Waterige druppels gebruikt als enzymatische Microreactors en hun elektromagnetische aandrijving
28 augustus 2017
Lab-in-a-drop reactie systemen toestaan de veelzijdige uitvoering van complexe reacties in een schaal van microfluidic. Een automatische bediening platform bestaande uit een 3 x 3 matrix van elektromagnetische spoelen werd ontwikkeld en met succes gebruikt voor het samenvoegen van twee 10 µL microreactors en daardoor een enzymatische reactie in de resulterende vloeistof Friezen te initiëren.
Het algemene doel van dit apparaat is om een nieuwe microfluïdische platformtechnologie te bieden die geautomatiseerde cascadereacties in kleine waterige druppels realiseert. Deze methode zou kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van synthetische biologie door reactiesequenties van micro-organismen die complexe reactiesequenties met enzymen uitvoeren, te reproduceren en nieuwe katalysatoren te screenen. Het belangrijkste voordeel van onze lab-in-a-drop-aanpak is dat het zeer aanpasbaar is.
In tegenstelling tot kanaalgebaseerde microfluïdische chips, is de enige vereiste een hydrofiele reactie-omgeving. Hoewel deze methode inzicht kan geven in enzymatische reacties, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals anorganische katalysatoren of het snoeren van liganden. Ik had het idee voor deze methode voor het eerst toen ik probeerde een microfluïdisch apparaat te ontwerpen met geïntegreerde productscheiding maar zonder een complex systeem van kleppen en scheiders.
Door de reactieoplossing als druppel te verplaatsen, wordt de reactiecontrole zeer eenvoudig. Ontwerp eerst in 3D print de spoellichamen. Gebruik vervolgens een wikkelmachine om de lichamen 45 duizend keer elk met een 08-millimeter koperdraad te wikkelen.
Plaats een Peltier-element op een elektrische printplaat. Schroef de eerste laag spoelen op het Peltier-element om een vierkant te vormen. Bevestig vervolgens de tweede laag spoelen bovenop met het 3D-geprinte kunststof frame of ander niet-geleidend materiaal.
Verbind de elektrische printplaat met de magneetcontrole met een lintkabel. Plaats neodymium magneten in de spoelen. Plaats een een millimeter dik kwartsglas of kunststof plaat bovenop de spoelmatrix.
Bevestig de deksel met schroeven om de assemblage van de bedieningsplatform te voltooien. Om de nanodeeltjessynthese onder een inerte atmosfeer te beginnen, schors eerst 85 gram Iron(III)chloride hexahydraat en 3 gram Iron(II)chloride tetrahydraat in 200 milliliters van een vier-op-een water-naar-ethanol oplossing. Voeg vervolgens 0,2 milliliter PFOTES toe en roer het mengsel op 500 RPM met een magnetische roerbar.
Voeg 1,5 molair ammoniumhydroxide toe aan het mengsel om een pH van 8,0 te bereiken. En roer vervolgens de oplossing gedurende 24 uur door om de hydrofobe magnetische nanodeeltjes te verkrijgen. Bevestig een staafmagneet met een klenkracht van 25 kilogram aan de bodem van de reactiekolf.
Pour de oplossing af en was de deeltjes drie keer met een vier-op-een water-naar-ethanol oplossing. Verwijder de magneet en droog de deeltjes gedurende 24 uur bij 60 graden Celsius. Karakteriseren de deeltjes met scannende elektronenmicroscopie.
Bereid een oplossing van 0,1 microgram per milliliter mierikswortelperoxidase in 0,1 molar pH 6,5 kaliumfosfaatbuffer met 10 millimolair waterstofperoxide. Bereid vervolgens een 20-micromolaire oplossing van de fluorescerende sonde 10-Acetyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine in kaliumfosfaatbuffer. Vervolgens, vermaal voorzichtig de droge nanodeeltjes met behulp van een glazen vijzel en stamper.
Breng de deeltjes over naar een polystyreen weegschaal en voeg 10 microliter van de peroxidaseoplossing toe. Draai voorzichtig de schaal gedurende ongeveer 10 seconden om nanodeeltjes zelfassemblage rond de peroxidaseoplossing te bereiken. Breng deze microreactor over naar het bedieningsplatform.
Herhaal dit proces met 10 microliter van de fluorescerende sonde oplossing en plaats de tweede microreactor op het platform. Bewaar de resterende deeltjes bij kamertemperatuur. Gebruik het Peltier-element om de reactieoplossingen in de microreactoren op 25 graden Celsius te houden.
Monteer een fluorescentiemicroscoop ongeveer 10 millimeter boven de microreactoren en verbind de microscoop met een computer. Gebruik de magneetbediening om de magneten te activeren en draai om de microreactor van fluorescerende sondeoplossing onder de microscoop te plaatsen. Schakel het excitatielicht in.
Verhoog de spoelmanchet om de microreactor te openen en begin met het opnemen van het fluorescentiemicroscoopbeeld. Laat na twee-tot-vijf seconden de magneet zakken om de microreactor te sluiten. Gebruik vervolgens de magneetbediening om de peroxidase microreactor naast de fluorescentie microreactor te verplaatsen.
Open de fluorescerende sonde microreactor. De peroxidase microreactor wordt in de sonde microreactor getrokken en geopend, waardoor de reactie wordt geïnitieerd. Bewaak de reactie door middel van fluorescentiemicroscopie door de samengevoegde microreactor te openen en te sluiten zoals nodig is.
Microreactoren werden gecreëerd door druppels oplossing met hydrofobe ijzernanodeeltjes te coderen. Deze microreactoren kunnen worden verplaatst, geopend, gesloten en samengevoegd door manipulatie van neodymium magneten onder een bedieningsplatform. Het bedieningsplatform kan ook worden geconstrueerd met ijzerkernen in de spoellichamen.
Dit biedt voldoende magnetische kracht om een microreactor meer dan 10 millimeter te verplaatsen, maar is onvoldoende om de microreactor te openen. Daarom moet een neodymium magneet worden gebruikt om reacties uit te voeren in kleine oplossingsvolumes. Een representatieve enzymatische reactie tussen een peroxidase en een fluorescerende markering werd uitgevoerd en bewaakt door middel van fluorescentiemicroscopie.
De Michaelis-gemeten kinetiek die tijdens de reactie werd waargenomen, kwam goed overeen met de literatuurwaarden, wat aangeeft dat de microreactoropstelling de reactievoortgang niet beïnvloedt. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u hydrofobe microdeeltjes kunt synthetiseren en er waterige microdruppels mee kunt genereren. De platformtechnologie kan worden gebruikt voor geautomatiseerde reactiecontrole door druppelsamenvoeging.
Bovendien kunnen enkele microreactoren gevuld met substraat worden verplaatst boven kleine oppervlaktezones met gemobiliseerde enzymen. Het gebruik van meerdere immobilisatiezones met verschillende enzymen maakt een sequentiële reactiecascade mogelijk met transporteerbare en onmiddellijke producten. Deze prototypeontwikkeling is slechts het begin.
Momenteel implementeren we een geautomatiseerd dispensersysteem boven het reactieplatform om geïmmobiliseerde enzymen op elke positie te plaatsen. De
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe microfluïdische platformtechnologie die is ontworpen voor geautomatiseerde cascadereacties in kleine waterige druppels. De lab-in-a-drop benadering maakt een veelzijdige implementatie van complexe reacties mogelijk, waardoor inzicht wordt verkregen in enzymatische processen en andere systemen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microfluïdica
- Synthetische biologie
- Enzymatische reacties
Achtergrond
- Microfluïdische systemen maken traditioneel gebruik van ontwerpen op basis van kanalen.
- Lab-in-a-drop-systemen bieden een meer aanpasbare reactieomgeving.
- Geautomatiseerde platforms kunnen de reactie-efficiëntie en complexiteit verhogen.
- Inzichten uit dit onderzoek kunnen toepassingen in de synthetische biologie bevorderen.
Doel van de studie
- Om een microfluidisch platform te ontwikkelen voor geautomatiseerde cascadesreacties.
- Om complexe reactiesequenties te reproduceren die vergelijkbaar zijn met die in micro-organismen.
- Om nieuwe katalysatoren te screenen en het begrip van enzymatische reacties te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een geautomatiseerd actuatieplatform met elektromagnetische spoelen.
- Samenvoegen van microreactoren om enzymatische reacties te initiëren.
- Benutten van hydrofiele omgevingen voor het faciliteren van reacties.
- Aanpassing van de methode voor diverse katalytische systemen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle samenvoeging van microreactoren om vloeibare knikkers te creëren.
- Aantoonbare aanpasbaarheid van de lab-in-a-drop benadering.
- Potentiële toepassingen buiten enzymatische reacties, inclusief anorganische katalysatoren.
- De verkregen inzichten kunnen toekomstig onderzoek naar synthetische biologie informeren.
Conclusies
- De lab-in-a-drop-methode biedt een flexibel platform voor complexe reacties.
- Deze technologie zou een aanzienlijke impact kunnen hebben op de synthetische biologie en het screenen van katalysatoren.
- Verdere exploratie van deze methode kan leiden tot innovatieve toepassingen in diverse vakgebieden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Geautomatiseerde microreactorplatforms die gebruikmaken van waterige druppels maken programmeerbare, gemultiplexte enzymatische en katalytische reacties mogelijk bij volumes op microschaal. Deze technologie voldoet aan de behoefte aan flexibele, kanaalloze microfluidische systemen die snelle hypothesetoetsing en high-throughput screening in de vroege ontdekkingsfase ondersteunen. De aanpasbaarheid en het automatiseringspotentieel positioneren het als een herbruikbare mogelijkheid voor synthetische biologie, katalysatorevaluatie en mechanistische risicoreductie in de gehele R&D-pijplijn.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar enzymatische routes en substraatspecificiteit mogelijk in een gecontroleerde, geminiaturiseerde omgeving.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door snelle, parallelle tests van reactiesequenties en katalysatorkandidaten mogelijk te maken.
- Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij de selectie van targets door kwantitatieve real-time monitoring van de reactiekinetiek.
Screening en assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde microreactorsystemen voor voor downstream screeningsworkflows van verbindingen of katalysatoren.
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare assaycondities door automatisering van druppelmanipulatie en -samensmelting.
- Maakt schaalbare, gemultiplexte screening mogelijk met minimale reagensconsumptie en een hoge datadichtheid.
- Ondersteunt betrouwbare evaluatie van enzymactiviteit en substraatconversie via fluorescentie-readouts.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante enzymatische pathways voor translationele biomarker-exploratie wanneer geschikte substraten worden gebruikt.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door sequentiële reactiecascades en producttracking te ondersteunen.
- Vermindert mechanistische ambiguïteit in preklinische modellen door nauwkeurige controle over de initiatie en monitoring van reacties mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit microreactorplatform integreert het proces van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinische mechanistische studies, waardoor hypothese-gestuurd onderzoek en snelle iteratie worden ondersteund.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door programmeerbare reactiesequenties in druppels mogelijk te maken.
- Screening: Biedt assay-klare, reproduceerbare microreactoren voor high-throughput evaluatie van enzymen, substraten of katalysatoren.
- Analytics: Levert kwantitatieve fluorescentiemetingen en kinetische gegevens voor een robuuste vergelijking van experimentele condities.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt de afstemming op ziekterelateerde enzymatische processen wanneer geïntegreerd met passende biologische substraten.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een flexibel, schaalbaar platform dat aanpasbaar is aan diverse reactietypes en screeningsbehoeften binnen R&D-teams.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en de targetvalidatie door gecontroleerde, gemultiplexte reactieanalyse mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door geautomatiseerde druppelactivatie en -samensmelting.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie door het gebruik van reagentia te verminderen en snelle datageneratie mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van kandidaten door robuuste mechanistische risicoreductie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in microfluidica, magnetische actuatie en fluorescentieanalyse.
- Toegang tot infrastructuur voor 3D-printen, spoelwikkeling en fluorescentiemicroscopie is noodzakelijk.
- Vereist cross-team standaardisatie van protocollen voor druppelpreparatie en actuatie.
- Aanpasbaar aan diverse modelsystemen, maar optimalisatie kan nodig zijn voor verschillende enzym- of substraatklassen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van hydrofobe oppervlakken en nauwkeurige magnetische controle voor betrouwbare druppelmanipulatie.
