Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren
21 december 2016
We stellen een protocol voor voor het herprogrammeren van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Door de getransduceerde bloedcellen te plaatsen op met matrix beklede platen met behulp van centrifugatie, worden iPSC's met succes geïnduceerd uit zwevende cellen. Deze techniek suggereert een eenvoudig en effectief herprogrammeringsprotocol voor cellen zoals PBMC's en CBMC's.
Het algemene doel van dit onderzoek is om perifere bloedmononucleaire cellen te herprogrammeren in geïnduceerde pluripotente stamcellen, door gebruik te maken van seriële platering door middel van centrifugatie. Oorspronkelijk werden iPSC's gegenereerd door fibroblasten te herprogrammeren. Tegenwoordig worden verschillende methoden gebruikt voor herprogrammering.
Vanwege de toegankelijkheid van bloed kunnen PBMC's echter een onaanvaardbare celbron zijn voor verdere toepassing van iPSC's, in medicijnscreening, thesismodellering en de ontwikkeling van regeneratieve geneeskunde. Door middel van het onderzoek zullen we een protocol delen over de herprogrammering van iPSC's met behulp van PBMC's door toevoeging van centrifugale kracht. Dit protocol zal een andere optie bieden bij het herprogrammeren van zwevende cellen.
Om de procedure te demonstreren, zullen we Nam, een afstudeerstudent uit mijn laboratorium, gebruiken. Om de monocytencellen te isoleren, verkrijg eerst ten minste tien milliliter vers bloed uit een bloedafname in een celvoorbereidingsbuis. Breng vervolgens het bloed over naar een nieuwe 50-milliliter kegelbuis en verdun het met steriel PBS in een verhouding van één op vier.
Voeg vervolgens tien milliliter dichtheidsgradiënt media toe aan een nieuwe 50-milliliter kegelbuis en leg voorzichtig het verdunde bloed bovenop het dichtheidsgradiënt media. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende 30 minuten bij 750 keer g bij kamertemperatuur, zonder centrifugatiestop. Na 30 minuten, breng voorzichtig de buffy-laag over naar een nieuwe 50-milliliter kegelbuis.
Voeg 30 milliliter PBS toe en was de cellen. Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende vijf minuten bij 515 keer g bij kamertemperatuur. Gooi vervolgens het PBS weg en suspendeer de cellen in 0,5 milliliter bloedcelmedia.
Tel vervolgens de cellen en plateer ze in een 24-wellsplaat. Voeg PBS toe aan de omringende wells om verdamping te voorkomen. Stabiliseer vervolgens de cellen gedurende vijf dagen bij 37 graden Celsius vóór transductie.
Voeg op dag drie tot vier nogmaals 0,5 milliliter vers bloedcelmedia toe, zonder de cellen te verstoren. Breng in deze procedure de bloedcellen over in een 15-milliliter kegelbuis en tel ze met behulp van een hemacytometer. Bereid vervolgens drie keer tien tot de vijfde cellen voor transductie voor en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 515 keer g bij kamertemperatuur.
Gooi vervolgens het supernatant weg door zuigen en suspendeer de cellen in 0,5 milliliter bloedcelmedia. Breng vervolgens de cellen over naar een well van een niet-gecoate 24-wellsplaat. Ontdooi het Sendai-virusmengsel in ijs en voeg het toe aan de gesuspendeerde cellen.
Verzegeld de plaat met een afdichtfilm en centrifugeer deze gedurende 30 minuten bij 1.150 keer g bij 30 graden Celsius. Na centrifugatie, incubeer de cellen gedurende één nacht bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide. Om een 24-wellsplaat te coaten met vitronectin, verdun de vitronectin-oplossing de volgende dag in PBS om een uiteindelijke concentratie van vijf microgram per milliliter te verkrijgen.
Voeg vervolgens één milliliter vitronectin toe aan een well en incubeer het gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de coatingoplossing en breng al het media met de cellen en het virus over naar de gecoate well. Verzamel vervolgens de resterende cellen met een extra 0,5 milliliter vers bloedcelmedia en voeg het toe aan de celbevattende well.
Centrifugeer vervolgens de plaat gedurende tien minuten bij 1.150 keer g bij 35 graden Celsius, en houd vervolgens de cellen gedurende één nacht bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide. Voor de tweede cellenoverdracht, coat de well met vijf microgram per milliliter vitronectin zoals eerder beschreven. Gebruik één well van de plaat voor elke transductie en breng de cellensuspensie van de eerste plaat over naar de nieuw gecoate vitronectinplaat.
Voeg ondertussen één milliliter iPSC-media toe aan een well van de eerste plaat voor onderhoud en incubeer het gedurende één nacht bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide, met dagelijkse mediaverversing met vers iPSC-media. Kolonies zullen verschijnen op dag 14 tot 21, na transductie. Centrifugeer de nieuw gecoate plaat, die de gesuspendeerde cellen bevat, gedurende tien minuten bij 1.150 keer g bij 35 graden Celsius.
Na centrifugatie, incubeer de cellen gedurende één nacht bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide. Verwijder de volgende dag het supernatant en vervang het door vers geïnduceerd pluripotent stamcelmedia. Houd de aangehechte cellen in stand met dagelijkse mediaverversing totdat 80% confluency is bereikt.
Een week voor het koloniepik, zaai een keer tien tot de vierde cellen in een vitronectin-gecoate 100-millimeter schotel. Bereid vervolgens een vitronectin-gecoate 60-millimeter schotel voor door twee milliliter vitronectin-oplossing toe te voegen en incubeer deze gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur. Door middel van een microscoop, markeer de kolonies op de bodem van de plaat met duidelijke grenzen met behulp van een markeringspen.
Verwijder de vitronectin-oplossing van de nieuwe plaat en voeg zes milliliter geïnduceerd pluripotent stamcelmedia toe, aangevuld met tien millimolair RHO-kinase. Verwijder vervolgens het kweekmedium van de cellen en was ze met drie milliliter PBS. Voeg vervolgens één milliliter iPSC-kolonie-losmakingsoplossing toe en incubeer deze gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur.
Verwijder vervolgens de oplossing van de plaat en incubeer deze gedurende nog eens 30 seconden bij kamertemperatuur. Na 30 minuten, trek 200 microliter media uit de plaat en los de doelkolonies los door middel van pipettering. Breng vervolgens de verspreide kolonies over naar een nieuwe 60-millimeter schotel.
Incubeer en houd de cellen in stand bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide totdat ze passage tien hebben bereikt. In het vroege stadium van herprogrammering werden iPSC's gemengd met de aangehe
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het herprogrammeren van mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMCs) tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) met behulp van centrifugatie. De methode vergroot de toegankelijkheid van PBMCs als een levensvatbare bron voor iPSCs, die kunnen worden ingezet in diverse toepassingen zoals drugscreening en regeneratieve geneeskunde.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Stamcelbiologie
- Celherprogrammering
- Regeneratieve Geneeskunde
Achtergrond
- Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) werden oorspronkelijk gegenereerd uit fibroblasten.
- Mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMCs) vormen een toegankelijkere celbron.
- iPSCs hebben toepassingen in drugscreening en ziektemodellering.
- De huidige methoden voor het herprogrammeren van PBMCs zijn beperkt.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een eenvoudig en effectief protocol voor het herprogrammeren van PBMC's tot iPSC's.
- Het benutten van centrifugale kracht om het herprogrammeringsproces te verbeteren.
- Het bieden van een alternatieve methode voor het werken met zwevende cellen.
Gebruikte methoden
- Herprogrammering van PBMC's tot iPSC's.
- Uitplaten van getransduceerde bloedcellen op met matrix gecoate platen.
- Toepassing van centrifugatie om celadhesie te bevorderen.
- Inductie van iPSC's uit zwevende cellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van iPSCs uit PBMCs met behulp van het voorgestelde protocol.
- Demonstratie van de effectiviteit van centrifugatie in het herprogrammeringsproces.
- Potentieel voor bredere toepassingen van PBMC-afgeleide iPSCs.
- Het bieden van een nieuwe optie voor onderzoekers in de stamcelbiologie.
Conclusies
- Het protocol biedt een eenvoudige aanpak om PBMC's te herprogrammeren tot iPSC's.
- Deze methode zou het gebruik van PBMC's in diverse biomedische toepassingen kunnen verbeteren.
- Verdere studies kunnen de bruikbaarheid van deze techniek in de regeneratieve geneeskunde uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Dit protocol maakt de efficiënte generatie van iPSCs uit mononucleaire cellen uit perifeer bloed mogelijk, wat een niet-invasieve, schaalbare bron biedt voor ziektemodellering en drugscreening. Door gebruik te maken van centrifugatie om de celadhesie te verbeteren, wordt de herprogrammeringsefficiëntie verhoogd en het celverlies tijdens de vroege stadia verminderd. De methode ondersteunt targetvalidatie en de ontwikkeling van preklinische modellen met behulp van patiëntafgeleide cellen, waardoor translationeel onderzoek in de regeneratieve geneeskunde wordt versneld.
Strategische toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met behulp van genetisch gematchte menselijke iPSC's, afgeleid van toegankelijke bloedbronnen.
- Operationele waarde: Biedt een hernieuwbare celbron voor het verduidelijken van signaalpaden en functionele target-validatie zonder invasieve biopsieën.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde iPSC-populaties voor consistente screening van verbindingen en de ontwikkeling van fenotypische assays.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door seriële plating via centrifugatie, waardoor de variabiliteit in celhechting en herprogrammeringsefficiëntie wordt verminderd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekterelevante modellering door pluripotente cellen te produceren die in staat zijn tot differentiatie in lineages die relevant zijn voor het testen van drugstoxiciteit en -effectiviteit.
- Operationele waarde: Maakt schaalbare expansie en banking van iPSC-kolonies mogelijk voor longitudinale preklinische studies en het verminderen van risico's bij het bepalen van het werkingsmechanisme.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door een betrouwbare upstream bron van iPSC's te bieden voor downstream toepassingen in targetvalidatie, assayontwikkeling en preklinisch testen.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothese-testen door de generatie van patiëntspecifieke iPSCs die de genetische achtergrond van de donor behouden voor mechanistische studies.
- Screening: Produceert adherente, proliferatieve iPSC-koloniën die geschikt zijn voor high-content screening en dosis-responassays na transductie en selectie.
- Analytics: Maakt kwantitatieve beoordeling van de herprogrammeringsefficiëntie mogelijk via colony formation metrics en expressie van pluripotentiemarkers (bijv. SSEA4, Oct4, TRA-1-60) voor go/no-go-beslissingen.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de continuïteit van discovery naar preklinische validatie door differentiatie-competente cellen te leveren voor weefselspecifieke assays en veiligheidsfarmacologie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor de generatie van iPSCs over meerdere projecten, waardoor de afhankelijkheid van fibroblast-herprogrammering wordt verminderd en parallelle workflows mogelijk worden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door gebruik te maken van genetisch stabiele, van mensen afgeleide iPSC's die de variabiliteit tussen patiënten weerspiegelen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid van iPSC-productie door gedefinieerde centrifugatiestappen en plating op matrixgecoate platen, waardoor handmatige variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico bij de identificatie van lead-compounds door vroege detectie van target-gerelateerde fenotypes in menselijke cellulaire contexten mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door mechanistische read-outs te leveren vanuit iPSC-afgeleide modellen die beslissingen over verdere ontwikkeling informeren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, virale transductie en centrifugatiegebaseerde technieken voor celbehandeling.
- Is afhankelijk van toegang tot gekoelde centrifuges, matrixcoatings (bijv. vitronectine) en gespecialiseerde media voor het onderhoud van bloedcellen en de expansie van iPSC's.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor een consistente g-kracht, timing en temperatuur tijdens de seriële platingstappen om reproduceerbaarheid te garanderen.
- Vraagt om aanpassingen bij toepassing op verschillende bloedafgeleide celbronnen (bijv. navelstreng versus perifeer bloed) vanwege variabiliteit in cellevensvatbaarheid en transductie-efficiëntie.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van aseptische technieken tijdens meerdere overplaatsingen en potentiële variabiliteit in de herprogrammeringsefficiëntie op basis van de kwaliteit van de donorcellen en de passagegeschiedenis.
