Name: Het visualiseren van de vroege stadia van Phagocytosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Leer fagocytose visualiseren in de vroege stadia met confocale microscopie en fluorescerend geconjugeerd zymosan. Deze methode maakt tijdsgevoelige monitoring van pathogeen-opname in DC 2.4-cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Wendy Zalm en Nicki Watson van de Keck-faciliteit op het Whitehead Institute of MIT voor de beeldvorming.

1. Bereiding van DC2.4 en RAW 264,7 cellijnen LET OP: De macrofaag-achtige cellijn RAW 264.7 en de dendritische cel lijn DC2.4 zijn beide muizen oorsprong, en de volgende voorwaarden werden gebruikt om de cellen groeien. <ol><li> RAW 264,7 cellen groeien in DMEM (Dulbecco&#39;s Minimal Eagle&#39;s medium) aangevuld met 10% geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. </li><li> Groeien DC2.4 cellen in vergelijkbare omstandigheden met die van RAW 264.7 cellen, met uitzondering van het gebruik RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium aangevuld met L-glutamine in plaats van DMEM. </li></ol> 2. Bereiding van fluorescerende geconjugeerde Deeltjes: C. albicans, Zymosan, IgG-beklede kralen <ol><li> Groeiende Candida albicans <ol><li> Enten C. albicans stam SC5314 uit een bevroren glycerol voorraad in 25 ml YPD, aangevuld met Uri (2% Bacto-pepton, 1%gistextract, 2% glucose en 80 ug / ml uridine) overnacht bij 30 ° C. LET OP: Vermijd de groei van de Candida cultuur meer dan een OD 600 van 12. </li><li> Neem 1 ml van C. albicans en spin neer bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet met 1 ml PBS. </li><li> Verzamel het pellet door centrifugeren bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Herhaal stap 2.1.4. </li><li> Bereken de multipliciteit van infectie (MOI) van C. albicans in verhouding tot het aantal fagocyten en de procedure voor fagocytose assay zoals beschreven in sectie 3. Een OD 600 van 1 equivalent is aan 2,5 x 10 7 Candida albicans per 1 ml. OPMERKING: Genereren van Candida-BFP wordt gegeven in referentie 13. </li></ol></li><li> Bereiding van Zymosan en IgG-beklede kralen OPMERKING: Zymosan een β-glucan bevattendeschimmel koolhydraten deeltjes voorbereiding die afgeleid van Saccharomyces cerevisiae. Zymosan is bekend inflammatoire signalen in macrofagen en dendritische cellen te roepen, en het is uitgebreid gebruikt in fagocytose studies 13, 14, 15. <ol><li> Kort vortex de buis die de deeltjes bevat, en aliquot een hoeveelheid die voldoende is voor een experiment in een 1,5 ml buis. OPMERKING: Gewoonlijk gebruiken we 01:10 verhouding (één cel, voeg 10 zymosan deeltjes of IgG-beklede korrels). </li><li> Voeg 1 ml ijskoude PBS, en verzamel de deeltjes door centrifugeren gedurende 1 min bij 10.000 x g. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml ijskoude PBS. </li><li> Herhaal de stappen 2.2.2-2.2.3 LET OP: Ga verder met punt 2.2.5 of bewaar de buis bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> Ultrasone trillingen de deeltjes gedurende 10 seconden ultrasone badsonicator (120 V, 50-60 kHz) om een ​​voorkomenny deeltje aggregatie. </li></ol></li></ol> 3. Fagocytose OPMERKING: Fagocytose is een complex proces dat begint met de binding van de deeltjes op het celoppervlak van de fagocyten door interactie van PRRS met liganden op het oppervlak van het deeltje. Binding wordt gevolgd door het samenstel van actine en de bijbehorende eiwitten op het contactoppervlak en de vorming van een fagocytische cup. De daaropvolgende actine demontage vindt plaats op het phagosome en leidt tot volledige engulfment van de deeltjes. Hieronder beschrijven we de verschillende stadia van fagocytose. <ol><li> binding Assay Opmerking: Het doel van dit experiment is de eerste stap van fagocytose die de interactie tussen de liganden op het doel deeltjes en de receptoren op de fagocyten gaat volgen. <ol><li> Zaad ongeveer 5 x 10 4 cellen in een kamer zo in dat ze 60-70% confluent ten tijde van het experiment. Alterntief, plaat cellen op dekglaasjes (in 24- of 12-well formaat) of glazen bodem 96-putjesplaten. Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO2. OPMERKING: Cellen worden geteld met behulp van een hemocytometer of soortgelijke techniek. </li><li> Plaats de kamer schuif (of plaat) bij 10 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Voorzichtig het medium te verwijderen uit elk putje met behulp van een pipet of afzuiger. LET OP: Voer deze stap zorgvuldig elk putje van een chambered dekglaasje systeem is klein; Het is gemakkelijk om cellen te verstoren met de punt van een pipet of een sterke luchtstroom van een aspirator. </li><li> Meng de fluorescent gelabelde deeltjes met een celkweekmedium (bereid zoals hierboven beschreven). Voeg Candida -BFP (bij een MOI van 10), fluorescent geconjugeerd-zymosan of latex korrels-konijnen IgG-FITC (10 deeltjes per cel) aan de cellen. Gebruik een eindvolume van 200 pl media voor één kamer vormt zodat alle cellen vallen. </li><li> Spin down de kamer dia bij 277g gedurende 3 minuten bij 10 ° C. Opmerking: Deze centrifugatie stap helpt om het contact tussen de deeltjes en de cellen te verhogen, en synchroniseert het bindingsproces. </li><li> Onmiddellijk over de kamer dia naar een 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de kamer dia uit de incubator en zuig de media. </li><li> Was de cellen 3x met ijskoude PBS. OPMERKING: Controleer de aanwezigheid van niet-gebonden deeltjes met een lichtmicroscoop en was meerdere malen met PBS indien nodig. Het is essentieel om ongebonden deeltjes uit de put verwijderen om achtergrondruis te minimaliseren tijdens de analyse. </li><li> Fix cellen door toevoeging van 500 pl 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS verdund door incubatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. WAARSCHUWING: Deze stap vereist het gebruik van 4% PFA die zeer toxisch, corrosief en potentieel carcinogeen. Proper voorzichtigheid is geboden bij het gebruik van deze vloeistof. Ook beschermen monsters van licht. </li><li&gt; Was de cellen door toevoeging van 500 pl PBS in de kamer en zuig de oplossing voorzichtig. </li><li> Herhaal 3.1.9 stap tweemaal. OPMERKING: Bij deze stap vullen elk flesje na verwijdering van de vorige PBS. </li><li> Stop de binding door incubatie met 500 pl 50 mM NH4 Cl in PBS gedurende 10 min. </li><li> Was de cellen tweemaal met PBS zoals in stap 3.1.10. </li><li> Doorlaatbaar cellen door toevoeging van 250 ul bindingsbuffer (0,1% saponine, 0,2% BSA in PBS) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Stain F-actine door toevoeging van fluorescent geconjugeerde phalloidin (1: 500 verdund in bindingsbuffer). Incubeer cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Was de cellen drie keer met PBS zoals in stap 3.1.10. </li><li> Maak foto&#39;s met behulp van een confocale microscoop (63x objectief, en 402 nm en 488 nm laser) en het analyseren van beelden met behulp van ImageJ 16. OPMERKING: Een succesvolle deeltje binding wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van een fagocytische cup op de plaats waar de deeltjes contact op met de fagocytische cel (figuur 1). Zie stap 3.2.5. </li></ol></li><li> Fagocytose Opname Assay Opmerking: Dit experiment is ontworpen om de volledige internalisering van fluorescent gelabelde deeltjes door fagocyten via confocale microscopie (figuur 2) volgen. <ol><li> Zaad ongeveer 5 x 10 4 cellen in een kamer zo in dat ze 60-70% confluent ten tijde van het experiment. Alternatief plaat cellen op dekglaasjes (in 24- of 12-well formaat) of glazen bodem 96-putjesplaten. Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO2. OPMERKING: Cellen worden geteld met behulp van een hemocytometer of soortgelijke techniek. </li><li> Houd de kamer schuift (of plaat) bij 10 ° C gedurende 10 minuten. OPMERKING: Koeling is nodig om endocytose en fagocytose ongewenste blokkeren en vervolgens een gesynchroniseerde fagocytose hebben. </li><li> Perform stappen van 3.1.3 naar 3.1.5 </li><li> Breng de kamer dia naar een 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO 2 en incubeer gedurende verschillende tijdstippen. Fix cellen na 30, 60 en 90 min na infectie. Let op C. albicans beginnen te schimmeldraden op 60 min na infectie te vormen; fagocyten beginnen celdood (pyroptosis) vertonen na 90 min 8. Opmerking: Dit is een aanbeveling en optimalisatie is essentieel afhankelijk van het celtype en de deeltjesvormige gebruikt. </li><li> Voer stappen van 3.1.7 naar 3.1.15. Analyseren van beelden met behulp van ImageJ 16. OPMERKING: een geslaagde opname wordt gekenmerkt door een volledige internalisering van een deeltjesvormig in het cytoplasma van een fagocyt (figuur 2). Kleuren van de fagocyten met celoppervlak merker zoals phalloidin helpt de contour van cellen af ​​te bakenen. Het is ook essentieel om z-stacks uitvoeren om te bepalen of de deeltjes is gebonden aan celoppervlak of completely geïnternaliseerd. </li></ol></li><li> Live-Imaging van Phagocytosis Opmerking: In dit protocol beschrijven we het gebruik van confocale microscopie aan de verschillende stadia van fagocytose via fluorescent geconjugeerd zymosan vangen. We gebruiken de dendritische cellijn die stabiel tot expressie DC2.4 mCherry gemerkte F-actine 8, een biosensor dat de verdeling van filamenteus actine in levende cellen toont. Aangezien fagocytose is een actine gestuurd proces live beeldvorming in deze cel maakt niet alleen alle bewegingen en dynamiek van F-actine netwerk vast te leggen, maar ook voor diverse fagocytische gebeurtenissen binnen de levende cellen (Figuur 3, Film 1) zichtbaar. <ol><li> Zaad ongeveer 5 x 10 4 cellen in een kamer dia in een concentratie zodat ze 60-70% confluent ten tijde van het experiment. Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO2. OPMERKING: Cellen worden geteld met behulp van een hemocytometer ofsoortgelijke techniek. </li><li> Houd de kamer dia&#39;s op ijs gedurende 10 min. OPMERKING: Koeling is nodig om ongewenste opname te blokkeren, en een gesynchroniseerde fagocytose hebben. </li><li> Voer stappen van 3.1.3 naar 3.1.5 </li><li> Pre-warm de microscooptafel tot 37 ° C en equilibreren de kamer met 5% CO2. 30-45 min wachten voor de temperatuur en de CO 2 te stabiliseren voordat de beeldvorming. Opmerking: omdat de CO2 en temperatuurniveaus zijn cruciaal voor fagocytose, is het belangrijk om op de microscoop verwarming voorafgaand aan het experiment om de klimaatkamer equilibreren. </li><li> Plaats de kamer dia met de cellen in de microscoop incubator behuizing geëquilibreerd bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Live imaging 17, 18. OPMERKING: De instellingen voor de laservermogen (gain, pinhole, etc.) Afhankelijk van het type The microscoop en fluorescente probe gebruikt. Daarom raden wij overleg met de handleiding van de microscoop voor optimale conditie voor uw live-imaging 17,18. <ol><li> Gebruik confocale laser scanning microscoop (en de bijbehorende software) voor levende beeldvorming. Gebruik 63x 1.4NA olie objectief met een pinhole van 1-1,1 Airy eenheden. </li><li> Om de beeldvorming te starten, gebruikt het heldere veld om een ​​representatieve regio op de kamer slide te vinden. Selecteer vervolgens het veld door te klikken op de optie Positie van de software. Om GFP in Spoor 1 gebruikte de filter set voor 488 nm laser met een beam splitter bij 582 nm, om golflengten tussen 488 en 582 nm te detecteren detecteren. </li><li> Volg 2 selecteer een filter instellen optimaal voor mCherry (RFP) met behulp van een bundelsplitser bij 578 nm en het detecteren van golflengten tussen 578 en 600 nm. Gebruik 488 nm en 578 nm lasers met 50% laservermogen en een winst output van 600-700. Verkrijgen beelden elke 30 seconden voor een totaal van 90 min. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune recognition.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).</li>
<li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Information processing during phagocytosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li>
<li>Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+macrophage+%26%2334%3Bprobing%26%2334%3B+is+required+for+the+efficient+capture+of+phagocytic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic macrophage &#34;probing&#34; is required for the efficient capture of phagocytic targets.</a> J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).</li>
<li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li>
<li>Botelho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+biphasic+changes+in+phosphatidylinositol-4%2C5-bisphosphate+at+sites+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis.</a> J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).</li>
<li>Tafesse, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Sphingolipid+Biosynthesis+Blocks+Phagocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Pathog. 11, e1005188(2015).</li>
<li>Kwik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+cholesterol%2C+lateral+mobility%2C+and+the+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate-dependent+organization+of+cell+actin%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin.</a> PNAS. 100, 13964-13969 (2003).</li>
<li>Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides+in+phagocytosis+and+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22BBA%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis.</a> BBA. 1851, 805-823 (2015).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Strijbis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruton%27s+Tyrosine+Kinase+%28BTK%29+and+Vav1+contribute+to+Dectin1-dependent+phagocytosis+of+Candida+albicans+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages.</a> PLoS Pathog. 9, e1003446(2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-glucan+receptor+Dectin-1+activates+the+integrin+Mac-1+in+neutrophils+via+Vav+protein+signaling+to+promote+Candida+albicans+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance.</a> Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).</li>
<li>Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+recognition+is+mediated+by+the+association+of+dectin-1+and+galectin-3+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages.</a> PNAS. 108, 14270-14275 (2011).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24974023">Fluorescence live cell imaging.</a> Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+that+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
<li>Jaumouille, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+reorganization+by+Syk+regulates+Fcgamma+receptor+responsiveness+by+increasing+its+lateral+mobility+and+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering.</a> Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).</li>
<li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Immunopath%22%5BJournal%5D)">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).</li>
<li>Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+host-Leishmania+interactions%3A+significance+in+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Para.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis.</a> Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).</li>
<li>John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii.</a> Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Professionele fagocyten, zoals macrofagen en dendritische cellen, overspoelen en elimineren binnendringende ziekteverwekkers maken fagocytose derhalve een belangrijk onderdeel van de gastheer afweersysteem. Daarbij fagocyten ondergaan uitgebreide membraan reorganisatie cytoskelet herschikking hun celoppervlak 8, 19, 20. Om dit beter te begrijpen dynamisch proces, visualisatie van de verschillende stadia van fagocytose essentiee...

Ondanks de continue blootstelling aan pathogenen zoals bacteriën, virussen en schimmels, is het lichaam goed uitgerust met immuun mechanisme dat bescherming tegen infectie. Het aangeboren immuunsysteem is de eerste lijn van verdediging tegen binnendringende ziekteverwekkers en vertrouwt vooral op fagocytische cellen die herkennen en internaliseren buitenlandse doelen. Fagocytose is een evolutionair geconserveerd cellulaire proces dat de engulfment van ongewenste deeltjes groter dan 0,5 micrometer omvat. Fagocytische cellen brengen uiteenlopende immuunreceptoren (ook bekend als receptoren patroonherkenning, PRRS) aan het celoppervlak waarmee zij pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) aanwezig op pathogenen vóór verzwelging 3 herkennen. Pathogeen binding wordt gevolgd door clustering receptor op het celoppervlak en veroorzaakt de vorming van een fagocytische cup. Dit resulteert in-actine aangedreven membraan remodeling dat uitsteekt rondhet doel, uiteindelijk omhult het en knijpen-off om een discrete phagosomal vacuole 2, 5 vormen. De phagosome dan rijpt en verzuurt door latere fusie met late endosomen en lysosomen dat fagolysosoom 6 vormt. Hoewel fagocytose wordt beschreven als receptor-gemedieerde en-actine aangedreven geval dit proces berust ook op spatiotemporeel modificatie van lipiden die het plasmamembraan samenstellen zoals phosphoinositides (PI) en sfingolipiden 7, 8. Terwijl actine polymerisatie wordt gedicteerd door een lokale ophoping van fosfoinositol-4,5-bifosfaat (PI (4,5) P2) aan de basis van de fagocytische cup, actine depolymerisatie afhankelijk van de omzetting van (PI (4,5) P 2 tot fosfoinositol-3,4,5-bifosfaat (PI (3,4,5) P3) 3, 9. Beide modificatieszijn essentieel als de eerstgenoemde leidt tot succesvolle uitbreiding van pseudopods rond het doel en deze maakt zinkende deeltjes in het cytosol van de fagocyt 10. Cellen die het vermogen tot fagocytose hebben ofwel professionele fagocyten, zoals macrofagen / monocyten, granulocyten / neutrofielen en dendritische cellen (DC&#39;s) of niet-professionele fagocyten, zoals fibroblast epitheelcellen en 11. Fagocytose uitgevoerd door alle fagocyten speelt een centrale rol in het weefsel onderhoud en verbouwing, terwijl fagocytose uitgevoerd door professionele fagocyten is verantwoordelijk voor de coördinatie van het aangeboren en adaptieve immuunrespons tegen ziekteverwekkers. Professionele fagocyten niet alleen presenteren antigenen overspoelen en doodt de ziekteverwekker, maar ook de lymfoïde cellen van het adaptieve immuunsysteem. Dit draagt ​​bij aan het vrijkomen van pro-inflammatoire cytokines en de betrokkenheid van lymfoïde cellen, wat tot gevolgsuccesvolle blokkade van infectie 12. Conventionele biochemische technieken zijn instrumenteel bij het verkrijgen van kennis over de moleculaire mechanismen van verschillende cellulaire processen tijdens fagocytose, zoals post-translationele modificaties en diverse hoge-affiniteit associaties tussen eiwitten zijn. Het is echter moeilijk om informatie over de ruimtelijke en temporele dynamica van fagocytische gebeurtenissen met de conventionele biochemische werkwijzen te verkrijgen. Live-cell imaging niet alleen stelt ons in staat om cellulaire gebeurtenissen in een tijd gevoelige manier te controleren, maar ook stelt ons in staat om informatie in te winnen bij een enkele cel niveau. Hier beschrijven we een methode om de verschillende stadia van fagocytose te onderzoeken, alsmede het gehele proces spatiotemporeel geanalyseerd met behulp van confocale microscopie.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Cell Signaling Technology&nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactaat)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&rsquo;s Minimal Eagle&rsquo;s medium)</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (Fosfaat- Gebufferde Saline)</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>FITC-gekoppelde IgG-gecoate latexbeade</td><td>Cayman</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde-oplossing (4% in PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine (10.000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidine-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 cellen</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Trypaanblauw oplossing (0,4% (w/v) in PBS)</td><td>Corning cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (1x) (0,05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Surfact-Amps Detergent-oplossing</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp;85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass systeem (8 kamers)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Glasstic schuif 10 met rasters</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

het visualiseren van de vroege stadia van phagocytosis

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Het lichaam van een zoogdier is uitgerust met verschillende lagen van de mechanismen die helpen om zich te verdedigen tegen pathogeen invasies. Professionele fagocyten van het immuunsysteem - zoals neutrofielen, dendritische cellen en macrofagen - behouden aangeboren vermogen te detecteren en te verwijderen zoals binnendringende ziekteverwekkers tot fagocytose 1. Fagocytose omvat gechoreografeerde gebeurtenissen membraan reorganisatie en actine remodellering op het celoppervlak 2, 3. Fagocyten succes internaliseren en de uitroeiing van buitenlandse moleculen alleen wanneer alle fasen van de fagocytose is voldaan. Deze stappen omvatten herkenning en binding van het pathogeen door receptoren patroonherkenning (PRRS) verblijvend aan het celoppervlak, vorming van fagocytische cup doorgaande actine verrijkte membraneuze uitsteeksels (pseudopods) het deeltjesvormige omringen en splitsing van de phagosome vervolgens fagolysosoom rijping dat resultaten in dehet doden van de ziekteverwekker 3, 4. Imaging en kwantificatie van de verschillende stadia van fagocytose is een randvoorwaarde voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen van dit proces in de cel. Dit manuscript rapporteert methoden om de verschillende fasen van fagocytose bestuderen. We beschrijven een microscoop-gebaseerde aanpak te visualiseren en kwantificeren van de binding, vorming fagocytische cup, en de internalisering van deeltjes door fagocyten. Zoals fagocytose ontstaat wanneer aangeboren receptoren op fagocyten tegenkomen liganden op een doeldeeltje groter dan 0,5 urn, de assays hier geïntroduceerde omvatten het gebruik van pathogene schimmels Candida albicans en andere deeltjes zoals zymosan en IgG-beklede parels.

-Microscoop gebaseerde methode om de verschillende stadia van fagocytose bewakingsmogelijkheden gepresenteerd. De verschillende gebeurtenissen tijdens de fagocytose van verschillende fluorescerende deeltjes door DC2.4 cellen worden getoond. Met de hier beschreven technieken, hebben we de rol van sfingolipiden in de vroege stadia van fagocytose. Daartoe DC2.4 dendritische cellen genetisch deficiënt SPTLC2, het enzym dat de eerste en snelheidsbepalende stap in de sfingolipide biosynthese katalyseert, gebruikt. In vergelij...

Hier beschrijven we een microscoopgebaseerde techniek om de vroege cascades van gebeurtenissen tijdens fagocytose van pathogenen zoals de schimmels Candida albicans en deeltjes die groter zijn dan 0,5 µm, waaronder zymosan en IgG-gecoate kralen, te visualiseren en te kwantificeren.

Het visualiseren van de vroege stadia van Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Het overkoepelende doel van deze techniek is om de verschillende stadia van fagocytose te bewaken met behulp van een confocale microscoop. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van interacties tussen verschillende pathogenen. Voornamelijk om te begrijpen hoe pathogenen tijdens een infectie de gastheercellen binnendringen.Het grootste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig is en ons in staat stelt om op een tijdsgevoelige manier informatie te verkrijgen over de viruscel van onze gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens fagocytose. Om te beginnen, bereid de fluorescent geconjugeerde zymosan voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. De dag ervoor, zaai ongeveer vijf keer 10 tot de vierde DC 2.4 cellen in een kamerschijf, zodat de putjes 60 tot 70% confluent zijn op het moment van het experiment.Zodra de cellen op de juiste dichtheid zijn, plaats de kamerschijf gedurende 10 minuten op 10 graden Celsius. Het koelen van de cellen is noodzakelijk om endocytose te blokkeren, evenals om cytosis te activeren. En vervolgens om een gesynchroniseerde fagocytose te hebben.Verwijder vervolgens voorzichtig het medium uit elke put met behulp van een pipet of aspirator. Meng vervolgens de fluorescent geconjugeerde zymosan met cellenkweekmedium bij een besmettingsmultiplicteit van 10. Voeg vervolgens 500 microliter medium toe aan elke kamerput om ervoor te zorgen dat alle cellen bedekt zijn.Spin vervolgens de kamerschijf om zowel de contacten tussen de deeltjes in de cellen te verhogen als het bindingsproces te synchroniseren. Na centrifugatie, breng de kamerschijf over naar een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius met 5 procent CO2. Na vijf minuten bij 37 graden Celsius, verwijder de kamerschijf uit de incubator en aspireer het medium.Was vervolgens de cellen drie keer met ijskoud PBS. Controleer na de laatste wasbeurt op de aanwezigheid van ongebonden deeltjes met een lichtmicroscoop en voer indien nodig aanvullende wasbeurten uit. Het is essentieel om ongebonden deeltjes uit de putjes te verwijderen om achtergrondruis tijdens de analyse te minimaliseren.Fixeer vervolgens de cellen door 500 microliter van vier procent paraformaldehyde in PBS toe te voegen aan de putjes en ze gedurende 30 minuten op kamertemperatuur te incuberen. Na het fixeren van de cellen, was ze door 500 microliter PBS toe te voegen aan elke kamer en vervolgens voorzichtig de oplossing te aspireren. Herhaal de wasstap nog twee keer.Na de derde ronde van wassen, stop de reactie door 500 microliter van 50 millimolair ammoniumchloride in PBS toe te voegen aan de cellen en ze gedurende 10 minuten te incuberen. Was vervolgens de cellen in 500 microliter PBS op kamertemperatuur. Permeabiliseer vervolgens de cellen door 500 microliter bindingsbuffer toe te voegen aan elke put en de cellen gedurende 30 minuten op kamertemperatuur te incuberen.De volgende stap is om F-actine te kleuren door fluorescent geconjugeerd phalloidin toe te voegen aan de cellen en ze een uur op kamertemperatuur te incuberen. Was vervolgens de cellen drie keer met 500 microliter PBS. Vang tenslotte beelden op met behulp van een confocale microscoop en analyseer de beelden met behulp van ImageJ.Om de opname van zymosan te meten, bereid kamerschijven met cellen voor zoals getoond in de bindingsassay. Na de koel- en labelfasen, breng de kamerschijf over naar een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius met vijf procent CO2. En incubeer de cellen gedurende verschillende tijdstippen.Fixeer de cellen na 30, 60 en 90 minuten na infectie. Zorg ervoor om deze tijdstippen te optimaliseren op basis van het respectieve celtype en de gebruikte fluorescente deeltjes. Analyseer vervolgens de beelden met ImageJ.Succesvolle opname wordt gekenmerkt door een volledige internalisatie van een deeltje binnen het cytoplasma van een fagocyt. Om te beginnen, bereid een omgevingskamer voor de microscooptafel voor door deze op te warmen tot 37 graden Celsius en de kamer in evenwicht te brengen met 5 procent CO2. Wacht 30 tot 45 minuten totdat de temperatuur en de CO2 gestabiliseerd zijn voordat u gaat beelden.Het zien van de CO2- en temperatuurniveaus is cruciaal voor fagocytose, net zo belangrijk om de microscoopverwarming aan te zetten vóór het experiment om de omgeving van die kamer in evenwicht te brengen. Bereid vervolgens kamerschijven met DC 2.4 cellen voor die mCherry F-actine expressie vertonen, zoals getoond in de bindingsassay. Na de koeling en labelfasen, breng de kamerschijf van de centrifuge rechtstreeks naar een voorverwarmde microscooptafel.Ten slotte voer live beeldvorming uit met behulp van een confocale laserscanningmicroscoop zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, om niet alleen de beweging en dynamica van het F-actine netwerk vast te leggen, maar ook om de verschillende fagocytische gebeurtenissen binnen de levende cellen te visualiseren. De hier getoonde cellen in groen is een wild type DC 2.4 cel die geïnfecteerd is met Canadian BFP die in rood is getoond. Timelapse beeldvorming wordt gebruikt om de vroege stadia van fagocytose te visualiseren en wordt hier getoond in intervallen van 30 seconden.De locaties aangegeven door het sterretje zijn waar actine-remodellering plaatsvindt. Het hele proces gebeurt in een kwestie van enkele minuten. Hier werd de rol van sfingolipiden geëvalueerd voor hun rol in de vroege stadia van fagocytose.Met behulp van deze techniek zijn sfingolipiden essentieel gebleken voor de binding van candida albicans aan de cellen en hebben een verminderde algehele fagocytose veroorzaakt. Deze vermindering van fagocytische binding werd ook aangetoond voor DC 2.4 celbinding aan zymosans. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u live beeldvorming kunt uitvoeren om de vroege fase van fagocytose te bestuderen.Eenmaal beheerst, kan deze techniek in een tot twee uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoer

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates an assay to monitor independent macrophage-mediated red blood cell (RBC) phagocytosis events. Mouse immunoglobulin G (IgG)-opsonized human RBCs are incubated with mouse macrophages and observed under a confocal microscope. The RBCs are engulfed by macrophages via a phagocytic cup formation and targeted for lysosomal degradation.

Real-Time Imaging of Macrophage Phagocytosis of IgG-Opsonized Red Blood Cells

This video demonstrates a high-resolution total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy technique for real-time visualization of phagosome formation and closure during macrophage-mediated phagocytosis of IgG-opsonized red blood cells (RBCs) attached to the surface of a glass bottom dish. The macrophages extend pseudopodia around the RBCs and engulf them inside the phagosomes, detaching them from the glass surface.

TIRF Microscopy-Based Visualization of Phagosome Formation and Closure

We beschrijven werkwijzen voor levende cellen videomicroscopie...

Live-cel Video Microscopie van pathogene schimmel Fagocytose

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen

Hier presenteren we een protocol om fagocytose van fluorescerende deeltjes door een adherante macrofaag-cellijn te kwantificeren met behulp van een fluorometrische methode. Deze methode maakt een hoge doorvoerkwantificering van deeltjesinternalisatie mogelijk, evenals de resulterende actinepolymerisatie.

High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie

We beschrijven een experimentele opstelling om fagosoombevorming en -afsluiting in drie dimensies in levende macrofagen met ongekend hoge resolutie te visualiseren, met behulp van total internal reflection fluorescentiemicroscopie. Het maakt het mogelijk om de basis van de fagocytische cup, de uitbreidende pseudopoden, evenals de precieze plaats van fagosooombaan te monitoren.

&quot;Phagosome Closure Assay&quot; naar phagosome Formatie Visualiseer in drie dimensies behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM)

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige methode om de pH en phagosomal gebied en het cytoplasmatische pH van mens en muis neutrofielen via de ratiometrische indicator seminaphthorhodafluor (SNARF) -1 of S-1 te meten. Dit wordt bereikt met behulp van levende cellen confocale fluorescentie microscopie en beeldanalyse.

Beeldvorming van de neutrofielen phagosome en cytoplasma Met behulp van een Ratiometrische pH Indicator

Hier beschrijven we methoden draaiende schijf confocale microscopie afbeelding één fagocytische gebeurtenissen via muis resident peritoneale macrofagen. De protocollen kunnen worden uitgebreid tot andere fagocytische cellen.

Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

Het mechanisme geassocieerd met fagocytose bij Leishmania-infectie blijft slecht begrepen. Hier beschrijven we methoden om de vroege gebeurtenissen te evalueren die plaatsvinden tijdens leishmania-interactie met de gastheercellen.

Onderzoek naar de fagocytose van Leishmania met behulp van confocale microscopie

Hier wordt een protocol gepresenteerd om dynamische beelden van mesenchymale stamcel (MSC) gemedieerde regulatie van macrofaag (MΦ) fagocytose van niet-opsonized gist (zymosan) deeltjes die zijn geconjugeerd aan een pH-gevoelig fluorescerend molecuul te kwantificeren en te produceren.

Mesenchymale stamcelregulatie van macrofaagfagocytose; Kwantificering en beeldvorming

Deze studie verheldert de fagocytische verwerking van Godanti Bhasma (GB) deeltjes in zoogdiercellen, waarbij hun cellulaire opname, vacuoledynamiek, verzuring en afbraak worden gekarakteriseerd. Deze bevindingen vergroten niet alleen ons begrip van fundamentele fagocytosemechanismen, maar vestigen GB ook als een veelbelovend modelsysteem voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën.

Onderzoek naar de sequentiële cellulaire gebeurtenissen van fagocytose veroorzaakt door Godanti Bhasma in zoogdiercellen

Leer fagocytose visualiseren in de vroege stadia met confocale microscopie en fluorescerend geconjugeerd zymosan. Deze methode maakt tijdsgevoelige monitoring van pathogeen-opname in DC 2.4-cellen mogelijk.

Het visualiseren van de vroege stadia van Phagocytosis

Meer video's verkennen