden.
Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor PDC-onderzoekers om de rol van deze krachtige cel in de ontwikkeling van lupus en lupus-gevoelige muismodellen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een sterk gezuiverde PDC-pop
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het isoleren van plasmacytoïde dendritische cellen (pDC) uit het beenmerg van lupus-gepredisponeerd muizen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering. De methode heeft als doel hoge zuiverheid te bereiken voor daaropvolgende functionele studies van pDC.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Autoimmuniteit
Achtergrond
- Plasmacytoïde dendritische cellen zijn cruciaal voor immuunresponsen.
- Ze produceren interferon alfa, vooral tijdens lupus progressie.
- Hoge zuiverheid isolatie is essentieel voor nauwkeurige functionele analyse.
- Fluorescentie-geactiveerde celsortering biedt voordelen boven traditionele methoden.
Doel van Studie
- Om pDC te isoleren van lupus-gepredisponeerd muizen.
- Om de functionele kenmerken van pDC te bestuderen.
- Om het begrip van immuuncelgedrag bij lupus te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Het oogsten van beenmerg van lupus-gepredisponeerd muizen.
- Het gebruik van fluorescentie-geactiveerde celsortering voor isolatie.
- Het voorbereiden van compleet medium voor celverwerking.
- Het kraken van botten om cellen vrij te maken voor sortering.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle isolatie van pDC met hoge zuiverheid.
- Verbeterd begrip van pDC functie bij lupus.
- Aangetoonde voordelen van fluorescentie-geactiveerde celsortering.
- Een betrouwbaar protocol geleverd voor toekomstige studies.
Conclusies
- Het protocol isoleert effectief pDC voor functionele studies.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van lupus pathologie.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methodologie.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Isolating rare immune cell populations with high purity is critical for mechanistic de-risking in target validation and preclinical model development. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables precise phenotypic separation of plasmacytoid dendritic cells from lupus-prone mouse bone marrow, supporting reliable functional assays and translational biomarker discovery. This approach reduces biological noise in early discovery, improving predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of plasmacytoid dendritic cell function in lupus pathogenesis by isolating a pure population for interferon alpha production studies.
- Operational Value: Achieves up to 96.4% purity post-sorting, significantly exceeding magnetic-activated cell sorting alternatives.
- Strategic Value: Supports target confidence by reducing cellular heterogeneity in functional readouts, aiding go/no-go decisions in immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified plasmacytoid dendritic cells suitable for in vitro stimulation assays, such as CpG-induced interferon alpha measurement.
- Operational Value: Permits simultaneous separation of multiple cell populations, increasing experimental throughput and assay standardization.
- Strategic Value: Creates a reproducible input for screening workflows, enabling reliable compound evaluation against defined immune phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system using lupus-prone mouse models to study plasmacytoid dendritic cell contributions to autoimmunity.
- Operational Value: Isolated cells remain functionally normal, capable of interferon alpha production upon stimulation, validating assay readiness.
- Strategic Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by supplying well-characterized primary cells for mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early target validation through phenotypic screening and enabling lead identification via functional readouts in purified immune cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating plasmacytoid dendritic cells to clarify their role in interferon-driven lupus pathology.
- Screening: Delivers standardized, high-purity cell populations for reproducible functional assays and compound screening.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements such as cytokine production, flow cytometry readouts, and purity assessment via forward/side scatter gating.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of lupus-prone mice, aligning with mechanistic de-risking in autoimmune disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating rare immune cells across multiple immunology and autoimmunity projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduction of mechanistic ambiguity in immune cell function studies.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined gating strategies and compensation controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions and reduced late-stage biological risk in immunomodulator development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable preclinical data from purified cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell staining, and compensation controls for accurate fluorescence-activated cell sorting.
- Dependent on instrumentation including flow cytometers, sorting equipment, and centrifugation systems for bone marrow processing.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, gating strategies, and sorting protocols across immunology and assay development groups.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other model systems or tissue sources beyond mouse bone marrow.
- Includes practical limitations such as the need for gentle bone marrow disruption to preserve cell viability and the time-intensive nature of multi-step purification.
