Name: Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer hoe je perifere bloedmononucleaire cellen omprogrammeert tot geïnduceerde pluripotente stamcellen met centrifugatie. Deze methode verbetert de toegankelijkheid van PBMC's voor regeneratieve geneeskunde en geneesmiddelenonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Basisonderzoeksprogramma via de Nationale Onderzoeksstichting van Korea (NRF), gefinancierd door het Ministerie van Wetenschap, ICT en Toekomstplanning (2013R1A1A1076125).

Ethiek Verklaring: Deze studie protocol werd goedgekeurd door de institutionele review board van de Katholieke Universiteit van Korea (KC12TISI0861). 1. Isolatie van monocytische cellen van bloed <ol><li> Isolatie van monocytische cellen (dag -5) <ol><li> Verkrijgen van ten minste 10 ml vers bloed van een bloed trekken in een celpreparaat buis (CPT). </li><li> Breng het bloed naar een nieuwe 50-ml conische buis en verdunnen met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij een 1: 4 verhouding. OPMERKING: Een hogere verhouding van verdunning kan worden gebruikt voor hogere zuiverheid. </li><li> Voeg 10 ml dichtheidsgradiënt media in nieuw 50-ml conische buis en voorzichtig laag het verdunde bloed bovenop de dichtheidsgradiënt media. Centrifugeer bij 750 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur (RT) zonder centrifugeren rem. </li><li> Breng voorzichtig de buffy laag op een nieuwe 50-ml conische buis, voeg 30 ml PBS aan de buis en was de cellen. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 515 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. &lt;/ Li&gt; <li> Gooi de PBS en resuspendeer de cellen in 0,5 ml bloed celmedium. </li><li> Tel de cellen en de plaat 1 x 10 6 cellen per putje van een 24-wells plaat. Voeg PBS om de omringende putjes om verdamping te voorkomen. </li><li> Stabiliseren van de cellen gedurende 5 dagen bij 37 ° C in 5% CO 2 voor transductie. Voeg een extra 0,5 ml vers bloedcel media op dagen 3-4 zonder verstoring van de cellen. </li></ol></li></ol> 2. Transductie door Sendai Virus <ol><li> Transductie (Dag 0) <ol><li> Verzamelen en overdragen van de bloedcellen aan een 15-ml conische buis en tel ze met behulp van een hemocytometer. </li><li> Bereid 3 x 10 5 cellen per transductie en centrifugeer de cellen bij 515 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant door afzuigen en resuspendeer de cellen in 0,5 ml bloed celmedium. </li><li> Overdracht van de cellen om een ​​putje van een niet-gecoate 24-well plaat. </li><li> Ontdooi de Sendai virus mengsel in ijs en voeg deze toe aan de suspended cellen. Voeg Sendaivirus aan de cellen op basis van de aanbevelingen van de fabrikant. </li><li> Dicht de plaat met een afdichtfilm en Centrifugeer bij 1150 xg gedurende 30 min bij 30 ° C. </li><li> Na centrifugatie Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende de nacht (O / N). </li></ol></li><li> Celoverdracht naar voedermatrix (Dag 1) <ol><li> De volgende dag, jas een 24-wells plaat met vitronectine. Verdun de oplossing vitronectine in PBS gedurende een laatste 5 ug / ml concentratie. Voeg 1 ml vitronectine aan een putje van een 24-wells plaat en incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur. Verwijder de bekledingsoplossing voor gebruik. Beklede platen kunnen worden opgeslagen kamertemperatuur 3 dagen. </li><li> Breng al de media die de cellen en het virus aan de beklede put. </li><li> Verzamel de resterende cellen met een extra 0,5 ml vers bloed celmedium toevoegen aan de cel-bevattende put. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 1150 xg gedurende 10 min bij 35 ° C. </li><li> na centrifugation Verwijder het supernatant, voeg 1 ml iPSC media te houden en de cellen bij 37 ° C in 5% CO 2 O / N. </li></ol></li><li> Tweede cel overdracht (dag 2) <ol><li> Bekleden van de putjes van een nieuwe plaat met 24 putjes met 5 ug / ml vitronectine, zoals beschreven in stap 2.2.1. Gebruik een putje van de plaat voor elke transductie. </li><li> Breng de celsuspensie van de eerste plaat van de nieuw beklede vitronectine plaat. LET OP: Als dit niet nodig is, kan schorsing cellen worden weggegooid. De in stap 2.3 genoemde procedure kan 2-3 keer worden herhaald met de opschorting cellen. Als de stappen worden herhaald, de oogst van de cellen. </li><li> Ondertussen, voeg 1 ml iPSC media om de bron van de eerste plaat, onderhoud en incubeer deze bij 37 ° C in 5% CO 2 O / N. </li><li> Handhaaf de aangehechte cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 en voeren een dagelijkse media verandering iPSC verse media. Kolonies zal verschijnen op de dagen 14-21 na transductie. </li><li> Centrifuge de nieuw beklede plaat met de celsuspensie bij 1150 xg en 35 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Na centrifugatie Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO 2 O / N. </li><li> De volgende dag, verwijder het supernatant en te vervangen door verse iPSC media. OPMERKING: De bij stap 2.3 genoemd kan 2-3 keer worden herhaald met de suspensie cellen. Als de stappen worden herhaald, de oogst van de cellen in het supernatant en herhaal stap 2,3. </li><li> Handhaving van de bijgevoegde cellen met dagelijkse media veranderingen tot 80% samenvloeiing wordt bereikt. </li></ol></li></ol> 3. geherprogrammeerd Cell Onderhoud <ol><li> Vroeg onderhoud na de 24-well plaat cultuur <ol><li> 7-10 dagen na transductie, wanneer de cellen confluent, stelt een vitronectine gecoate, 60 mm schaal. Vitronectine verdunde oplossing in PBS gedurende een laatste 5 ug / ml concentratie. Voeg 1 ml van vitronectine aan de schaal en incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur. </li><li> was decellen met PBS en voeg 1 ml PBS / 1 mM EDTA om de cellen los te maken. </li><li> Incubeer ze op 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 min. </li><li> Oogst de cellen en centrifugeer ze op 250 xg en KT 2 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 3 ml vers iPSC media. </li><li> Plaat alle geresuspendeerde cellen op de nieuw beklede 60-mm schaal. </li><li> Voeg 10 mM RHO kinase remmer aan de cellen en te onderhouden bij 37 ° C in 5% CO2 totdat de cellen 80% confluent. </li></ol></li><li> Split voor kolonie uiterlijk (Subklonering Voorbereiding) <ol><li> Bereid een vitronectine beklede, 100-mm schaaltje, zoals beschreven in stap 3.1.2. </li><li> Was de cellen met PBS en voeg 1 ml PBS / 1 mM EDTA om de cellen los te maken. </li><li> Incubeer ze op 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 min. </li><li> Oogst de cellen en centrifugeer ze op 250 xg en KT 2 min. </li><li> Tel de cellen met een hemocytometer en bereiden 1 x 10 4 cellen per schaal.</li><li> Centrifugeer de cellen bij 250 xg en KT 2 min. </li><li> Resuspendeer 1 x 10 4 cellen in 6 ml iPSC media, plaat ze op het beklede 100-mm schaaltje en voeg 10 mM RHO kinaseremmer aan de media. </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende een week tot grote kolonies verschijnen. LET OP: Onderhouden en uitbreiden van de kolonies voor subklonering. Subklonering gebeurt meestal in minder dan 5 passages. </li></ol></li><li> Kolonie plukken met behulp van iPSC kolonie los oplossing <ol><li> Een week voor kolonie picking zaad 1 x 10 4 cellen op vitronectine beklede, 100-mm schaaltje, zoals vermeld in stap 3.2.7. </li><li> Bereid een vitronectine beklede, 60-mm schaal door toevoeging van 2 ml vitronectine oplossing en incubatie bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur. </li><li> Door het observeren door een microscoop (40X of 100X vergroting), markeer kolonies met duidelijke grenzen met behulp van een markeerstift. Verwijder de vitronectine oplossing uit de nieuwe plaat gemaakt in stap 3.3.2 en voeg 6 mlvan iPSC medium, aangevuld met 10 mM RHO kinase. </li><li> Verwijder het kweekmedium van de cellen en wassen met 3 ml PBS. </li><li> Voeg 1 ml iPSC kolonie losmaken oplossing en incubeer ze gedurende 30 s bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de oplossing van de plaat en incubeer het op kamertemperatuur gedurende nog 30 sec. </li><li> Met behulp van een P200 pipet, trek 200 ul van de media van de plaat en verwijder de beoogde kolonies door pipetteren. Breng de verstrooide koloniën de nieuwe 100-mm schaaltje. </li><li> Incubeer en onderhouden van de cellen bij 37 ° C in 5% CO2. NB: Na het verkrijgen van een zuivere iPSC kolonie, werden de cellen gehandhaafd totdat zij passage bereikt 10. karakterisatie werd gedaan na ten minste 10 passages. Antilichaam verdunningen en primer gegevens worden in tabellen 1 en 2. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+engineering+of+human+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application.</a> Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+and+personalized+medicine%3A+current+progress+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives.</a> Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).</li>
<li>Seki, T., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application.</a> World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).</li>
<li>Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+iPSCs+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+non-integrative+Sendai+virus+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Ohmine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+GMP-grade+hematopoietic+progenitor+cells+and+mononuclear+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).</li>
<li>Mae, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nat Commun. 4, 1367(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Omdat embryonale stamcellen (SER) toonde diverse tekortkomingen, werd de behoefte aan een alternatief gereedschap nodig. Daarom is de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) door Yamanaka kwam onder de internationale schijnwerpers. Het is bijna tien jaar geleden Yamanaka ontdekt dat pluripotentie kan worden geïnduceerd door toevoeging van slechts vier genen in volwassen somatische cellen. Sinds iPSCs worden &quot;opgewekt&quot; van volwassen lichaamscellen, kunnen zij ethische kwesties die ooit de ...

Stamcellen zijn een van de meest aantrekkelijke materialen klinische therapie voor de laatste decennia 1 geweest. De aantrekkelijke eigenschappen van stamcellen pluripotentie en de mogelijkheid om te hernieuwen. In 1981, werden de eerste embryonale stamcellen (SER) geïsoleerd uit de muizenembryo 2. Wanneer echter de techniek werd toegepast op menselijke embryo, het keek aantal ethische vragen. In 2006, toen Dr. Yamanaka en zijn team geherprogrammeerd de eerste pluripotente cellen uit muizen somatische cellen, het gebied stamcel weer zijn mogelijkheid en interesse werd aangewakkerd 3. Door het leveren van een aantal factoren bepaald, pluripotente stamcellen waren succesvol &quot;opgewekt&quot; uit volwassen lichaamscellen, en werden dus de naam &quot;geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs).&quot; In 2007 werd deze techniek toegepast op menselijke cellen 4, waardoor de cellen met de exacte kenmerken van de SER, maar geen van de ethische discussie. Theoretisch iPSCs kunnen uit elke celsoort die bij een individu of patiënt. Patiëntspecifieke iPSCs stijgen als een potentieel middel dat de ziekte fenotypes en epigenetische omstandigheden van elke individuele patiënt kan simuleren. Middels gen bewerken of andere methoden die de pathogene conditie kan omkeren, kan patiëntspecifieke iPSC worden gebruikt in gepersonaliseerde geneeskunde 5. Bovendien worden iPSCs minder geassocieerd met afstoting, omdat ze dezelfde immunologische identiteit als donor, waardoor auto-transplantatie haalbaarder 6. Daarom hebben iPSCs de meest veelbelovende platform bij de ziekte modelleren, drug discovery, en regeneratieve therapieën. Gezien deze voordelen, verbeterde protocollen die zuiverder en hogere opbrengsten kan geven in de minste hoeveelheid tijd van de kleinste cel bron zijn voortdurend in ontwikkeling. Een belangrijke overweging van het vinden van de meest efficiënte protocol voor toekomstige toepassing is het primaire celtype. De meeste vroege iPSC generatie protocols zijn geoptimaliseerd voor hechtende cellen sinds de oorspronkelijke iPSC lijnen geïnduceerd door huidfibroblasten 4. De isolatie en bereiding van deze cellen zijn arbeidsintensief. Ook de isolatie van huidfibroblasten omvat invasieve chirurgische procedures die een belangrijke tekortkoming bredere toepassing kan worden. Daarom is voor het verdere gebruik van iPSCs, een cel bron met handige overname is vereist. Bloed wordt beschouwd als een ideale bron van cellen omdat het wordt verkregen door een nogal minimaal invasieve procedure 7-9. In deze studie hebben we een eenvoudige wijziging van het protocol genereren hiPSCs uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Zonder de moeilijke expansieproces van een specifiek celtype, zoals CD34 + cellen werden volledig bloed cellen of PBMC&#39;s uitgeplaat op serieel-matrix gecoate platen door centrifugeren na transductie met Sendaivirus met Yamanaka factoren. Deze werkwijze verminderde de tijd die dehechting van zwevende getransduceerde cellen en verminderde het verlies van geherprogrammeerd cellen die niet kunnen hechten op eigen kracht.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mm Dish</td><td>TPP&nbsp;</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6-well Plate</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Disposable Pipette</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Disposable Pipette</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12-well Plate</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>24-well Plate</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">PBMC Isolation Materials</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9805</td><td>Blood cell media</td></tr><tr><td>CC110</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>8697</td><td>Blood cell media supplement (100x)</td></tr><tr><td colspan="4">iPSC Generation and Culture Materials</td></tr><tr><td>CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8 Media</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5940</td><td>iPSC media</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express (TrypLE)</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>12604-039</td><td>Colony detaching solution</td></tr><tr><td colspan="4">Quality Control Materials</td></tr><tr><td>18 mm Cover Glass</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech &amp; Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin&nbsp;</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SSEA4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4 Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4 Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td><td>Molecular Probe</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody</td><td>Molecular Probe</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probe</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold antifade reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Slide Glass, Coated&nbsp;</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA Polymerase</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10X TBE Buffer&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>loading star</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1kb (+) DNA ladder marker</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Rinse Buffer</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520.1000</td><td>Rinse Buffer</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td>Rinse Buffer</td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td>Rinse Buffer</td></tr></tbody></table>

geïnduceerde pluripotente stamcellen generation van blood cells met behulp van sendai virus en centrifugeren

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

De recente ontwikkeling van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) bewees dat volwassen lichaamscellen kan terugkeren naar een ongedifferentieerde, pluripotente toestand. Nu is herprogrammering uitgevoerd met diverse typen volwassen somatische cellen: keratinocyten, urine cellen, fibroblasten, enz Vroege experimenten meestal door dermale fibroblasten. Maar dit vereist een invasieve chirurgische procedure om fibroblasten van patiënten te verkrijgen. Daarom suspensie cellen, zoals bloed en urine cellen werden beschouwd als ideaal voor herprogrammering vanwege het gemak van het verkrijgen van de primaire cellen. Hier melden wij een efficiënt protocol voor iPSC generatie uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Door uitplating de getransduceerde PBMC serieel een nieuwe matrix gecoate platen middels centrifugatie, kan deze eenvoudig protocol bieden iPSC kolonies. Deze methode is ook toepasbaar op navelstrengbloed mononucleaire cellen (CBMCs). Deze studie geeft een eenvoudige en efficiënte protocol voor de herprogrammering van PBMCs en CBMCs.

Dit protocol geeft een eenvoudige methode om PBMC&#39;s geïsoleerd uit bloed herprogrammeren. Door gecombineerde seriële platen en centrifugeren, werden iPSCs succes gegenereerd. Met deze methode kan iPSC worden gegenereerd met een kleine hoeveelheid bloed cellen zonder isoleren of expanderen van een specifiek celtype. Wij hebben met succes gegenereerd iPSCs van slechts 1x10 4 cellen in een kleine celcultuur plaat. ...

We stellen een protocol voor voor het herprogrammeren van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Door de getransduceerde bloedcellen te plaatsen op met matrix beklede platen met behulp van centrifugatie, worden iPSC's met succes geïnduceerd uit zwevende cellen. Deze techniek suggereert een eenvoudig en effectief herprogrammeringsprotocol voor cellen zoals PBMC's en CBMC's.

Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Het algemene doel van deze studie is om perifere mononucleaire bloedcellen te herprogrammeren tot geïnduceerde pluripotente stamcellen, gebruikmakend van seriële uitplating via centrifugatie. Oorspronkelijk werden iPSCs gegenereerd door het herprogrammeren van fibroblasten. Vandaag de dag worden diverse celtypen gebruikt voor herprogrammering.Vanwege de toegankelijkheid van bloed kunnen PBMC's een uitstekende celbron zijn voor verdere toepassing van iPSC's, in drugscreening, ziektemodellering en de ontwikkeling van regeneratieve geneeskunde. In deze studie delen we een protocol voor de herprogrammering van iPSC's met behulp van PBMC's door centrifugale kracht toe te voegen. Dit protocol biedt een alternatieve optie bij het herprogrammeren van zwevende cellen.Om de procedure te demonstreren, maken we gebruik van Nam, een promovendus uit mijn laboratorium. Om de monocytaire cellen te isoleren, neem eerst ten minste tien milliliter vers bloed af via een bloedafname in een celpreparatiebuis. Breng het bloed vervolgens over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter en verdun het met steriele PBS in een verhouding van één op vier.Voeg vervolgens tien milliliter densiteitsgradiëntmedium toe aan een nieuwe conische buis van 50 milliliter en breng het verdunde bloed voorzichtig in lagen aan bovenop het densiteitsgradiëntmedium. Centrifugeer de monsters vervolgens 30 minuten lang bij 750 ×g op kamertemperatuur, zonder centrifugatierem. Breng na 30 minuten de buffylaag voorzichtig over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter.Voeg 30 milliliters PBS toe en was de cellen. Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende vijf minuten bij 515 times g bij kamertemperatuur. Verwijder daarna de PBS en resuspendeer de cellen in 0,5 milliliters bloedcelmedium.Tel vervolgens de cellen en zaai deze uit in een 24-well plaat. Voeg PBS toe aan de omliggende wells om verdamping te voorkomen. Stabiliseer de cellen daarna vijf dagen lang bij 37 °C vóór de transductie.Voeg op dag drie tot vier nog eens 0,5 milliliters vers bloedcelmedium toe, zonder de cellen te verstoren. Breng in deze procedure de bloedcellen over naar een 15-milliliter conisch buisje en tel ze met een hemocytometer. Bereid vervolgens drie keer tien tot de vijfde cellen voor op transductie en centrifugeer de cellen 5 minuten bij 515 ×g op kamertemperatuur.Verwijder daarna het supernatant met een zuiginstrument en resuspendeer de cellen in 0,5 milliliters bloedcelmedium. Draag de cellen vervolgens over naar een well van een niet-gecoate 24-wells plaat. Ontdooi het Sendai-virusmengsel op ijs en voeg dit toe aan de gesuspendeerde cellen.Sluit de plaat af met een sealfilm en centrifugeer deze 30 minuten lang bij 1.150 ×g bij 30 °C. Incubeer de cellen na centrifugatie gedurende de nacht bij 37 °C in 5% CO2. Om de volgende dag een 24-wells plaat te coaten met vitronectine, wordt de vitronectine-oplossing verdund in PBS tot een eindconcentratie van 5 µg/mL.Voeg vervolgens één milliliter vitronectine toe aan een putje en incubeer dit gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur. Verwijder daarna de coatingoplossing en breng al het medium dat de cellen en het virus bevat over naar het gecoate putje. Verzamel vervolgens de resterende cellen met een extra 0,5 milliliter vers bloedcelmedium en voeg dit toe aan het putje met de cellen.Centrifugeer de plaat vervolgens 10 minuten lang bij 1.150 ×g bij 35 °C en houd de cellen daarna overnight bij 37 °C in 5% CO2. Voor de tweede celoverdracht wordt de put gecoat met 5 µg/ml vitronectine, zoals eerder beschreven. Gebruik voor elke transductie één put van de plaat en breng de celsuspensie van de eerste plaat over naar de nieuw gecoate vitronectineplaat.Voeg ondertussen één milliliter iPSC-medium toe aan een putje van de eerste plaat voor onderhoud en incubeer dit bij 37 °C in 5% CO2, met een dagelijkse mediumverversing met vers iPSC-medium. Kolonies zullen verschijnen op dag 14 tot 21 na transductie. Centrifugeer de pas gecoate plaat met de gesuspendeerde cellen bij 1.150 ×g bij 35 °C gedurende tien minuten.Incubeer de cellen na centrifugatie overnacht bij 37 °C in 5% koolstofdioxide. Verwijder de volgende dag het supernatant en vervang dit door vers medium voor geïnduceerde pluripotente stamcellen. Houd de gehechte cellen in stand door dagelijks het medium te verversen, totdat een confluentie van 80% is bereikt.Een week voor het plukken van kolonies zaait u 1 x 10⁴ cellen in een met vitronectine gecoate schaal van 100 mm. Bereid vervolgens een met vitronectine gecoate schaal van 60 mm voor door twee milliliter vitronectine-oplossing toe te voegen en deze gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur te incuberen. Markeer de kolonies met duidelijke grenzen op de bodem van de plaat met een markeerstift door middel van microscopie.Verwijder de vitronectine-oplossing uit de nieuwe plaat en voeg zes milliliter medium voor geïnduceerde pluripotente stamcellen toe, aangevuld met tien millimolaire RHO-kinase. Verwijder vervolgens het cultuurmedium van de cellen en was ze met drie milliliter PBS. Voeg daarna één milliliter iPSC-kolonie-losmaakoplossing toe en incubeer ze gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur.Verwijder daarna de oplossing uit de plaat en incubeer deze nog 30 seconden bij kamertemperatuur. Neem na 30 minuten 200 µL medium uit de plaat en detach de geselecteerde kolonies door te pipetteren. Draag de verspreide kolonies vervolgens over naar een nieuwe schaal van 60 mm.Incubeer en onderhoud de cellen bij 37 °C in 5% koolstofdioxide totdat ze passage tien hebben bereikt. In de vroege fase van herprogrammering waren iPSCs gemengd met de aangehechte, niet-hergeprogrammeerde gedifferentieerde cellen. Voorafgaand aan de expansie waren de iPSCs en andere cellen te onderscheiden.Door de cellen in een lage dichtheid uit te zaaien, werden kolonies verkregen die groot genoeg waren om te plukken. Na het isoleren van de kolonie werden de celklonters gedissocieerd tot enkelvoudige cellen en gekweekt. Vervolgens werden pure iPSC-kolonies waargenomen.Nadat de zuivere geïnduceerde pluripotente stamcellen waren uitgebreid, werd de kwaliteit van de cellen getest. Cellen werden gekleurd met alkalische fosfatase om de ongedifferentieerde staat van de geïnduceerde pluripotente stamcellen te bevestigen. Kolonies afgeleid van de geïsoleerde geïnduceerde pluripotente stamcellen vertoonden allen een positieve kleuring.Pluripotente markers werden bevestigd via immunofluorescentiekleuring. De gereprogrammeerde cellen vertoonden een hoge expressie van pluripotente markers, zoals SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 en, bovenal, TRA-1-60; de expressie van deze pluripotente markers werd bevestigd met RTPCR. Met behulp van seriële uitplating via centrifugatie werden de transit-PBMC's op een met matrix gecoate plaat gehecht.De bijlagen zijn bijgevoegd en iPSC-kolonies worden herhaald voor zuivering. Met dit protocol kunnen iPSC's binnen een maand uit PBMC's worden gegenereerd. Dit protocol verkort de tijd die nodig is voor de hechting van getransduceerde cellen en voorkomt het verlies van gereprogrammeerde cellen die niet in staat waren om zelfstandig te hechten.De zuivering van volledig gereprogrammeerde kolonievormende iPSCs kan echter van cruciaal belang zijn bij het uitvoeren van deze procedure. Voorheen hebben we PBMCs en mononucleaire cellen succesvol gereprogrammeerd met behulp van dit protocol. De gegenereerde iPCs afgeleid van bloedcellen kunnen breed worden ingezet in diverse onderzoeksvelden.Dit protocol kan helpen bij het herprogrammeringsproces van andere typen zwevende suspensiecellen voor verdere toepassingen en studies.

induced-pluripotent-stem-cell-generation-from-blood-cells-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

This video demonstrates the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) into induced neural stem cells (iNSCs) using Sendai virus. Sendai virus is a non-integrating virus that offers an efficient and safe vehicle for reprogramming cells.

Generation of Induced Neural Stem Cells (iNSCs) from Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMNCs): A Sendai Virus-based Procedure to Reprogram PBMNCs into iNSCs

Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed met behulp van een episoom gebaseerd herprogrammering strategie en histondeacetylaseremmers.

Efficiënte iPS Cell Generation van Blood behulp episomen en HDAC-remmers

Een werkwijze werd ontwikkeld om direct voort humane neurale stamcellen van hematopoïetische progenitorcellen verrijkte uit perifere bloedcellen.

Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Dit protocol beschrijft de efficiënte inductie van hemogene endotheel en multipotente hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen via de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft hoe geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen worden gegenereerd uit menselijke perifere T-cellen onder feeder-vrije omstandigheden door gebruik te maken van een combinatie van matrigel en Sendai-virusvectoren die reprogrammeringsfactoren bevatten.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden

Het doel van dit protocol is om het protocol te laten zien voor het herprogrammeren van in melanoom geïnfiltreerde tumorlymfocyten in geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke Melanoom-Tumor-infiltrerende lymfocyten

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Leer hoe je perifere bloedmononucleaire cellen omprogrammeert tot geïnduceerde pluripotente stamcellen met centrifugatie. Deze methode verbetert de toegankelijkheid van PBMC's voor regeneratieve geneeskunde en geneesmiddelenonderzoek.

Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

Meer video's verkennen