Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

Het algemene doel van dit experiment is om plasmacytoïde dendritische cellen, of PDC, met een hoge zuiverheid te isoleren uit het beenmerg van lupus-gevoelige muizen voor de studie naar hun functie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de kenmerken van een specifieke immuuncelpopulatie, zoals interferon-alfa producerende PDC tijdens de late fase van de lupusontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat één of meerdere doelpopulaties tot een hogere zuiverheid kunnen worden verrijkt dan met magnetische bead-sortering.

Breng na het oogsten de achterpoten en vier milliliter volledig medium over naar een vijzel. Voeg zes milliliter vers volledig medium toe om het totale volume op 10 milliliter te brengen. Verbrijzel de botten vervolgens voorzichtig met een stamper.

Roer voorzichtig met de stamper om het beenmerg vrij te maken. Breng vervolgens het volledige medium door een zeef van 70 micron over in een conische buis van 50 milliliter op ijs. Voeg 10 milliliter vers compleet medium toe aan de vijzel.

Filter het supernatant nog twee keer totdat de botten wit kleuren. Centrifugeer vervolgens de beenmergcellen en resuspendeer de pellet in 10 milliliters vers compleet medium. Breng de cellen daarna zorgvuldig in laagjes aan op vijf milliliters vers bereid dichtheidsgradiëntmedium in een 15 milliliter conische buis, waarbij u erop let dat de lagen niet worden verstoord.

Scheid de cellen vervolgens door middel van centrifugatie. Verwijder daarna voorzichtig de bovenste acht milliliter van de oplossing en verzamel de twee milliliter buffy coat bij de interfase. Voeg 12 milliliter ijskoude compleet medium toe aan de geïsoleerde mononucleaire cellen en sluit de buis af om door inversie te mengen.

Pellet vervolgens de cellen door middel van centrifugatie. Om de cellen te kleuren voor FACS, resuspendeert u deze in 100 microliters CD1632FC blokkerend antilichaam bij vier graden Celsius. Was de cellen na 10 minuten in vier milliliters ijskoude sorteerbuffer en label de cellen met 100 microliters van het passende cocktail van celoppervlak-kleuringsantilichamen.

Gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in het donker. Was de cellen in vier milliliter ijskoude sorteerbuffer om eventuele niet-gebonden fluorescentie-geconjugeerde antilichamen te verwijderen. Resuspendeer het pellet vervolgens in 500 microliter FACS-laadoplossing en breng het monster op ijs over in een FACS-buis.

Om de compensatiecontroles te kleuren, worden 1 x 10⁶ miltcellen per buis gealiquoteerd. Was de cellen met 4 mL sorteerbuffer en resuspendeer de pellets in 100 µL sorteerbuffer. Voeg vervolgens het juiste fluorescentie-geconjugeerde antilichaam uit de master-cocktail voor celoppervlakte-antilichamen toe aan elke corresponderende compensatiebuis en schud de buizen om te mengen.

Na 15 minuten in het donker, bij vier graden Celsius, worden alle monsters gewassen met sorteerbuffer en worden de pellets opnieuw gesuspendeerd in 500 µL ijskoude sorteerbuffer. Behalve de DAPI-buis, die opnieuw wordt gesuspendeerd in 500 µL FACS-laadoplossing. Om de doelcelpopulatie te zuiveren middels fluorescence activated cell sorting, worden opvangbuisjes met 500 µL FBS aangevuld met antibiotica onder de sorteerkleppen geplaatst.

Laad vervolgens de ongekleurde buis en verzamel 10 000 events om de negatieve gate voor elke fluorescentie-intensiteit in te stellen. Verzamel daarnaast 10 000 events in de buizen met enkelvoudige kleuring voor compensatie om de positieve gate voor elke fluorescentie-intensiteit vast te stellen. Verzamel 3 000 events van het experimentele monster om de gates voor de gesorteerde celpopulatie in te stellen.

Gebruik de fluorescentie-intensiteiten als parameters voor de X- en Y-as van de grafiek om de doelcelpopulatie handmatig te gaten. Sorteer vervolgens de doelcelpopulatie in de opvangbuis. Voeg aan het einde van de sortering tot vier milliliter ijskoud compleet medium toe aan de cellen.

Sluit vervolgens de buis met een dop en meng de cellen door deze om te keren. Pelleteer de gezuiverde cellen door centrifugatie en aspireer al het supernatant, behalve de laatste 200 µL. Resuspendeer de pellet vervolgens in één milliliter ijskoud compleet medium en breng de cellen over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis voor een tweede centrifugatie.

Pipetteer tot slot al het supernatant weg, behalve de laatste 100 µL, en bewaar de gesorteerde celpopulatie op ijs tot gebruik. Magnetische geactiveerde cel sortering van plasmacytoïde dendritische cellen uit beenmerg van lupus-gevoelige muizen resulteert na verrijking in een zuiverheid van slechts 7,75%. FACS-verrijkte plasmacytoïde dendritische cellen vertonen echter een zuiverheid tot wel 96,4% na sortering.

Om een hoge zuiverheid te waarborgen, worden de mononucleaire beenmergcellen eerst gegated en gescheiden van debris op basis van forward scatter- en side scatter-parameters. Met behulp van forward scatter width versus forward scatter height en side scatter width versus side scatter height worden de enkelvoudige cellen verder gegated om fout-positieve signalen veroorzaakt door aggregaten te vermijden. De levende, enkelvoudige DAPI-negatieve cellen worden vervolgens gegated op hun CD11c-positieve, CD11B-negatieve celoppervlakexpressie, wat verdere gating mogelijk maakt van de B220-positieve, PDCA-1-positieve doelpopulatie van plasmacytoïde dendritische cellen uit het beenmerg.

De gesorteerde PDC-populatie is niet alleen van een hoge zuiverheid, maar ook functioneel normaal, met het vermogen om IFNalpha te produceren na CPG-stimulatie in vitro. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de botten te breken en het vrijgekomen beenmerg voorzichtig te roeren om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals RNA-sequencing of in vitro kweek en stimulatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de genexpressie of functie van de verrijkte celpopulaties te beantwoorden.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor PDC-onderzoekers om de rol van deze krachtige cel te onderzoeken bij de ontwikkeling van lupus en lupus-gevoelige muismodellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een hooggezuiverde PDC-populatie kunt isoleren uit het beenmerg van lupus-gevoelige muizen.