Name: Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer plasmacytoïde dendritische cellen isoleren uit beenmerg van lupusgevoelige muizen met fluorescentie-geactiveerde cel sortering. Deze methode bereikt hoge zuiverheid voor functionele studies van immuuncellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken het Flow Cytometry Laboratory aan het Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine voor het gebruik van de flow cytometry core facility. Dit werk werd ondersteund door de opstartfondsen van XML. XL is een Stamps Fellow in het Biomedical and Veterinary Sciences graduate programma.

LET OP: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / LPR) lupus vatbaar voor muizen werden gekweekt en onderhouden in een specifiek pathogeen-vrije faciliteit volgens de eisen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) op Virginia Tech (Animal Welfare Assurance-nummer: A3208-01). Dit onderzoek is uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd onder IACUC protocol # 12-062. 1. celkweekmedium en sorteren Buffer <ol><li> Bereid volledig celkweekmedium (C10) gebruikt RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1 mM natriumpyruvaat, 1% 100 MEM niet-essentiële aminozuren, 10 mM HEPES, 55 pM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine en 100 U / ml penicilline-streptomycine. </li><li> Bereid sorteren buffer (HBSS-vol) met behulp 1x Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), aangevuld met 10 mM HEPES, 2,5 mg / ml runderserumalbumine,0,05 mM MgCl2 en 0,2 U / ml DNase I. </li></ol> 2. Mouse Dissection <ol><li> Bereid twee 6-cm diameter gerechten met 4 ml C10. Leg de gerechten op ijs. </li><li> Euthanaseren de muis door CO 2 inhalatie. </li><li> Oogst de milt en bewaar het op een schotel met C10 op het ijs. <ol><li> Speld de muis naar beneden met de buik naar boven gericht op de dissectie plaat. Steriliseer het lichaam door sproeien van 70% ethanol. </li><li> Snijd de huid en scheiden de huid van de spier muur onder langs de ventrale middellijn van de symfyse aan de nek. </li><li> Snijd de huid langs de achterpoot van het eerste incisie aan de enkel. </li><li> Speld de huid weer aan de zijkanten en snijd de spier muur langs de zijkanten van de eerste incisie plaats om middenrif. </li><li> Speld de spierwand weer aan de rechterzijde van het hoofd. </li><li> Zoek de milt aan de rechterzijde van de muis onder de dunne darm en aan de maag. Pick-up de ene kant van The milt en scheiden van de maag. </li></ol></li><li> Snijd beide achterpoten, onder meer bovenbeen en onderbeen, en verwijder alle spieren zo veel mogelijk. <ol><li> Snijd de spieren langs de achterpoot van het bekken / heupgewricht aan de enkel met een scherpe schaar, proberen om de bloedvaten te voorkomen. </li><li> Scheid de achterste ledematen door te snijden in het bekken / heupgewricht en de enkel / voet joint zonder de blootstelling van de inhoud van het beenmerg. </li><li> Schone resterende spieren aan de botten door krassen met een scheermes herhaaldelijk snijden van de spieren aan de gemeenschappelijke punten. </li></ol></li><li> Houd de botten in een 6 cm schaaltje met 4 ml C10 op ijs. Ga verder met het ontleden van de volgende muis. </li></ol> 3. splenocyten Isolation <ol><li> Homogeniseer de milt voorzichtig met een zuiger tegen een 70-um zeef cel boven het schaaltje met 4 ml C10 totdat er geen rode stukken zijn toegankelijk. </li><li> Voeg extra 6 ml C10 in de schaal door de zeef van eennd vervolgens over de totale 10 ml celsuspensie aan een 15 ml conische buis. </li><li> Centrifugeer de conische buis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C. </li><li> Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 2 ml 1 x rode bloedcel (RBC) lysisbuffer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Na incubatie gecentrifugeerd conische buis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C. </li><li> Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml C10. Gooi alle grote klonten (dode cellen) en hou de buis op ijs voor later. LET OP: Als er veel kleine groepjes, gebruik maken van een 70-um cel zeef aan de celsuspensie een keer te filteren. </li><li> Tel het aantal cellen met trypan blauw met behulp van een geautomatiseerde cel teller. </li></ol> 4. Bone Marrow Cell Isolation <ol><li> Breng de botten met 4 ml C10 in een vijzel en voeg 6 ml C10 tot een volume van 10 ml in totaal C10 maken. </li><li> Crack de botten voorzichtig in de mortel met behulp van apEstle. </li><li> Roer voorzichtig met de stamper naar het beenmerg vrij in C10. </li><li> Breng de ml C10 10 met beenmerg in een 50 ml conische buis op ijs door een 70-um cel zeef. Voeg 10 ml vers C10 in de mortel nog met de botten. LET OP: Pipette de oplossing die het beenmerg en neer meerdere malen voor het passeren van de zeef als rode klonten zichtbaar zijn. </li><li> Herhaal stap 4,2-4,4 keer. Na de laatste wasbeurt, moet de botten verschijnen wit. </li><li> Centrifugeer de 50 ml conische buis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C. Bereid ondertussen 5 ml kant-en-klare dichtheidsgradiënt medium in een 15 ml conische centrifugebuis bij kamertemperatuur. </li><li> Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml C10. </li><li> laag langzaam de 10 ml celsuspensie bovenop de 5 ml medium dichtheidsgradiënt, handhaven duidelijk grensvlak tussen de twee fasen. Centrifugeer de 15 ml conische buis bij 1363 g gedurende 30 minuten bijRT (20 ° C) met versnelling set als 9 en vertraging ingesteld op 0 (of Brake OFF). </li><li> Na centrifugeren verwijdert de bovenste 8 ml oplossing voorzichtig en laat de 2 ml buffy coat bij de interface (een laag van mononucleaire cellen) in een nieuwe 15 ml conische buis. </li><li> Voeg 12 ml ijskoud C10 de 15 ml conische buis met beenmerg mononucleaire cellen, cap en keer herhaaldelijk goed te mengen, centrifugeer de buis bij 800 xg gedurende 10 min, 4 ° C. </li></ol> 5. celoppervlak kleuring voor FACS <ol><li> sample kleuring <ol><li> Bereid anti-muis CD16 / 32 antilichaamoplossing (1 tot 100 verdunning in HBSS vol, 5 ug / ml eindconcentratie). </li><li> Na centrifugatie in stap 4,10, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 100 gl anti-muis CD16 / 32 antilichaamoplossing Fc-receptor op de mononucleaire cellen. Incubeer op ijs gedurende 10 min. </li><li> Bereid fluorescentie-geconjugeerd antilichaam mengsel (anti-muis CD11c-PE 1:40 verdunning, anti-muis CD11b-APC-CY7 1:80 verdunning, anti-muis PDCA-1-FITC 1:40 verdunning en anti-muis B220-V500 1:40 verdunning in HBSS- full zoals aanbevolen door de fabrikant aan 100 gl eindvolume per monster). NB: Het is belangrijk om antilichamen te titreren voor gebruik. </li><li> Na 10 min incubatie in stap 5.1.2, voeg 4 ml ijskoud HBSS vol en centrifugeer bij 800 xg gedurende 5 min, 4 ° C ongebonden anti-muis CD16 / 32 te verwijderen. </li><li> Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 100 ui fluorescentie-geconjugeerd antilichaam mengsel. Incubeer op ijs gedurende 15 minuten in het donker. </li><li> Na 15 minuten incubatie wordt 4 ml ijskoud HBSS vol en centrifugeer bij 800 xg gedurende 5 min, 4 ° C om ongebonden fluorescentie-geconjugeerde antilichamen te verwijderen. </li><li> Bereid FACS laden oplossing (500 ng / ml DAPI in HBSS-vol). </li><li> Na centrifugatie in stap 5.1.6, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 500 μ; L FACS laden oplossing. Breng de celsuspensie in een 12 x 75 mm met ronde bodem buis (FACS buis) en hou de buis op ijs in het donker totdat het sorteren binnen 1 uur. </li></ol></li><li> Kleuring voor compensatie <ol><li> Label 6 FACS buizen als PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI of ongekleurd. Aliquot splenocyten van 1 x 10 6 cellen / buis in de FACS buizen en wassen met 4 ml HBSS vol bij 800 xg gedurende 5 min, 4 ° C. LET OP: Het gebruik van DNA-bindende fluorescentie kleurstof, DAPI, om levende cellen te onderscheiden van dode cellen. DAPI kan passeren de plasmamembraan van dode cellen (maar niet die van levende cellen) en bind chromosoom DNA. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 100 ui HBSS vol. </li><li> In elke overeenkomstige FACS buis, voeg een van de volgende antilichamen: anti-muis CD19-PE 1:40 verdunning, anti-muis CD11b-APC-CY7 1:80 verdunning, anti-muis PDCA-1-FITC 1:40 verdunning of anti-muis B220-V500 1:40 verdund zoals aanbevolen door de manufacturer. Laat de 5 e (DAPI) en 6e (ongekleurd) FACS buizen zoals ze zijn. Meng goed door schudden en incubeer de FACS buisjes op ijs in het donker gedurende 15 min. </li><li> Na incubatie wordt 4 ml ijskoud HBSS-full in elke buis en centrifugeer de FACS buizen bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C. </li><li> Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 500 ul ijskoud HBSS vol behalve de pellet in de buis gemerkte DAPI, welke wordt geresuspendeerd in 500 pi FACS beladingsoplossing. Het houden van alle 6 buizen op ijs in het donker totdat het sorteren. </li></ol></li></ol> 6. sorteren op de Cell Sorter LET OP: De werking van het sorteren procedure op de cytometer en de software is gestandaardiseerd met een gedetailleerde instructies geleverd door het bedrijf. In het kort, maken we gebruik van 100 micron nozzle bij 20 psi, stelt doelcel concentratie tussen 5-10000000 per ml, en efficiëntie aan te passen tot 70% of hoger (dat wil zeggen, conflicten gehouden onder 30%). <ol><li> Bereid collectie FACS buizen met 500 ul FBS / buis met 100 U / ml penicilline-streptomycine. </li><li> Pas compensatie parameters van de cel sorter met behulp van single-vlek compensatie buizen uit stap 5.2. <ol><li> Noteer 10.000 cellen in ongekleurd buis negatieve gate te stellen voor elke fluorescentie-intensiteit. </li><li> Noteer 10.000 cellen in andere vergoeding single-vlek buizen om positieve gate te stellen voor elke fluorescentie-intensiteit. NB: De software berekent automatisch de compensatie parameters. </li></ol></li><li> Met een monster van stap 5.1 tot de poorten van de gesorteerde celpopulaties ingesteld door registratie 3000 cellen. Middels fluorescentie-intensiteit als parameters X en Y-as grafiek poort doelwitcelpopulatie handmatig een groep punten kennelijk gescheiden van andere punten. LET OP: Deze venstertijd set is flexibel en willekeurig op basis van de eisen van de onderzoekers. Als onderzoekers verwachten hogere zuiverheid op basis van één of meer markers, verplaats de gatehoger gebaseerd op de bijbehorende fluorescentie-intensiteit. </li><li> Laad een verzameling buis en beginnen met de doelcel populatie sorteren. </li><li> Houd de collectie buis op ijs na sortering totdat alle monsterbuizen worden gedaan. </li><li> Voeg ijskoud C10 aan de collectie buis tot 4 ml, cap en zwenken om te mengen. </li><li> Centrifugeer de verzamelbuis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C, en zuig de supernatant, waardoor ongeveer 200 pi met celpellet onaangeroerd. </li><li> Voeg 1 ml ijskoud C10 aan de cel pellet te resuspenderen en de overdracht van alle celsuspensie in een 1,5 ml centrifugebuis. </li><li> Centrifugeer de 1,5 ml buis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C en zuig de supernatant, waardoor 100 pi met de celpellet onaangeroerd. </li><li> Bewaar de gesorteerde celpopulaties op ijs tot gebruik. </li></ol>

<ol><li>Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Fluorescence activated cell sorting.</a> Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).</li>
<li>Herzenberg, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+future+of+the+fluorescence+activated+cell+sorter+and+flow+cytometry%3A+a+view+from+Stanford%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford.</a> Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).</li>
<li>Brown, M., Wittwer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+principles+and+clinical+applications+in+hematology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology.</a> Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).</li>
<li>Laerum, O. D., Farsund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+flow+cytometry%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Clinical application of flow cytometry: a review.</a> Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).</li>
<li>Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+flow+cytometry+to+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of flow cytometry to clinical microbiology.</a> Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).</li>
<li>Mattanovich, D., Borth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+cell+sorting+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Applications of cell sorting in biotechnology.</a> Microb Cell Fact. 5 (12), (2006).</li>
<li>Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD95+and+CCR7+expression+on+circulating+CD4%28%2B%29+lymphocytes+revealed+disparate+immunoregulatory+potentials+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus.</a> Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).</li>
<li>Cullender, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immunity+interact+to+quench+microbiome+flagellar+motility+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut.</a> Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).</li>
<li>Fernandez, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence-based+isolation+of+live+C.+elegans+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).</li>
<li>Cai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN+expression+on+podocytes+and+its+role+in+inflammatory+immune+response+of+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis.</a> Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).</li>
<li>Blasius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-surface+molecule+selectively+expressed+on+murine+natural+interferon-producing+cells+that+blocks+secretion+of+interferon-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha.</a> Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).</li>
<li>Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic-activated+cell+sorting+%28MCS%29+can+be+used+as+a+large-scale+method+for+establishing+zebrafish+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures.</a> Sci Rep. 5, 7959(2015).</li>
<li>Valli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-+and+magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+enrich+human+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells.</a> Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).</li>
<li>Yamashiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+change+of+cytokine-activated+neutrophils%3A+inflammatory+neutrophils+are+heterogeneous+and+enhance+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses.</a> J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).</li>
<li>Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dysregulation+of+cytokine+networks+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus.</a> J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).</li>
<li>Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+differences+in+plasmacytoid+dendritic+cell+frequency+and+function+revealed+by+a+novel+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody.</a> J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).</li>
<li>Liao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tacrolimus+Protects+Podocytes+from+Injury+in+Lupus+Nephritis+Partly+by+Stabilizing+the+Cytoskeleton+and+Inhibiting+Podocyte+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis.</a> PLoS One. 10 (7), e0132724(2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, is voor de zuivere verrijking van levende pDC die het vermogen behouden om IFNα te produceren. De toepassingen van dit protocol omvatten, maar zijn niet beperkt tot, de zuivering van pDC en/of andere mononucleaire cellen uit het beenmerg van MRL/lpr en andere muizenstammen voor studies van cellulaire en moleculaire functies. Verschillende cruciale stappen in dit protocol zijn om een hoge levensvatbaarheid en zuiverheid van de gesorteerd pDC te waarborgen. De eerste bel...

Efficiënte scheiding van een celpopulatie naar keuze van andere cellen maakt studies van de populatie mogelijk die anders misschien niet mogelijk zijn. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een methode om een interessante celpopulatie met hoge zuiverheid te verrijken. 1,2 Verschillende celtypen drukken meestal unieke moleculen uit, of een unieke combinatie van verschillende moleculen, op het plasmamembraan die één celpopulatie van een andere kunnen onderscheiden. Bij binding van deze celoppervlaktemoleculen door specifieke fluorescentie-geconjugeerde antilichamen, is een detectieapparaat genaamd flowcytometer/sorteerder in staat om de lichtsignalen van verschillende fluorescerende kleurstoffen die verschillende molecuulmarkers op de cellen vertegenwoordigen op het niveau van een enkele cel te exciteren en te detecteren. De gecombineerde informatie die bestaat uit ofwel de aanwezigheid van een lichtsignaal (dat een positieve expressie van het corresponderende oppervlaktemolecuul vertegenwoordigt) of de afwezigheid van een lichtsignaal (dat een negatieve expressie van een molecuul vertegenwoordigt) definieert het fenotype van de cel. Na het passeren door de detector, worden cellen met hetzelfde fenotype van belang omgeleid naar een aangewezen opvangbuis op basis van elektrische lading.
FACS wordt breed toegepast in verschillende studies zolang de te verrijken populatie met fluorescentie is gelabeld.3-7 Het is gebruikt om immunoglobuline (Ig)A-gecoate bacteriën van niet-IgA gecoate bacteriën in de darmmicrobiota te scheiden 8 en genetisch gemodificeerde celpopulaties die fluorescente eiwitten uitdrukken te sorteren. 9 Belangrijk is dat het de capaciteit heeft om meer dan één populatie tegelijkertijd te scheiden, wat niet alleen tijd en reagentia bespaart, maar ook meer geavanceerde ontwerpen van studies mogelijk maakt. 10 Echter, FACS heeft ook zijn beperkingen. Als een populatie van belang erg zeldzaam is (minder dan 1%), kan de sorteerefficiëntie verminderd zijn, wat aanzienlijke celverliezen veroorzaakt. Bovendien kan sommige antilichaambinding intracellulaire signaaltransductie activeren die functionele veranderingen van de gesorteerd celpopulatie induceert. 11 Daarom moet het fenotype dat voor het sorteren wordt gebruikt zorgvuldig worden geselecteerd. 
Er bestaan andere methoden naast FACS die ook gebaseerd zijn op celoppervlaktemarkers voor de verrijking van specifieke celpopulaties, zoals magnetische-geactiveerde celsortering (MCS). 12 Net als bij FACS, kunnen met magnetische kralen geconjugeerde antilichamen specifieke celoppervlaktemoleculen targeten. Na antilichaam-antigeen interactie, kunnen met magnetische kralen gecoate cellen worden gescheiden van niet-gecoate cellen na het passeren door een magnetisch veld. Echter, slechts een beperkt aantal moleculen kan worden gericht in MCS, aangezien magnetische kralen, in tegenstelling tot verschillende fluorescerende kleuren in FACS, niet onderscheidbaar zijn. Het is dus moeilijk voor MCS om een celfenotype met een gecompliceerde combinatie van oppervlaktemarkers te definiëren. 13,14 Bovendien is MCS ook in staat om onbedoelde activering van doelcellen te veroorzaken.
In onze studies van een muismodel van systemische lupus erythematosus (SLE), 15 waren we van plan plasmacytoide dendritische cellen (pDC) te zuiveren om hun functionele veranderingen bij ziekteprogressie te onderzoeken. We gebruikten eerst MCS om pDC uit het beenmerg te verrijken door PDCA-1 te targeten, een molecuul dat hoog en uniek wordt uitgedrukt op muis pDC in stabiele toestand. 16 Echter, de celzuiverheid was onverwacht laag, waarschijnlijk als gevolg van de opregulatie van PDCA-1 op andere celpopulaties in een inflammatoire omgeving zoals SLE.16 Uiteindelijk hebben we FACS gebruikt met een combinatie van vier oppervlaktemarkers (CD11c, CD11b, B220 en PDCA-1) om hoogzuivere pDC te scheiden als CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+ populatie. Muis pDC heeft een andere specifieke oppervlaktemarker Siglec-H. We besloten Siglec-H niet te gebruiken, omdat antilichaambinding van dit molecuul de functie van pDC om IFNα te produceren onderdrukt. 11

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>gibco by life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>gibco by life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>MEM niet-essentiële aminozuren</td><td>gibco by life technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>gibco by life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>gibco by life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&nbsp;</td><td>gibco by life technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>gibco by life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>1x Hank&rsquo;s Balanced Salt Solution&nbsp;</td><td>gibco by life technologies</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stock Solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SIGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>SIGMA</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Rode bloedcel (RBC) lysis buffer&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>Dichtheidsgradiënt medium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Ficoll-Paque Plus&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-muis CD19-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>anti-muis CD11c-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-muis CD11b-APC-CY7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>anti-muis PDCA-1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-3172-81</td><td></td></tr><tr><td>anti-muis B220-V500&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561226</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Plasmacytoid Dendritische Celisolatie Kit II, muis</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria I flow cytometer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>643178</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva versie 6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescentie-geactiveerde cell sorting voor zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis bone marrow

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een techniek om specifieke celpopulaties te zuiveren op basis van fenotypes gedetecteerd door stromacytometrie. Deze methode stelt onderzoekers in staat om de kenmerken van een enkele celpopulatie beter te begrijpen zonder de invloed van andere cellen. In vergelijking met andere methoden van celverrijking, zoals magnetisch-geactiveerde celsortering (MCS), is FACS flexibeler en nauwkeuriger voor celscheiding vanwege de mogelijkheid van fenotypedetectie door stromacytometrie. Bovendien is FACS meestal in staat om meerdere celpopulaties gelijktijdig te scheiden, wat de efficiëntie en diversiteit van experimenten verbetert. Hoewel FACS enkele beperkingen heeft, wordt het op grote schaal gebruikt om cellen te zuiveren voor functionele studies in zowel in vitro als in vivo omgevingen. Hier beschrijven we een protocol dat gebruikmaakt van fluoresctie-geactiveerde celsortering om een zeer zeldzame populatie immuuncellen, plasmacytoïde dendritische cellen (pDC), met hoge zuiverheid te isoleren uit het beenmerg van lupus-geachte muizen voor in vitro functionele studies van pDC.

We gericht op het verrijken van beenmerg pDC met een hoge zuiverheid, en zonder de invloed van andere celtypen, van MRL / lpr lupus vatbaar voor muizen van jong en oud leeftijd om de functionele veranderingen van pDC met betrekking tot hun vermogen om IFNa produceren studeren. De eerste zuiveringsstrategie gebruikt was MCS, die zoals figuur 1 toont, leidde tot slechts 7,75% zuiverheid na de verrijking. Vergeleken met MCS, FACS verrijkt pDC met zuiverheid zo hoog als 96,4...

Wij rapporteren een protocol met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering met plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) met hoge zuiverheid uit het beenmerg van lupus-muizen gevoelig voor functionele studies pDC isoleren.

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Het algemene doel van dit experiment is om plasmacytoïde dendritische cellen, of PDC, met een hoge zuiverheid te isoleren uit het beenmerg van lupus-gevoelige muizen voor de studie naar hun functie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de kenmerken van een specifieke immuuncelpopulatie, zoals interferon-alfa producerende PDC tijdens de late fase van de lupusontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat één of meerdere doelpopulaties tot een hogere zuiverheid kunnen worden verrijkt dan met magnetische bead-sortering.Breng na het oogsten de achterpoten en vier milliliter volledig medium over naar een vijzel. Voeg zes milliliter vers volledig medium toe om het totale volume op 10 milliliter te brengen. Verbrijzel de botten vervolgens voorzichtig met een stamper.Roer voorzichtig met de stamper om het beenmerg vrij te maken. Breng vervolgens het volledige medium door een zeef van 70 micron over in een conische buis van 50 milliliter op ijs. Voeg 10 milliliter vers compleet medium toe aan de vijzel.Filter het supernatant nog twee keer totdat de botten wit kleuren. Centrifugeer vervolgens de beenmergcellen en resuspendeer de pellet in 10 milliliters vers compleet medium. Breng de cellen daarna zorgvuldig in laagjes aan op vijf milliliters vers bereid dichtheidsgradiëntmedium in een 15 milliliter conische buis, waarbij u erop let dat de lagen niet worden verstoord.Scheid de cellen vervolgens door middel van centrifugatie. Verwijder daarna voorzichtig de bovenste acht milliliter van de oplossing en verzamel de twee milliliter buffy coat bij de interfase. Voeg 12 milliliter ijskoude compleet medium toe aan de geïsoleerde mononucleaire cellen en sluit de buis af om door inversie te mengen.Pellet vervolgens de cellen door middel van centrifugatie. Om de cellen te kleuren voor FACS, resuspendeert u deze in 100 microliters CD1632FC blokkerend antilichaam bij vier graden Celsius. Was de cellen na 10 minuten in vier milliliters ijskoude sorteerbuffer en label de cellen met 100 microliters van het passende cocktail van celoppervlak-kleuringsantilichamen.Gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in het donker. Was de cellen in vier milliliter ijskoude sorteerbuffer om eventuele niet-gebonden fluorescentie-geconjugeerde antilichamen te verwijderen. Resuspendeer het pellet vervolgens in 500 microliter FACS-laadoplossing en breng het monster op ijs over in een FACS-buis.Om de compensatiecontroles te kleuren, worden 1 x 10⁶ miltcellen per buis gealiquoteerd. Was de cellen met 4 mL sorteerbuffer en resuspendeer de pellets in 100 µL sorteerbuffer. Voeg vervolgens het juiste fluorescentie-geconjugeerde antilichaam uit de master-cocktail voor celoppervlakte-antilichamen toe aan elke corresponderende compensatiebuis en schud de buizen om te mengen.Na 15 minuten in het donker, bij vier graden Celsius, worden alle monsters gewassen met sorteerbuffer en worden de pellets opnieuw gesuspendeerd in 500 µL ijskoude sorteerbuffer. Behalve de DAPI-buis, die opnieuw wordt gesuspendeerd in 500 µL FACS-laadoplossing. Om de doelcelpopulatie te zuiveren middels fluorescence activated cell sorting, worden opvangbuisjes met 500 µL FBS aangevuld met antibiotica onder de sorteerkleppen geplaatst.Laad vervolgens de ongekleurde buis en verzamel 10 000 events om de negatieve gate voor elke fluorescentie-intensiteit in te stellen. Verzamel daarnaast 10 000 events in de buizen met enkelvoudige kleuring voor compensatie om de positieve gate voor elke fluorescentie-intensiteit vast te stellen. Verzamel 3 000 events van het experimentele monster om de gates voor de gesorteerde celpopulatie in te stellen.Gebruik de fluorescentie-intensiteiten als parameters voor de X- en Y-as van de grafiek om de doelcelpopulatie handmatig te gaten. Sorteer vervolgens de doelcelpopulatie in de opvangbuis. Voeg aan het einde van de sortering tot vier milliliter ijskoud compleet medium toe aan de cellen.Sluit vervolgens de buis met een dop en meng de cellen door deze om te keren. Pelleteer de gezuiverde cellen door centrifugatie en aspireer al het supernatant, behalve de laatste 200 µL. Resuspendeer de pellet vervolgens in één milliliter ijskoud compleet medium en breng de cellen over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis voor een tweede centrifugatie.Pipetteer tot slot al het supernatant weg, behalve de laatste 100 µL, en bewaar de gesorteerde celpopulatie op ijs tot gebruik. Magnetische geactiveerde cel sortering van plasmacytoïde dendritische cellen uit beenmerg van lupus-gevoelige muizen resulteert na verrijking in een zuiverheid van slechts 7,75%. FACS-verrijkte plasmacytoïde dendritische cellen vertonen echter een zuiverheid tot wel 96,4% na sortering.Om een hoge zuiverheid te waarborgen, worden de mononucleaire beenmergcellen eerst gegated en gescheiden van debris op basis van forward scatter- en side scatter-parameters. Met behulp van forward scatter width versus forward scatter height en side scatter width versus side scatter height worden de enkelvoudige cellen verder gegated om fout-positieve signalen veroorzaakt door aggregaten te vermijden. De levende, enkelvoudige DAPI-negatieve cellen worden vervolgens gegated op hun CD11c-positieve, CD11B-negatieve celoppervlakexpressie, wat verdere gating mogelijk maakt van de B220-positieve, PDCA-1-positieve doelpopulatie van plasmacytoïde dendritische cellen uit het beenmerg.De gesorteerde PDC-populatie is niet alleen van een hoge zuiverheid, maar ook functioneel normaal, met het vermogen om IFNalpha te produceren na CPG-stimulatie in vitro. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de botten te breken en het vrijgekomen beenmerg voorzichtig te roeren om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals RNA-sequencing of in vitro kweek en stimulatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de genexpressie of functie van de verrijkte celpopulaties te beantwoorden.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor PDC-onderzoekers om de rol van deze krachtige cel te onderzoeken bij de ontwikkeling van lupus en lupus-gevoelige muismodellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een hooggezuiverde PDC-populatie kunt isoleren uit het beenmerg van lupus-gevoelige muizen.

fluorescence-activated-cell-sorting-for-purification-plasmacytoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Voor veel wetenschappelijke studies die een biologische en chemische analyse van celpopulaties de cellen moeten worden in een hoge staat van zuiverheid. Fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) is een superieure methode om zuivere celpopulaties te verkrijgen.

Zuivering van specifieke cel Bevolking naar fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting (FACS)

Een sterk gezuiverde bereiding van de muis long dendritische cellen wordt beschreven. Specifieke aandacht wordt gegeven aan de isolatie van de conventionele dendritische cel subset.

Isolatie van Mouse Lung dendritische cellen

Dit is een snelle en uitgebreide methode van immunofenotypering myeloïde suppressor cellen (MDSC) en het verrijken van...

Voorbereiding van de myeloïde suppressor cellen (MDSC) van naïeve en pancreas tumor-dragende muizen met behulp van flowcytometrie en geautomatiseerde Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

This video demonstrates an in vitro assay to generate plasmacytoid dendritic cells (pDCs) from common lymphoid progenitor cells (CLPs). Upon co-culturing purified CLPs with γ-irradiated feeder cells in the presence of Fms-like tyrosine kinase-3 ligand (FL), the CLPs differentiate into non-adherent pDCs, the presence of which is confirmed using flow cytometry.

In Vitro Generation of Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors

Dit protocol beschrijft experimentele procedures om de differentiatie van plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer's patch van zachte dendritische celvoorlopers nagegaan met behulp van technieken met FACS-gemedieerde isolatie hydrodynamische gentransfer en flow-analyse van immune subsets in Peyer's patch.

Het beoordelen van de ontwikkeling van de Muriene plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer&#39;s Patches Met behulp adoptieve overdracht van hematopoëtische voorlopers

In deze studie presenteren we een in vitro kweeksysteem dat efficiënt pDC's kan genereren door co-cultiveren van gemeenschappelijke lymfoïde progenitorcellen met AC-6 feedercellen in aanwezigheid van Flt3-ligand.

In vitro generatie van Muriene plasmacytoïde dendritische cellen van Common Lymfoïde Progenitors met behulp van de AC-6 Feeder System

Er bestaan verschillende zeldzame populaties van dendritische celsubpopulaties in lymfoïde organen en daarom zijn ze lastig te isoleren in voldoende aantallen en zuiverheid voor immunologische experimenten. Hier beschrijven we een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van alle momenteel bekende belangrijke subpopulaties van dendritische cellen in de milt van muizen.

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Lymfocyten zijn de belangrijkste spelers in adaptieve immuunresponsen. Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van lymfocyten om de fysiologische functies van de gewenste moleculen bij lymfocytenactivatie in vitro en in vivo te bepalen. De beschreven experimentele procedures zijn geschikt voor het vergelijken van functionele capaciteiten tussen controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

Hier bieden we een methode voor het vaststellen en isoleren van grote aantallen van GM-CSF gedreven myeloïde cellen met hoge snelheid cel sorteren. Vijf verschillende populaties (gemeenschappelijk myeloïde voorlopercellen, granulocyt/macrofaag progenitoren monocyten, monocyt-afgeleide macrofagen en monocyt-afgeleide DCs) kunnen worden geïdentificeerd op basis van Ly6C en CD115 expressie.

Generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie

Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en kweken van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen

Het succes van single-cell/single-nuclei transcriptomics en multi-omics hangt grotendeels af van de kwaliteit van cellen/kernen. Daarom moet het isoleren van cellen/kernen uit weefsel en hun zuivering sterk gestandaardiseerd zijn. Dit protocol beschrijft de bereiding van kernen uit de hersenen en het beenmerg voor stroomafwaartse single-nuclei multioomanalyse.

Hoogwaardige voorbereiding van hersen- en beenmergkernen voor multioomtesten met één kern

Leer plasmacytoïde dendritische cellen isoleren uit beenmerg van lupusgevoelige muizen met fluorescentie-geactiveerde cel sortering. Deze methode bereikt hoge zuiverheid voor functionele studies van immuuncellen.

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

Meer video's verkennen