Name: Geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: Imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde Clones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Leer een geavanceerd diermodel voor leverkolonisatie door metastatische tumorclonen uit colorectale kanker. Deze methode maakt kwantitatieve visualisatie en identificatie van genen mogelijk voor verbeterde diagnostiek en therapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag bedanken Dr. Geoffrey L. Greene (University of Chicago) voor de Luc2-tdTomato plasmide en de HCT116 cellijn, Mr. Ani Solanki (Animal Resource Center) voor de muizen management, en Dr. Lara Leoni voor de hulp de DLIT. Kwantificering van fluorescente en lichtgevende intensiteiten werden uitgevoerd in de Integrated Small Animal Imaging Research Resource aan de Universiteit van Chicago op een IVIS Spectrum (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Dit werk werd ondersteund door de Virginia en DK Ludwig Fonds voor Kankeronderzoek, de Lung Cancer Research Foundation (LCRF), de Prostate Cancer Foundation (PCF), en het Cancer Center Ondersteuning Grant (P30CA014599). De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, gegevensverzameling en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript.

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Chicago (Protocol # 72213-09) en uitgevoerd onder steriele omstandigheden. 1. Voorbereidingen <ol><li> Voeg 500 ml medium voor de kweek van HCT 116 tumorcellen: Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine. </li><li> Autoclaaf de instrumenten die worden gebruikt voor de milt injectiemodel, waaronder 3-4 chirurgische handdoeken, gaas, twee kleine Adson pickups, een naald driver, twee scharen, een klemmetje en 3 microclips, bij 251 ° F gedurende 20 min . </li><li> Bereid postoperatieve anesthesie voor de muizen subcutaan worden toegediend na de milt injectie. Verdun 2-4 ug buprenorfine in 500 ul van 0,9 fysiologische zoutoplossing per muis. </li><li> Bereid hoeveelheden van 150 ug / 150 pl van vuurvlieg luciferine voor intraperitoneale injecties during de bioluminescentie assays. Bewaren bij -20 ° C en beschermen tegen licht. </li></ol> 2. Genereren van Luciferase / tdTomato gemerkte monoklonale cellijnen 10,11 <ol><li> Ontdooien en onderhouden HCT116 humane colorectale kankercellen en 293FT humane embryonale niercellen in DMEM met 10% FBS, 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine. Handhaven in de cultuur bij 5% CO 2 en 37 ° C. </li><li> Maak een high-titer lentivirus. <ol><li> Op D 1, plate 10 - 12 x 10 6 293FT cellen tussen passage 3 en 10 in 15 cm celcultuurschalen in 18 ml compleet DMEM (cDMEM) met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine en 1% niet-essentiële aminozuren . Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Op D 2, transfecteren van de cellen met het volgende transfectie oplossing: <ol><li> Voor elk gerecht, gebruikt u de volgende: een DNA-mengsel van 37,5 ug pFUG lentivirale vector ingebracht met de luciferase (Luc2) en tdTomatoconstrueert 11 (een gift van Dr. Geoffrey Greene aan de University of Chicago), 25 ug pCMVΔ8.74 en 12,5 ug pMD2.G geresuspendeerd in een totaal van 1062 pl steriel H2O Voeg 188 ul van 2 M CaCl2. </li><li> Voeg 1250 ul 2x Hepes-gebufferde zoutoplossing (HBS, 50 mM Hepes, 1,5 mM Na 2 HPO 4, en 180 mM NaCl, pH 7,12) bij de DNA / CaCl2 oplossing werd een druppelsgewijs, terwijl bellenblaas via oplossing met een pipet. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min en voeg 15,5 ml RT cDMEM en chloroquine tot een eindconcentratie van 25 uM maken. </li></ol></li><li> Aspireren de media in elk gerecht van 293FT cellen en te vervangen door de transfectie oplossing. Voeg 16 ml van de transfectie oplossing langzaam, zoals de vergulde cellen gemakkelijk los te maken. </li><li> Op D 3, na 8-16 uur, verwijder de transfectie-oplossing en was de cellen eenmaal met Dulbecco&#39;s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), opnieuw taking zorg de cellen niet te verjagen. Vervang de media met 18 ml vers cDMEM met 10 mM Hepes. OPMERKING: Verplaats gerechten, zuigen de transfectie oplossing en voeg de media door de zijwand van de platen om te voorkomen dat de cellen los te maken. </li><li> Op D 4, bij 48 uur vanaf het moment van transfectie, laat de inhoud van de gerechten door langzaam opzuigen met een pipet om te voorkomen dat de cellen los te maken. Centrifugeer de verzamelde media bij 300 xg gedurende 5 minuten om de grote celafval neer te slaan. </li><li> Filtreer het virale supernatant met een 0,45 urn lage eiwitbinding filter kolf en centrifuge met een SW-28 rotor gedurende 2 uur bij 50.000 xg en 4 ° C. Decanteer het supernatant onmiddellijk na het centrifugeren voltooid en droog de binnenzijde van de buis met wissers. </li><li> Resuspendeer de virale pellet in 50 ul van Reduced Serum Medium (RSM) met 1% FBS. Aliquots kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C voor toekomstig gebruik (virusvoorraad). </li></ol></li><li> Transduceren de lentiviruses in de HCT116-cellen en het genereren van een panel van tdTomato-positieve klonen. <ol><li> Plaat de HCT116-cellen in een dichtheid van 1 x 10 5 in 24 putjes 1 d vóór de virale infectie. </li><li> Verdun 40 pi geresuspendeerde virus (uit 2.2.7) in 4 ml RSM (1: 100 verdunning) met 1% penicilline / streptomycine en 8 ug / ml polybreen (CRSM). </li><li> Op de dag van infectie was de cellen eenmaal met DPBS en voeg 250 ul verdunde virusoplossing uit stap 2.3.2 aan elk putje. Incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C en 5% CO2 en voeg 1 ml cDMEM aan elk putje; incuberen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 48-72 uur. </li><li> Resuspendeer de cellen met 1 ml 0,05% trypsine en 0,53 mM EDTA en voeg 1 ml cDMEM de trypsine te neutraliseren. Overdracht van de cellen naar een microcentrifugebuis en pellet bij 300 g gedurende 4 min. Was de pellet 3x in 1 ml Hanks &#39;Balanced Salt Solution (HBSS) plus 2% FBS. </li><li> Resuspendeer de pellet uit stap 2.3.4met FACS buffer (2% FBCS en 2 mM EDTA in PBS) in een enkele-celsuspensie bij 1 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Sorteer de tdTomato-positieve HCT116 cellen met behulp van een cel sorter, venstertijd voor PE-positieve cellen (excitatie / emissie: 556/585 nm). Groeien de verzamelde cellen in een 10 cm schotel bij 5% CO 2 en 37 ° C op ouderschapsverlof tdTomato-positieve HCT116 cellen (Figuur 1A) te genereren. </li><li> Resuspendeer de ouderlijke tdTomato-positieve HCT116 cellen van 2.3.6 met 8 ml van 0,05% trypsine en 0,53 mM EDTA gedurende 3-5 minuten en voeg 8 ml cDMEM om de trypsine te neutraliseren. <ol><li> Overdracht van de cellen om een ​​50 ml buis en pellet bij 300 g gedurende 4 min. Verwijder de bovenstaande vloeistof en verdun de ouderlijke tdTomato-positieve HCT116 cellen 1 cel per 200 pl in cDMEM (Figuur 1B). </li></ol></li><li> Plaat een enkele cel (200 ul van de verdunning) per putje in een 96-putjes plaat bij 5% CO2 en 37 ° C (Figuur 1C). </li><li> Grow individuele monoclones in kolven bij 5% CO 2 en 37 ° C. (Figuur 1D). </li></ol></li></ol> 3. Calibration van Fluorescent intensiteit van het signaal als een functie van het aantal cellen <ol><li> Plaat de getransfecteerde HCT116 cellen, nu aangeduid als HCT116-L2T, bij een dichtheid van 0, 10 3, 2 x 10 4, 3 x 10 5, 5 x 10 4, 7 x 10 4, 9 x 10 4, en 10 5 cellen / putje in 96 putjes in triplo voor elke dichtheid. </li><li> Na 5 uur incubatie kwantificeren tdTomato fluorescentie intensiteiten middels IVIS 10. <ol><li> Klik op het icoon software-image op het bureaublad om de software te starten. Klik op de &quot;initialiseren&quot; toets om de imaging-systeem initialiseren. Na de initialisatie is voltooid (dat duurt ongeveer paar min), selecteer &quot;Fluorescentie&quot;, &quot;4 seconden&quot; belichtingstijd, &quot;Medium&quot; binning, &quot;2&quot; F / stop, &quot;535&quot; excitatie filter,en &quot;580&quot; emissie filter. </li><li> Plaats de plaat met 96 op de imaging station en klik op &quot;Ophalen&quot; om beeldvorming te starten. Nadat het beeld wordt verkregen, klikt u op &quot;ROI Tools&quot; in het palet en selecteer 12 x 8 van het pictogram spleet. </li><li> Maak een 12 x 8 spleten om het gebied van het signaal op het imago van de plaat met 96 dekken en klik op het tabblad metingen. Observeer een venster met een lijst van ROI metingen met eenheden van fotonen per s per steradiaal per vierkante cm (fotonen / s / sr / cm2). </li></ol></li><li> Teken een scatterplot met het argument (X-as) gelijk aan het aantal cellen en de functie (y-as) die signaalintensiteit. Bepalen regressiekrommen met een gegevensanalyse software om de hoeveelheid cellen die overeenkomt met de eenheid van fluorescentie-intensiteit te berekenen (figuur 2) 10. </li></ol> 4. diermodel van leveruitzaaiingen <ol><li> Zodra de HCT 116-L2T cellen te bereiken 70- 80% confluentie, bereid ze ongeveer 1 uur voor de injectie milt. Distantiëren de cellen met behulp van 0,05% trypsine in 0,53 mM EDTA gedurende 3-5 minuten, en vervolgens neutraliseren ze met evenveel cDMEM. Zorg ervoor dat u grondig pipet om klonteren te voorkomen. </li><li> Tel de cellen met een automatische cel teller. </li><li> Resuspendeer de cellen in 1x DPBS tot een concentratie van 1,2-2 x 10 6 cellen / 100 pl. Zorg ervoor dat u pipet en resuspendeer de cellen grondig te klonteren te voorkomen. </li><li> Houd de cellen op ijs tot injectie, ze af te resuspenderen in de buis. </li><li> Voorafgaand aan de muizen verlamming, bieden een preoperatieve verdoving vloeistofbolus door subcutaan injecteren 500 pi van de buprenorfine mengsel in stap 1.3 beschreven. Dien dezelfde dosis buprenorfine aanvullende mengsel tweemaal per dag tot tekenen van pijn (verminderde mobiliteit, gebogen gestalte, niet verzorgen, vocalisatie bij hantering) opgelost. </li><li> Verdoven 6- tot 8-weekse-old vrouwelijke athymische naakt muizen met 2% isofluraan in zuurstof in een anesthesie kamer. Controleer of de muizen volledig onder verdoving door knijpen de staart. Gebruik dierenarts zalf op de ogen te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving. Transfer elk verdoofd muis om een ​​individuele neuskegel van de milt injectie. Vóór incisie moet elke muis worden bedekt met een steriele chirurgische doek. </li><li> Identificeer de milt als paarse gebied buiten gezien door de huid op de linkerflank van het naakt muizen. Met behulp van microdissectie schaar, maak een 8 mm linker flank incisie op de huid net boven de milt. <ol><li> Vervolgens til op de buikwand en maak een kleine incisie. Zodat de lucht in de buikholte is de inwendige organen verder weg van de incisie. Vergroot de buikwand incisie tot ongeveer 5 mm. </li><li> Expose de milt door voorzichtig druk uit te oefenen rond de incisie met een wattenstaafje. Indien nodig kan de pancreas vet voorzichtig manipulated om blootstelling om te voorkomen dat de milt verwonden. </li></ol></li><li> Injecteer langzaam 100 ul cellen onder toepassing van een 1 ml spuit met een 27 G naald in het uiteinde van het blootgestelde milt. Injecteer langzaam gedurende een periode van ten minste 30 - 60 s, om extra levertumoren voorkomen. </li><li> Plaats een microclip de milt voordat de naald aan het einde van de injectie om lekken van de geïnjecteerde celsuspensie voorkomen. </li><li> Laat de microclip in de plaats voor 5 min. </li><li> 5 min na de injectie, splenectomie voeren via een handbediende cauterisatie inrichting voor hemostase. Ontleden de milt hilum, vanaf de voorste kant. Bij het ontleden van grote schepen, pre-stollen de proximale zijde van de schepen met aangrenzende vetweefsel, met behulp van cauterisatie aan overmatig bloeden te voorkomen. LET OP: Methoden voor hemostase: stollen het bloeden punt rechtstreeks met cauterisatie, druk uit te oefenen om het bloeden voor 3-5 min of hechting-ligeren het bloeden punt met een 5-0 zijden stropdas. </li&gt; <li> Sluit de flank insnijding van elke muis in twee lagen. Ten eerste, sluit de buikwand met een 5-0 absorbeerbare gevlochten hechtmateriaal (bijvoorbeeld Vicryl) in een enkele horizontale steek. Vervolgens sluit de huid met behulp van een niet-absorbeerbare 4-0 monofilament hechtdraad (bijv prolene), opnieuw met een enkele horizontale steek. </li><li> Reinig alle instrumenten door het sproeien van 70% isopropanol om steriele omstandigheden tussen elke procedure te handhaven. OPMERKING: Zorg ervoor dat de dieren worden opgewarmd, terwijl ze ontwaken uit narcose. Monitor alle muizen postoperatief totdat ze ambulant worden en terug te keren naar de normale activiteit. Kenmerkend is de hersteltijd is ongeveer 3-5 minuten. Hebben dieren niet onbeheerd achter te laten totdat ze voldoende bewustzijn hebben herwonnen om borstligging handhaven. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren totdat deze volledig is hersteld niet meer terug. </li></ol> 5. bioluminescentie beeldvorming <ol><li> Voer beeldvorming opwekelijks te meten en veranderingen in de bioluminescentie te kwantificeren in de tijd. </li><li> Plaats muizen in een kamer anesthesie en verdoven ze met 2% isofluraan in zuurstof. Controleer of de muizen volledig onder verdoving door knijpen de staarten. Gebruik dierenarts zalf op de ogen te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving. </li><li> Vervolgens intraperitoneaal injecteren elke muis met 150 ul van de voorbereide vuurvlieg luciferine van stap 1,4. </li><li> Plaats de muizen in een IVIS met individuele neus kegels toedienen van isofluraan. Plaats de muizen in rugligging met afstandhouders tussen het signaal aan aangrenzende muizen minimaliseren. Een maximum van vijf muizen kunnen worden afgebeeld in een keer. </li><li> Meten en analyseren lichtgevende intensiteiten 3 minuten na luciferine injectie. <ol><li> Na het initialiseren van de IVIS zoals beschreven in stap 3.2.1, selecteer &quot;Lichtende&quot;, &quot;1 seconde&quot; belichtingstijd, en &quot;Medium&quot; binning. </li><li> Klik op de knop &quot;Ophalen&quot; naar Imagin beginneng. Zorg ervoor dat u elke beeldvorming uit te voeren op een consistente tijd (3 min) na de luciferine injectie. </li><li> Nadat het beeld wordt verkregen, zal een beeld venster en het gereedschap palet verschijnen. Klik &quot;ROI Tools&quot; en kies &quot;1&quot;, &quot;2&quot;, &quot;3&quot;, &quot;4&quot; of &quot;5&quot; van de cirkel icoon voor het aantal muizen afgebeeld. </li><li> Om Regions of Interest (ROI) te definiëren, omcirkelen het signaal gebied van het luminescente signaal in de buikholte van de muis, en klik vervolgens op &quot;metingen&quot; van de ROI als een willekeurige eenheid van stralende efficiëntie ((fotonen / s / cm2 / steradiaal) / (uW / cm 2)). Zorg ervoor dat u een extra ROI cirkel van de achtergrond te hebben. </li></ol></li><li> Vier weken na de injectie en vóór dieroffer Voer Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) via IVIS de tumorlast en verspreiden via real-time 3D reconstructie van lichtgevende intensiteiten van individuele tumor kolonies evalueren. <ol&gt; <li> Verdoven de muizen en injecteer luciferine, zoals beschreven in stap 5.2.4. DLIT wordt uitgevoerd op één muis tegelijk. </li><li> Na het initialiseren van de IVIS, zoals beschreven in stap 3.2.1, selecteer &quot;Imaging tovenaar&quot;, &quot;Bioluminescentie&quot;, en klik op &quot;Next&quot;. Selecteer &quot;DLIT&quot; en klik op &quot;Next&quot;. Selecteer &#39;Firefly&#39; sondes en klik op &quot;Next&quot;. Selecteer &quot;mouse&quot; image onderwerp, &quot;Auto&quot; exposure parameter, &quot;C-13 cm&quot; gezichtsveld, en &quot;0,5 cm&quot; subject hoogte, en klik op &quot;Next&quot;. Klik op de &quot;Acquire&quot; om beeldvorming te starten. </li><li> Nadat het beeld wordt verkregen, selecteert u het tabblad &quot;DLIT 3D reconstructie&quot; en de &quot;Analyseren&quot; tab en klik op &quot;Reconstruct&quot; het imago van de 3D-reconstructie te genereren. </li><li> Klik op &quot;Tools&quot; en &quot;3D-animatie&quot;. Selecteer &quot;Spin CCW op de Y-as&quot; in de animatie venster 3D. Klik op &quot;Record&quot; en &quot;Save&quot; in een .mov formaat bestand. </li></ol></li></ol> 6. Ex Vivo TL-Imaging <ol><li> Offer de muizen door cervicale dislocatie terwijl verdoofd of volgens de institutionele richtlijnen op 4-6 weken na de injecties milt. </li><li> Oogst de lever. Maak een horizontale snede van links naar rechts flank. Grijpen de zwaardvormig proces met een pick-up, ontleden de falciform, de leverader en de vena cava inferior. <ol><li> Ontleden het recht hepatorenale ligament, de hepatoduodenale ligament, en de linker hepatorenale ligament, het verzorgen van de Spiegelse kwab niet te verwonden, terwijl het ontleden van de hepatoduodenale ligament. Na het oogsten van de lever, verwijder de galblaas, omdat dit autofluorescentie wordt weergegeven. Noteer eventuele aanvullende extra-levertumoren aanwezig. </li></ol></li><li> Nemen nota van de aantallen en de grootte van levertumoren aanwezig macroscopisch, en leg de geoogste levers in DPBS. OPMERKING: Tumoren zijn macroscopisch zichtbaar voor het blote oogals witte tumoren (een representatief voorbeeld zie figuur 4). </li><li> Voorafgaand aan plaatsing op de beeldvorming vel, neem elke lever en verwijder voorzichtig overtollige vloeistof door te deppen op een papieren handdoek. </li><li> Meet de fluorescentie-intensiteiten van elke tumor kolonie met behulp van de IVIS. <ol><li> Selecteer &quot;Fluorescentie&quot;, &quot;4 seconden&quot; belichtingstijd, &quot;Medium&quot; binning, &quot;2&quot; F / stop, &quot;535&quot; excitatie filter, en &quot;580&quot; emissie filter. Klik op de &quot;Acquire&quot; om beeldvorming te starten. </li><li> Na het verkrijgen van het beeld, zoek de afbeelding raam en gereedschap palet. Klik op &quot;ROI Tools&quot; en selecteer &quot;1&quot; van de cirkel icoon. Om ROI te definiëren, omcirkelen het signaal gebied van individuele tumor kolonies op de afbeelding en klik vervolgens op &quot;metingen&quot; van de ROI als een willekeurige eenheid van stralende efficiëntie ((fotonen / s / cm2 / steradiaal) / (uW / cm2) ). Zorg ervoor dat u een extra ROI cirkel van de achtergrond te hebben. </li></ol&gt; </li><li> Bereken de totale tumorvolume van de veronderstelling dat een bol. Tumor volume = 4 x π xr 03/03 (r = straal). Bereken de fractie van tumorcellen kolonievormende cellen (Fc) als het aantal tumoren in de lever gedeeld door het aantal cellen splenically geïnjecteerd. </li><li> Bereken het totale aantal cellen per kolonie (= X) van de lineaire benadering van stap 3.3. Bereken het aantal celdelingen (= Y) als Y = log 2 x en de Td Td (dag) = 28 / Y. </li></ol>

<ol><li>Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+score+for+predicting+recurrence+after+hepatic+resection+for+metastatic+colorectal+cancer%3A+analysis+of+1001+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases.</a> Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).</li>
<li>Pawlik, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surgical+margin+status+on+survival+and+site+of+recurrence+after+hepatic+resection+for+colorectal+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases.</a> Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).</li>
<li>Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+Cancer%2C+Systemic+Inflammation%2C+and+Outcome%3A+Staging+the+Tumor+and+Staging+the+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host.</a> Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).</li>
<li>Veen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Follow-Up+and+Survivorship+After+Completing+Systematic+Surveillance+in+Stage+I-III+Colorectal+Cancer%3A+Who+Is+Still+at+Risk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastrointest.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk.</a> J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).</li>
<li>Siegel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+treatment+and+survivorship+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer treatment and survivorship statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).</li>
<li>O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+cancer+survival+rates+with+the+new+American+Joint+Committee+on+Cancer+sixth+edition+staging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging.</a> J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).</li>
<li>House, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+after+hepatic+resection+for+metastatic+colorectal+cancer%3A+trends+in+outcomes+for+1%2C600+patients+during+two+decades+at+a+single+institution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Surg%22%5BJournal%5D)">Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution.</a> J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).</li>
<li>Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+bioluminescence+imaging+of+colorectal+liver+metastases+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse.</a> J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).</li>
<li>Rajendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+bioluminescent+hepatic+tumour+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine bioluminescent hepatic tumour model.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li>
<li>Oshima, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+tumor+clones+with+differential+liver+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging of tumor clones with differential liver colonization.</a> Sci. Rep. 5 (10946), (2015).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Wang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analyses+identify+osteopontin%2C+LAMB3+and+ITGB1+as+critical+pro-metastatic+genes+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer.</a> PLoS One. 8 (2), e55714(2013).</li>
<li>Fidler, I. J., Kripke, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+results+from+preexisting+variant+cells+within+a+malignant+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor.</a> Science. 197 (4306), 893-895 (1977).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Khodarev, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT1+pathway+mediates+amplification+of+metastatic+potential+and+resistance+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy.</a> PLoS One. 4 (6), e5821(2009).</li>
<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-organ+microenvironment+interactions+in+the+pathogenesis+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis.</a> Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligo-+and+polymetastatic+progression+in+lung+metastasis%28es%29+patients+is+associated+with+specific+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs.</a> PLoS One. 7 (12), e50141(2012).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+characterizes+oligometastasis%28es%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es).</a> PLoS One. 6 (12), e28650(2011).</li>
<li>Calon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+colorectal+cancer+on+a+TGF-beta-driven+program+in+stromal+cells+for+metastasis+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation.</a> Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).</li>
<li>Vanharanta, S., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+metastatic+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Origins of metastatic traits.</a> Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).</li>
<li>Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways%3A+Interferon%2FStat1+Pathway%3A+Role+in+the+tumor+resistance+to+genotoxic+stress+and+aggressive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth.</a> Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-stimulated+gene+15+%28ISG15%29+is+a+trigger+for+tumorigenesis+and+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma.</a> Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).</li>
<li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li>
<li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> J. Vis. Exp. (27), e51677(2014).</li>
<li>Evans, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mice+to+men%3A+Murine+models+of+colorectal+cancer+for+use+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het dier model voorgesteld in het huidige rapport is gebaseerd op twee belangrijke benaderingen. Ten eerste, om het vermogen om metastatische klonen met verschillende neigingen waarnemen te koloniseren en prolifereren in de lever te waarborgen, een panel van zeer heterogene monoklonale cellijnen werd vastgesteld ipv een vastgestelde ongefractioneerde kankercellijn 12,13. De monoklonale benadering van metastase ontwikkeling wordt gerechtvaardigd door de recente genomische data 14 en werd met succes ...

Patiënten met levermetastasen van primaire colorectale kanker (CRC) worden gekenmerkt door een slechte prognose. De 5-jaarsoverleving voor de primaire nonmetastatic CRC (stadium I - III) wordt geschat op 75-88% 3,4, terwijl patiënten met leveruitzaaiingen (fase IV) hebben een 5-jaarsoverleving van slechts 8 - 12% 5 , 6. Echter, metastatische patiënten vormen een heterogene groep, die zich presenteren met verschillende aantallen metastasen en verschillende herhaling tijden. Klinische waarnemingen geven aan dat het aantal metastasen en de grootte van een enkele metastase (evenredig aan de plaatselijke groeisnelheid) (die evenredig koloniserend vermogen of de frequentie van kolonisatie kan zijn) onafhankelijke prognostische factoren 1,7. Met andere woorden, het succes van klonen metastatische kolonisatie van de lever is afhankelijk van twee belangrijke eigenschappen: ze kunnen groeien en hun vermogen om te verspreiden en te overleven in de lever micromilieu. Het ontwerpsuccesvolle klinische modellen met de mogelijkheid van het vastleggen en kwantificeren van de eigenschappen van metastatische klonen drastisch ons begrip van levermetastasen biologie verbeteren en een effectief hulpmiddel voor het ontwerpen van mogelijke therapeutische benaderingen. Modellen van experimentele levermetastasen zijn eerder gerapporteerd 8,9, maar geen van beide ontvangen het vermogen om kwantitatief vast te leggen en te beschrijven eigenschappen van afzonderlijke uitgezaaide klonen zowel in vivo als ex vivo. Hier presenteren we een nieuwe geavanceerde model van levermetastasen dat de vorming van tumor klonen met verschillende efficiënties lever kolonisatie en groei eigenschappen omvat. We gebruikten een combinatie van dubbele-labeling van kankercellen met luciferase en tdTomato fluorescerend eiwit met de productie van monoklonale cellijnen die intrinsieke verschillen in metastatische capaciteit. In dit experimentele model, de gegevens blijkt dat de ontwikkeling vanlevermetastasen kan worden beschreven in termen van frequentie en kolonisatie verdubbelingstijd (Td), wat overeenkomt met klinische waarnemingen. De kwantitatieve karakter van dit model maakt het gemakkelijk adoptable voor de ontdekking van geneesmiddelen en diagnostische doeleinden.

<table><tbody><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>124262</td><td>In Vivo imagingsysteem</td></tr><tr><td>LivingImage 4.0 Software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>128165</td><td>Imagingsoftware</td></tr><tr><td>VAD-MGX Research Anesthetic Machine</td><td>Vetamac</td><td>VAD-MGX</td><td>Inhalatieanesthesietoestel</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>Cellcultuurreagentia</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>Cellcultuurreagentia</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 &mu;g streptomycin)</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>Cellcultuurreagentia</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>24020117</td><td>Cellcultuurreagentia</td></tr><tr><td>Buprenex Injection (0.3 mg/mL)</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td>Buprenorfinehydrochloride</td></tr><tr><td>Gemini Cautery System</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>Handbediende cauterisatie voor splenectomie</td></tr><tr><td>Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5426</td><td>Hemoclip: Hemostase-instrumenten na injectie van de milt</td></tr><tr><td>D-luciferin, potassium salt</td><td>Goldbio Technology</td><td>LUCK-1G</td><td>Luciferinekaliumzout</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>Reduceerd serummedium</td></tr><tr><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td>BIO-RAD</td><td>1450102</td><td>Automatische celteller</td></tr><tr><td>JMP10 software&nbsp;</td><td>SAS Institute</td><td></td><td>Data-analysesoftware</td></tr><tr><td>BD FACSAria II cell sorter</td><td>BD Biocsiences</td><td></td><td>Cellsorter</td></tr></tbody></table>

geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde clones

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patiënten met een beperkt aantal levermetastasen en langzame snelheden van progressie succes kan worden behandeld met lokale behandeling benaderingen 1,2. Er is echter weinig bekend over de heterogeniteit van levermetastasen en diermodellen staat zijn de ontwikkeling van afzonderlijke metastatische kolonies nodig. Hier presenteren we een geavanceerd model van levermetastasen dat het vermogen om kwantitatief visualiseren de ontwikkeling van individuele klonen tumor in de lever en schatten hun groeikinetiek en kolonisatie efficiëntie wordt bereikt. We genereerden een paneel van monoklonale derivaten van HCT116 humane colorectale kankercellen stabiel gelabeld met luciferase en tdTomato en die verschillende groei-eigenschappen. Met een milt injectie, gevolgd door een splenectomie, de meerderheid van deze klonen kunnen levermetastasen genereren, maar met verschillende frequenties kolonisatie en variërende groei. Met behulp van de in vivo beeldvorming System (IVIS), is het mogelijk te visualiseren en kwantificeren metastase ontwikkeling van in vivo en ex vivo luminescerende fluorescente beeldvorming. Bovendien Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) een 3D verdeling van levermetastasen in vivo. Ex vivo fluorescentie beeldvorming van geoogste levers levert kwantitatieve metingen van afzonderlijke hepatische metastatische kolonies, waardoor de evaluatie van de frequentie van de lever kolonisatie en groeikinetiek van uitzaaiingen. Omdat het model lijkt op klinisch waargenomen levermetastasen, kan het dienen als een modaliteit voor het detecteren van genen geassocieerd met levermetastasen en voor het testen van potentiële ablatieve of adjuvante therapieën voor lever metastasen.

Het doel van dit experiment was om een consistente en reproduceerbaar diermodel met het potentieel voor de seriële kwantificering van de in vivo metastatische tumorlast en voor de bepaling van de kolonisatie frequentie en groeikinetiek ontwikkelen levermetastasen. Figuren 2-6, met legendes, zijn voorzien van onze vorige publicatie onder een Creative Commons CC-BY-licentie 10. Generatie van Dou...

Het vermogen van metastaserende klonen om verre locaties te koloniseren, hangt af van hun proliferatievermogen en/of hun vermogen om te overleven in de micro-omgeving van de gastheer zonder significante proliferatie. Hier presenteren we een diermodel dat kwantitatieve visualisatie van beide typen leverkolonisatie door metastaserende klonen mogelijk maakt.

Geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: Imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Het algemene doel van deze benadering is om leverkolonisatie door metastatische tumorclonen gegenereerd door colorectale kankers te modelleren, en dit model te gebruiken om de diagnostiek en therapie van levermetastasen te verbeteren. Klinische observaties wijzen op de heterogeniteit van metastatische ziekten. Ons model biedt de mogelijkheid om deze heterogeniteit vast te leggen om genen te detecteren die geassocieerd zijn met oligometastatische en polymetastatische ziekten.En om deze kennis te gebruiken voor de verbetering van de vroegtijdige detectie en behandeling van metastasen. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat we dubbel gelabelde monoklonale cellijnen gebruiken, afkomstig van patiënten met colorectaal carcinoom, en de ontwikkeling van levermetastasen zowel in vivo als ex vivo kunnen observeren. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van metastatische ziekten.Dit stelt ons in staat om elk potentieel geneesmiddel te testen met een kwantitatieve schatting van het aantal metastatische laesies en de groeikinetiek van elke laesie. Na het genereren van luciferase tdTomato-gelabelde HCT116-cellen en het voorbereiden van media, reagentia en instrumenten volgens het tekstprotocol, worden de getransfecteerde cellen in triplikaat in 96-wells platen gezaaid bij de volgende dichtheden per well. Na een incubatie van de cellen gedurende vijf uur wordt de tdTomato-fluorescentie-intensiteit gekwantificeerd met behulp van een IVIS-systeem door de beeldverwerkingssoftware op de desktop op te starten.Klik op de knop Initialize om de beeldvormingstijd, medium binning, twee voor F/Stop, 535 voor het excitatiefilter en 580 voor het emissiefilter te initialiseren. Plaats de 96-wells plaat op het imagingstation en klik op Acquire om te starten met het maken van beelden. Nadat het beeld is verkregen, klikt u in het Tool Palette op ROI tools en selecteert u 12x8 via het slit-icoon.Maak 12x8 slits om het gebied van het signaal op de afbeelding van de 96-wells plaat te bedekken en klik op het tabblad Measurements. Er verschijnt een venster met de tabel van ROI-metingen met eenheden in fotonen per seconde, per steradiaan, per vierkante centimeter. Zodra de cellen een confluentie van 70 tot 80 procent bereiken, ongeveer één uur voor de miltinjectie, voegt u 0,05 procent tripsine en 0,53 millimol EDTA toe aan de cellen om deze te dissociëren.Na het incuberen van de cellen gedurende drie tot vijf minuten, wordt een gelijk volume C-DMEM gebruikt om de tripsine te neutraliseren. Pipetteer de culturen grondig om klontering te voorkomen en tel de cellen vervolgens met een automatische celteller. Vries de gesuspendeerde cellen in 1x DBPS in bij een concentratie van 1,2 tot 2 x 10^6 cellen per 100 µL, waarbij grondig wordt gepipetteerd om klontering te voorkomen.Houd de cellen vervolgens op ijs tot aan de injectie en resuspendeer ze af en toe in de buis. Nadat analgetica zijn toegediend en een zes tot acht weken oude vrouwelijke athymische naaktmuis is geanestheseerd volgens het tekstprotocol, identificeert u de milt als een paars gebied dat extern door de huid op de linkerflank zichtbaar is, en maakt u een incisie van acht millimeter in de huid op de linkerflank net boven het orgaan. Til vervolgens de buikwand op en maak een kleine incisie.Laat lucht de buikholte binnendringen zodat de interne organen zich van de incisieplaats verwijderen. Vergroot vervolgens de incisie in de buikwand tot ongeveer vijf millimeter. De gedemonstreerde stappen voor de injectie zijn essentieel voor de procedure.Lekkage van tumorcellen tijdens de injectie kan leiden tot extrahepatische metastasen. De injectie moet langzaam worden uitgevoerd, gedurende 30 tot 60 seconden, met maximaal 1,5 miljoen cellen om portaaladertrombose te voorkomen. Leg de milt bloot door met een wattenstaafje voorzichtig druk uit te oefenen rond de incisie.Indien nodig kan het pancreasvet voorzichtig worden verschoven om de blootstelling te vergemakkelijken, zodat de milt niet wordt beschadigd. Injecteer, met behulp van een spuit van één milliliter met een naald van 27-gauge, gedurende een periode van 30 tot 60 seconden 100 µL cellen in de punt van de blootgelegde milt. Plaats aan het einde van de injectie, voorafgaand aan het verwijderen van de naald, een micro-clip op de milt om lekkage van de geïnjecteerde celsuspensie te voorkomen, en laat deze vijf minuten op zijn plaats zitten.Vijf minuten na de injectie wordt een handmatige cauterisatie-eenheid gebruikt om een splenectomie uit te voeren voor hemodynamische stabilisatie. Begin bij de milt hilus aan de anterieure zijde door de proximale zijde van de vaten samen met het aangrenzende vetweefsel voor te coaguleren. Er kan bloeding uit de milt optreden op de injectieplaats.De micro-clip wordt op de milt aangebracht om lekkage van tumorcellen te voorkomen en miltbloedingen te beheersen. Methoden voor hemostase kunnen cauterisatie omvatten, het gedurende drie tot vijf minuten uitoefenen van druk en, indien nodig, ligatie met hechtdraad. Sluit de bukwand met een resorbeerbare gevlochten hechtdraad van 5.0 en een enkele horizontale steek.Sluit vervolgens de huid met een 4.0 niet-absorbeerbare monofilament hechtdraad, eveneens met een enkele horizontale steek. Monitor het dier postoperatief volgens het tekstprotocol. Voor het uitvoeren van bioluminescent imaging worden de muizen geanestheseerd volgens het tekstprotocol, waarna 150 µL van de eerder bereide vuurvlieg-luciferine intraperitoneaal in de dieren wordt geïnjecteerd.Plaats de muizen in een IVIS in rugligging, met tussenstukjes tussen de dieren om het signaal naar aangrenzende muizen te minimaliseren. Drie minuten na de injectie van luciferine, nadat de IVIS is geïnitialiseerd, selecteert u luminescentie, een belichtingstijd van één seconde en medium binning. Klik op de knop Acquire om te starten met beeldvorming, waarbij u ervoor zorgt dat de beeldvorming consistent drie minuten na de luciferine-injectie wordt uitgevoerd.Nadat het beeld is verkregen en het beeldvenster en het toolpalet verschijnen, klikt u op ROI-tools en selecteert u een getal van één tot vijf uit het cirkelpictogram dat overeenkomt met het aantal gefotografeerde muizen. Om ROI's te definiëren, omcirkelt u het gebied van het luminescente signaal op de buikholte van de muis en klikt u vervolgens op metingen van de ROI als een arbitraire eenheid van radiantie. Voeg een extra ROI-cirkel toe voor de achtergrond.Vier weken na de injectie, om diffuse luminescente beeldvormingstomografie, of DLIT, uit te voeren, selecteert u na het initialiseren van de IVIS Imaging Wizard, Bioluminescence, en klikt u op Next. Selecteer DLIT en klik op Next. Selecteer Firefly Probes en klik op Next.Selecteer Mouse voor Image Subject, Auto voor Exposure Parameter C-13 Centimeter voor Field of View, en 0,5 Centimeter als Subject Type, en klik op Next. Klik vervolgens op de Acquire-knop om te beginnen met het maken van beelden. Selecteer na het verkrijgen van een beeld het tabblad DLIT 3D Reconstruction onder het tabblad Analyze, en klik op Reconstruct om de 3D-reconstructieafbeelding te genereren.Klik op Tools en 3D Animation. Selecteer vervolgens in het venster 3D Animation de optie Spin CCW on Y-Axis. Klik op Record and Save om het bestand op te slaan als een mov-bestand.Om ex vivo fluorescentie-imaging uit te voeren, meet u na het oogsten en dissekeren van de levers van de muizen volgens het tekstprotocol de fluorescentie-intensiteiten voor elke tumorkolonie met behulp van de IVIS. Selecteer Fluorescence, een Exposure Time van vier seconden, Medium Binning, 2 voor F/Stop, 535 voor het excitatiefilter en 580 voor het emissiefilter. Klik op de Acquire-knop om te beginnen met het maken van de beelden.Nadat de afbeelding is verkregen, lokaliseert u het venster 'Image' in het Tool Palette. Klik op ROI Tools en selecteer 1 bij het cirkelicoon. Om ROI's te definiëren, omcirkelt u het signaalgebied van individuele tumorkolonies op de afbeelding.Selecteer een extra ROI-cirkel van de achtergrond en klik vervolgens op Measurements van de ROI als een arbitraire eenheid van radiantie. Selecteer nogmaals een extra ROI-cirkel van de achtergrond. Voer tot slot de berekeningen uit volgens het tekstprotocol.Zoals hier wordt aangetoond via bioluminescentie, hadden HCT116 L2T-klonen P1 en P2 drie weken na miltinjectie een grotere tumorlast in vergelijking met klonen O1 en O2. Deze gegevens gaven aan dat klonen O1 en O2 oligometastatische ziekte kunnen nabootsen, terwijl P1 en P2 een agressieve, wijdverspreide metastatische kolonisatie van de lever vertegenwoordigen. De kwantificering van de ex vivo fluorescentie van de lever, vier weken na miltinjectie, bevestigde dat P1 en P2 hogere fluorescentie-intensiteiten hadden in vergelijking met de levers van O1 en O2. Fluorescente labeling van tumorclonen maakte het mogelijk het aantal en de grootte van individuele metastatische kolonies in de lever te identificeren.Over het geheel genomen waren de ex vivo fluorescentiebeelden consistent met de macroscopische bevindingen, maar kleine kolonies die onder het oppervlak verborgen waren, werden beter gedetecteerd met fluorescentie-imaging. Zoals hier is weergegeven, werden de aantallen en grootten van de metastatische kolonies in elke lever geteld en gemeten, en werd voor elke monokloon ex vivo fluorescentie-imaging uitgevoerd op elke metastatische kolonie. Zoals in deze grafieken is te zien, was het totaal aantal metastasen in P1 hoger vergeleken met P2, O1 en O2, terwijl de gemiddelde grootte van individuele kolonies groter was in P2 dan in P1, O1 en O2. Ons model biedt een benadering voor het identificeren van nieuwe persuasiegenen die geassocieerd zijn met de moleculaire heterogeniteit van metastasering.Deze genen kunnen worden gebruikt als doelwitten voor nieuwe benaderingen voor de behandeling van metastasen. Ons model kan ook worden gebruikt voor de validatie van verschillende coderende en niet-coderende eiwitgenen die voortvloeien uit huidige grote klinische databases, maar waarvan de functie in de context van metastatische ziekten nog niet is gedefinieerd. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de delicate aard van de chirurgische ingreep bij het dier.Met oefening zijn echter goede resultaten in korte tijd haalbaar. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de richtlijnen voor dierchirurgie te volgen, bloedingen zorgvuldig te beheersen en lekkage van de tumorcelсусpensie te voorkomen.

advanced-animal-model-colorectal-metastasis-liver-imaging-techniques

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Twee technieken kunnen worden gebruikt om dit model te stellen: injectie van een kankercel suspensie in de blindedarmkeutels muur of transplantatie van een stukje van subcutane tumor op de blindedarm. Dit model is handig voor het bestuderen van de natuurlijke progressie van colorectale kanker en testen van nieuwe therapeutische middelen tegen colorectale kanker.

Orthotope Muis Model van colorectale kanker

Dit artikel beschrijft een procedure voor de inductie van orthotope bioluminescente levertumoren bij muizen, en daaropvolgende analyse van groei van de tumor beperkt tot de lever met behulp van live-hele lichaam luminescentie beeldvorming.

Murine Bioluminescent Lever Tumor Model

Diermodellen worden vaak gebruikt om uitzaaiing studeren bot. In dit protocol beschrijven we twee gebruikelijke methoden van tumorinoculatie voor bot metastase studies en beschrijf kort enkele van de analyses gebruikt om toezicht te houden en te kwantificeren deze modellen.

Modellen van bot metastase

This video describes the protocol to establish a spontaneous metastasis mouse model of colorectal cancer patient-derived xenografts or PDXs. These xenograft models partially mimic the features of human carcinomas and understand the critical aspects of human malignancies, including invasion and metastasis.

Spontaneous Metastasis Mouse Models: A Platform to Study the Metastatic Potential of Orthotopically Injected Colorectal Cancer Cells

Een preklinische, muizenmodel van levermetastasen uitgevoerd via een hemispleen injectietechniek.

Een preklinisch muizenmodel van levermetastasen

Er werd een chirurgische procedure ontwikkeld om mamma-tumorcellen via injectie in de poortader in de muizenlever af te leveren. Dit model maakt onderzoek naar late stadia van levermetastase mogelijk bij een volledig immuuncompetente gastheer, inclusief extravasatie van tumorcellen, zaaien, overleven en metastatische uitgroei in de lever.

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

We beschrijven de oprichting van orthotopische colorectale tumoren via injectie van tumorcellen of organoïden in de cecum van muizen en de daaropvolgende isolatie van circulerende tumorcellen (CTC's) uit dit model.

Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker

Dit protocol beschrijft de generatie van door patiënten afgeleide orthotopic xenotransplantaatmodellen is-modellen door intra-vesisch bijbrengen van hoogwaardige urotheelcelcarcinoom cellen of intra-rectale injectie van colorectale kankercellen in niet-zwaarlijvige diabetische/ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD/SCID) muizen voor primaire tumorgroei en spontane metastasen onder invloed van lymfeklier stromale cellen, die de progressie van humane gemetastaseerde ziekten nabootst.

Patiënt-afgeleide Orthotopic xenograft modellen voor humaan Urotheelcelcarcinoom en colorectale kanker tumor groei en spontane metastasen

We beschrijven in detail een klinisch relevante colorectale kanker Levermetastasen (CRLM) tumor model en de invloed van lever ischemie reperfusie (I/R) in tumorgroei en metastase. Dit model kan helpen om beter te begrijpen van de mechanismen onderliggende chirurgie-geïnduceerde bevordering van de lever metastatische groei.

Murine model van gemetastaseerde lever tumoren in de setting van ischemie reperfusie letsel

De beschreven aanpak combineert experimentele staart ader metastase assays met in vivo levende dierlijke beeldvorming zodat real-time monitoring van borstkanker metastase vorming en groei in aanvulling op de kwantificering van metastasen aantal en grootte in de longen.

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Portale ader injectie van colorectale kanker (CRC) organoïden genereert stroma-rijke levermetastase. Dit muismodel van CRC-levermetastase vertegenwoordigt een nuttig hulpmiddel om tumor-stroma-interacties te bestuderen en nieuwe stroma-gerichte therapieën te ontwikkelen, zoals adeno-geassocieerde virus-gemedieerde gentherapieën.

Portale ader injectie van colorectale kanker organoïden om de levermetastase stroma te bestuderen

Leer een geavanceerd diermodel voor leverkolonisatie door metastatische tumorclonen uit colorectale kanker. Deze methode maakt kwantitatieve visualisatie en identificatie van genen mogelijk voor verbeterde diagnostiek en therapie.

Geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: Imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde Clones

Meer video's verkennen