Tests voor de bestudering van de rol van Vitronectin in bacteriële hechting en een Serum

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in host-pathogen interactie veld, zoals hoe bacteriële ziekteverwekkers ziekte veroorzaken bij de mens door gebruik te maken van menselijke eiwitten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan beantwoorden als een ziekteverwekker Vitronectin kan gebruiken voor het vaststellen van infectie van de gastheer. We zullen ons richten op Vitronectin, een gastheereiwit dat deelneemt aan de extracellulaire matrix, maar ook functioneert als een complementremmer in determinant traject van complementactivering.

Deze feiten zijn zeer belangrijk en zeer aantrekkelijk voor ziekteverwekkers die ziekte veroorzaken bij de mens. Ter voorbereiding op flow cytometrie, resuspend de bacteriële pellets met 50 microliters van het blokkeren buffer met 250 nanomolar Vitronectin. Vervolgens, incubeer de monsters voor een uur op kamertemperatuur zonder te schudden.

Na incubatie, pellet de bacteriën door centrifugatie op 3, 500 g gedurende vijf minuten. Vervolgens, was de pellets drie keer met behulp van PBS en soortgelijke centrifugatie stappen. Voeg na het wassen 50 microliter primaire schapen antimenselijke Vitronectine polyklonale antilichamen toe aan de bacteriële pellet bij een verdunning van één tot 100 in PBS BSA.

De vering een uur bij kamertemperatuur uitbroeden. Was vervolgens de bacteriën drie keer met PBS om niet-gebonden antilichamen te verwijderen. Voeg vervolgens 50 microliter PBS BSA toe met fluoresceïne isothiocyanaat geconjugeerde ezelanti-schapen polyklonale antilichamen aan de pellet.

Incubeer bij kamertemperatuur gedurende een uur in het donker. Tot slot, na drie wasstappen, resuspend de bacteriële pellet met 300 microliters van PBS en analyseren door stroom cytometrie. Ter voorbereiding op ELISA, 100 microliter eiwitoplossing in elke put van een PolySorp microtiterplaat.

Sluit de plaat met het deksel en bewaar 's nachts op vier graden Celsius om de immobilisatie van eiwitten op microtiterplaatputten te vergemakkelijken. Gooi de oplossing van de microtiterplaat door ondersteboven over de gootsteen te kantelen. Was vervolgens de putten drie keer met 300 microliter PBS per put.

Blokkeer de gecoate putten gedurende een uur bij kamertemperatuur met PBS met 2,5 gewichtsvolumecent BSA. Na het verwijderen van de blokkeeroplossing, was de putten drie keer met 300 microliter PBST per put. Voeg nu 100 microliter van 50 nanomolar recombinant zijn-tagged PH aan elk monster.

Voeg in de controleputten slechts 100 microliter pbs BSA toe. Broed de plaat een uur lang in bij kamertemperatuur. Na incubatie, gooi de eiwitoplossing weg en verwijder de niet-gebonden eiwitten door de putten drie keer te wassen met 300 microliters pbst per put.

Voeg vervolgens 100 microliter PBS BSA toe met paardenradijsperoxidase geconjugeerde anti-zijn polyklonale antilichamen. Na het uitbroeden gedurende een uur bij kamertemperatuur, was de putten drie keer met 300 microliter PBST per put. Detecteer de antigeen-antilichaam complexen door het toevoegen van 100 microliter van ELISA detectie reagens aan elke put.

Voeg vervolgens 50 microliters van één molair zwavelzuur per put toe om de reactie te stoppen. Meet de optische dichtheid van de putten op 450 nanometer met behulp van een microplatelezer. Immobiliseer menselijke Vitronectin op amine reactieve sensoren met behulp van de amine koppelingsmethode volgens de richtlijnen van de fabrikant.

Met behulp van PBS verdun je de recombinant PH-ligand in serie van nul naar vier micromolar en breng je de resulterende oplossingen over naar een 96-goed zwarte flat-bottom microtiterplaat. Voer het experiment uit op 30 graden Celsius met behulp van een biolaag interferometrie-instrument. Pipette 10 microliters van een twee microgram per milliliter oplossing van Vitronectin in PBS op een glazen microscoop schuif als een enkele druppel.

Laat de druppel 30 minuten drogen op de glijbaan bij kamertemperatuur. Was de glazen glijbanen met eiwit bedekte dia's drie keer door ze twee seconden in een beker met PBS te dompelen om overtollig ongecoat eiwit te verwijderen. Voeg nu 10 milliliter van een verse Hif-cultuur toe in een steriel plastic petrischaaltje en dompel de gecoate glazen platen onder in het kweekmedium.

Incubeer de gerechten op 37 graden Celsius voor een uur met schudden op 20 RPM. Na incubatie, verwijder alle niet-gebonden bacteriën door het onderdompelen van de dia's drie keer in een beker gevuld met PBS voordat visualiseren van de gebonden bacteriën door Gram kleuring zoals beschreven in het tekstprotocol. Cultuur A549 epitheelcellen zoals beschreven in het tekstprotocol.

Verdun na één was- en trypsinisatie van de cellen bij 37 graden Celsius de celsuspensie tot 5.000 cellen per milliliter met behulp van een compleet medium met vijf microgram per milliliter gentamycine. Voorafgaand aan bacteriële infectie, vervang het medium in de putten met F12 medium en incubeer 's nachts op 37 graden Celsius. Was de celmonolaag drie keer met één milliliter PBS bij kamertemperatuur.

Plaats vervolgens de plaat op ijs en 200 microliters van voorgekoeld F12-medium met 10 microgram per milliliter Vitronectin. Na het uitbroeden van de plaat op vier graden Celsius gedurende een uur, gooi de oplossing door pipetten en was de cellaag twee keer met een milliliter PBS bij kamertemperatuur. Voeg 100 microliters van vers geteelde Hif wild type in F12 medium aan elke put.

Broed de plaat twee uur lang in bij 37 graden Celsius. Spoel vervolgens het medium aan met een pipet en was de A549 epitheelcellen drie keer met PBS. Voeg 50 microliter per put van celloslating oplossing en volg met een vijf minuten incubatie bij 37 graden Celsius.

Voeg vervolgens 50 microliters F12 compleet medium per put toe om de enzymatische reactie te stoppen. Breng de epitheelcellen van elke put naar een zes milliliter glazen buis met vier glazen kralen. Lyse de cellen op kamertemperatuur door vortexing gedurende twee minuten.

Na verdunning van het cellysaat 100-voudige, plaat 10 microliter van het verdunde monster op een chocolade agar plaat. Tel de kolonies na een nachtelijke incubatie op 37 graden Celsius. Om de analyse van Vitronectin-afhankelijke resistentie tegen de bactericide activiteit van menselijk serum uit te voeren, eerste cultuur en pellet de bacteriën zoals beschreven in het tekstprotocol.

Na centrifugatie, resuspend de bacteriële pellet met een volume van Dextrose-Gelatine-Veronal buffer. Voeg nu 1,500 CFU bacteriën toe aan 100 microliter van DGVB plus plus plus met 5% serum. Incubeer het monster op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten met schudden op 300 RPM.

Verwijder een 10 microliter aliquot uit het reactiemengsel op nul minuten en 15 minuten. Plaats de aliquot op chocolade agar en incubeer de plaat op 37 graden Celsius 's nachts. Tel na incubatie van de chocoladeagarplaten de kolonies die op de platen verschijnen en bereken het percentage bacteriën dat is gedood zoals beschreven in het tekstprotocol.

Alle Hif klinische isolaten getest in deze studie aangeworven Vitronectin aan het celoppervlak, zoals bepaald door flow cytometrie. Binding van Vitronectin door het wilde type Hif stam veroorzaakte een verschuiving in de bevolking, terwijl de mutant niet binden Vitronectin. Eiwit-eiwit interacties tussen de belangrijkste Vitronectine-bindende eiwit PH en Vitronectin werden geschat door ELISA.

De resultaten wijzen op een significante interactie tussen PH en zowel Vitronectin als de positieve controle ten opzichte van de negatieve controle. De interactie tussen PH en Vitronectin werd in real-time geschat met behulp van biolaag interferometrie om een affiniteit van 2,2 micromolar te hebben. Bovendien vertoonde bacteriële niet-expressie van PH op het celoppervlak verminderde hechting aan vitronectin-gecoate glasoppervlakken in vergelijking met wildtypecellen.

Bovendien verbeterde de aanwezigheid van Vitronectin op het oppervlak van epitheliale cellen de hechting van Hif aanzienlijk. Om de complementremmende activiteit van Vitronectin te schatten, werd serumgemedieerde moord onderzocht. Wild type Hif cellen vertoonden een hogere serumresistentie dan gemuteerde cellen.

Er werden geen bacteriën gedood in aanwezigheid van warmte-geïnactiveerd serum. Interessant is dat wilde type Hif verminderde overleving vertoonde in vitronectin-uitgeput serum en aanvulling van Vitronectin verhoogde bacteriële overleving. De gemuteerde stam reageerde echter niet op Vitronectin-uitputting omdat het Vitronectin niet kon rekruteren op het celoppervlak.

Eenmaal onder de knie, deze techniek kan worden gedaan in drie tot vier dagen voor elke ziekteverwekker en vergeet niet om de verse cultuur van de bacteriële pathogenen te gebruiken. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip hebben over hoe u de Vitronectin-binding aan een ziekteverwekker analyseren. Naast deze techniek kunnen Vitronectin bindende oppervlakteeiwitten van bacteriën worden geïdentificeerd met behulp van proteomics en western blotting.

Deze techniek is belangrijk voor de onderzoekers op het gebied van gastheer-pathogene interactie en ook om het mechanisme van virulentie in bacteriën te verkennen.